Här presenterar vi ett optimerat protokoll för att snabbt och semiquantitativt mäta ligandreceptorinteraktioner i trans i ett heterologt cellsystem med fluorescensmikroskopi.
Proteininteraktioner vid cellulära gränssnitt dikterar en mängd biologiska resultat som sträcker sig från vävnadsutveckling och cancerprogression till synapsbildning och underhåll. Många av dessa grundläggande interaktioner förekommer i trans och induceras vanligtvis av heterofila eller homofila interaktioner mellan celler som uttrycker membranankare bindande par. Att belysa hur sjukdomsrelevanta mutationer stör dessa grundläggande proteininteraktioner kan ge insikt i en myriad av cellbiologiska fält. Många protein-protein interaktion analyser är vanligtvis inte disambiguate mellan CIS och trans interaktioner, vilket potentiellt leder till en överskattning av omfattningen av bindning som förekommer in vivo och innebär arbetsintensiv rening av protein och/eller specialiserad övervakningsutrustning. Här presenterar vi ett optimerat enkelt protokoll som möjliggör observation och kvantifiering av endast transinteraktioner utan behov av långa proteinreningar eller specialiserad utrustning. HEK-cellaggregationsanalysen innebär blandning av två oberoende populationer av HEK-celler, som var och en uttrycker membranbundna konjaksligands. Efter en kort inkubationsperiod avbildas proverna och de resulterande aggregaten kvantifieras.
Synaptiska interaktioner som underlättas av synaptiska vidhäftningsmolekyler är grundläggande för utveckling, organisation, specifikation, underhåll och funktion av synapser och generering av neurala nätverk. Identifieringen av dessa transsynaptiska cell vidhäftningsmolekyler ökar snabbt; Därför är det fundamentalt viktigt att identifiera bindande partners och förstå hur dessa nya vidhäftningsmolekyler interagerar med varandra. Dessutom har genomsekvensering identifierat mutationer i många av dessa vidhäftningsmolekyler som ofta är kopplade till en mängd neurodevelopmental, neuropsykiatriska och beroendestörningar1. Mutationer i gener som kodar för synaptiska cell-vidhäftningsmolekyler kan skadligt förändra transinteraktioner och kan bidra till patofysiologiska förändringar i synapsbildning och eller underhåll.
Det finns flera analyser för att kvantitativt bedöma proteinproteininteraktioner som isotermisk kalorimetri, cirkulär diktroism, ytplasmonresonans2 och även om de är kvantitativa till sin natur har de flera begränsningar. För det första kräver de rekombinant protein, ibland kräver långa och tråkiga reningssteg. För det andra kräver de sofistikerad specialiserad utrustning och teknisk expertis. För det tredje kan de överskatta omfattningen av bindningen eftersom de möjliggör både cis och transinteraktioner mellan proteiner som naturligt är bundna till ett membran in vivo. Här föreslår vi en enkel och relativt snabb analys som uteslutande testar transinteraktioner.
För att kringgå många av de komplikationer som är förknippade med renade proteinanalyser har vi optimerat en cellbaserad proteininteraktionsanalys som rekapitulerar transinteraktioner i ett reducerat heterologt cellsystem. Denna analys har tidigare använts i olika former för att studera transcellulära interaktioner. I detta tillvägagångssätt transfecteras kandidatcells vidhäftningsmolekyler till HEK293T-celler. Vid fysiologiska förhållanden uppvisar HEK293T-celler inte självaggregering, vilket gör dem exemplariska modeller för denna analys. Men när enskilda populationer av HEK-celler som uttrycker receptor och ligand kombineras, tvingar bindningen av receptorn och ligand aggregering av HEK-celler att uppstå. Denna aggregering förmedlas uteslutande av transinteraktioner och kan vanligtvis observeras på tiotals minuter. Inga proteinreningssteg krävs i denna metod, och metodens effektivitet bygger på paradigmet att populationer av HEK-celler som uttrycker konjaks vidhäftningsmolekyler kombineras och sedan avbildas bara tiotals minuter senare. Dessutom är denna metod relativt billig, eftersom varken antikroppar eller dyr utrustning krävs. Den enda utrustning som krävs för att insamlar data är ett standard fluorescerande mikroskop. En ytterligare fördel med denna cellbaserade analys är förmågan att snabbt screena effekten av sjukdomsrelevanta punktmutationer på transinteraktioner. Detta kan utföras genom att transfectera HEK-celler med cDNAs av mutantvarianterna av proteinet av intresse.
I detta protokoll presenterar vi ett exempel där vi undersöker om en missense mutation i Neurexin3α (Neurexin3αA687T),identifieras hos en patient diagnostiseras med djupgående intellektuell funktionsnedsättning och epilepsi, förändrar interaktioner i trans med leucin-rika upprepa transmembran protein 2 (LRRTM2). Neurexin3α är en medlem av den evolutionärt bevarade familjen av presynaptiska cell-vidhäftningsmolekyler och medan det senaste arbetet har identifierat flera roller vid synapsen 3,4,5,6,7, är vår synaptiska förståelse av dennamolekyloch alla medlemmar av neurexinfamiljen fortfarande ofullständig. LRRTM2 är ett excitatoriskt postsynaptiskt cell vidhäftningsprotein som deltar i synapsbildning och underhåll8,9,10. Viktigt är att LRRTM2 uteslutande interagerar med neurexinisoformer som saknar skarvstället 4 alternativ exon (SS4-) men inte med neurexinisoformer som innehåller skarvstället 4 alternativ exon (SS4+). Den mänskliga missense mutationen (A687T) identifieras i Neurexin3α ligger i en ostudied extracellulär region som är evolutionärt bevarad och bevaras mellan alla alfa neurexiner7. Eftersom interaktionen mellan dessa två molekyler har fastställts8,9,11, ställde vi frågan: är bindningsförmågan hos Neurexin3α SS4- till LRRTM2 förändrad av en A687T punktmutation? Denna analys visade att A687T punkt mutation oväntat förbättrat aggregering av Neurexin3α till LRRTM2 tyder på att regionen extracellulära där punkt mutationen ligger, spelar en roll i medla transsynaptic interaktioner.
Dissekering av de proteinproteininteraktioner som förekommer i trans under cellens vidhäftning kan leda till en bättre förståelse för de molekylära mekanismer som ligger till grund för grundläggande cellulära processer, inklusive bildandet, funktionen och underhållet av synapser under mognad och ombyggnad. Konsekvenserna av cell-till-cell interaktioner expanderar bortom neurobiologi och har bredare roller i signaltransduktion, cellmigration och vävnadsutveckling14. Avvikelser i cell vi…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Grants from the National Institute of Mental Health (R00MH103531 och R01MH116901 till J.A.), ett predoctoral training Grant från National Institute of General Medicine (T32GM007635 till S.R.) och ett Lyda Hill Gilliam Fellowship for Advanced Study (GT11021 till S.R.). Vi tackar Dr. Kevin Woolfrey för hjälp med mikroskopet, Dr. K Ulrich Bayer för användningen av hans epifluorescerande mikroskop och Thomas Südhof (Stanford University) för LRRTM2-plasmiden.
1.5 mL disposable microtubes with snap caps | VWR | 89000-028 | Incubation of mixed population of HEK cells |
1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane | Thermo Fisher | 567-0020 | Sterilization of HEK media |
15 mL SpectraTube centrifuge tubes | Ward’s Science | 470224-998 | Harvesting HEK cells |
6 well sterile tissue culture plates | VWR | 100062-892 | culturing HEK cells |
Calcium Chloride | Sigma | 223506-500G | Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension |
Centrifuge- Sorvall Legend RT | Kendro Laboratory Products | 75004377 | Harvesting HEK cells |
CO2 cell incubator | Thermo Scientific | HERACELL 150i | Incubation of HEK cells during growth |
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | HEK cell maintenance |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) | Gibco | 14190-144 | Passaging/harvesting HEK cell |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | ED-500G | Harvesting HEK cells |
Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area | Corning | 9381M26 | Culturing HEK cells |
Fetal Bovine Serum | Sigma | 17L184 | HEK cell maintenance |
HEK293T cells | ATCC | Model system | |
ImageJ | NIH | V: 2.0.0-rc-69/1.52p | Image analysis |
Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272-500G | HEK cell resuspension |
Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher BioReagents | BP332-500 | Calcium phosphate transfection |
Trypsin 0.25% (1X) Solution | GE Healthcare Life Sciences | SH30042.01 | Passaging HEK cells |
Tube rotator | Incubation of mixed population of HEK cells | ||
UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged | Denville Scientific Inc. | M1021 | Image acquisition |
Wide-field microscope | Zeiss | Axio Vert 200M | Image acquisition |