이종 세포 시스템에서 단백질 응집을 통한 세포 간 상호 작용 측정
Summary
여기서, 우리는 형광 현미경을 사용하여 이종 세포 시스템에서 트랜스에서 리간드 수용체 상호 작용을 신속하고 반정적으로 측정하는 최적화된 프로토콜을 제시한다.
Abstract
세포 인터페이스에서 단백질 상호 작용은 조직 발달과 암 진행에서 시냅스 형성 및 유지 보수에 이르기까지 다양한 생물학적 결과를 지시합니다. 이러한 근본적인 상호 작용의 대부분은 트랜스에서 발생하고 일반적으로 막 고정 결합 쌍을 표현하는 세포 사이의 이기성 또는 동종 작용에 의해 유도된다. 질병 관련 돌연변이가 어떻게 이러한 근본적인 단백질 상호 작용을 방해하는지 설명하면 무수한 세포 생물학 분야에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 많은 단백질 단백질 상호 작용 소법은 전형적으로 시스와 트랜스 상호 작용 사이에 비약적이지 않으며, 이는 잠재적으로 생체 내에서 발생하는 결합의 정도의 과대 평가로 이어지고 단백질 및 /또는 전문 모니터링 장비의 노동 집약적 정제를 포함합니다. 여기서, 우리는 긴 단백질 정제 또는 특수 장비없이 트랜스 상호 작용의 관찰 및 정량화를 허용하는 최적화 된 간단한 프로토콜을 제시한다. HEK 세포 집계 분석법은 HEK 세포의 2개의 독립적인 인구의 혼합을 관련시킵니다, 각각 막 결합 된 cognate 리간드를 표현합니다. 짧은 잠복기 후에 는 샘플이 이미지화되고 결과 골재가 정량화됩니다.
Introduction
시냅스 접착 분자에 의해 촉진되는 시냅스 상호 작용은 시냅스의 개발, 조직, 사양, 유지 보수 및 기능 및 신경망 의 생성을 위한 기초입니다. 이러한 신혈 세포 접착 분자의 식별은 급속히 증가하고 있습니다. 따라서, 결합 파트너를 식별하고 이러한 새로운 접착 분자가 서로 상호 작용하는 방법을 이해하는 것이 근본적으로 중요합니다. 추가적으로, 게놈 순서는 일반적으로 신경 발달, 신경 정신병및 중독무질서1의 다수에 연결되는 이 접착 분자의 많은에서 돌연변이를 확인했습니다. 시냅스 세포 접착 분자에 대 한 코드 유전자에 돌연변이 는 해로운 트랜스 상호 작용을 변경 하 고 시 냅 스 형성 및 유지 보수에 병 리 학적 변경에 기여할 수 있습니다.
여러 분석법은 이소성 열량, 원형 이윤술, 표면 플라스몬 공명2와 같은 단백질 단백질 상호 작용을 정량적으로 평가하기 위해 존재하며 자연에서 정량적이지만 몇 가지 한계가 있습니다. 첫째, 그들은 재조합 단백질을 필요로, 때로는 길고 지루한 정제 단계를 요구. 둘째, 정교한 특수 장비와 기술 전문 지식이 필요합니다. 셋째, 생체 내 막에 자연적으로 테더드되는 단백질 간의 시스 및 트랜스 상호 작용을 모두 허용하므로 결합의 정도를 과대 평가할 수 있습니다. 여기에서 우리는 트랜스 상호 작용을 독점적으로 테스트하는 간단하고 비교적 빠른 분석서를 제안합니다.
정제된 단백질 분석과 관련된 많은 합병증을 우회하기 위해, 우리는 감소된 이종 세포 시스템에서 트랜스 상호 작용을 재구성하는 세포 기지를 둔 단백질 상호 작용 분석서를 최적화했습니다. 이 분석은 이전에 세포 간 상호 작용을 연구하기 위해 다양한 형태로 사용되었습니다. 이 접근법에서, 후보 세포 접착 분자는 HEK293T 세포로 전형된다. 생리학적 조건에서 HEK293T 세포는 자가 응집을 나타내지 않아 이 분석에 대한 모범적인 모델을 만듭니다. 그러나, 수용체와 리간드를 발현하는 HEK 세포의 개별 집단이 결합될 때, 수용체의 결합과 HEK 세포의 리간드 힘 응집이 발생한다. 이 집계는 트랜스 상호 작용에 의해 독점적으로 중재되며 일반적으로 수십 분 안에 관찰 할 수 있습니다. 이 방법에서는 단백질 정화 단계가 필요하지 않으며, 이 방법의 효율은 cognate 접착 분자를 발현하는 HEK 세포의 인구가 결합되고 수십 분 후에 만 이미지되는 패러다임에 의존한다. 또한, 이 방법은 항체나 비용이 많이 드는 장비가 필요하지 않습니다. 데이터 수집에 필요한 유일한 장비는 표준 형광 현미경입니다. 이 세포 기지를 둔 분석기의 추가 이점은 트랜스 상호 작용에 질병 관련 점 돌연변이의 효력을 빨리 검열하는 기능입니다. 이는 관심 있는 단백질의 돌연변이 변이체의 cDNA를 가진 HEK 세포를 배분하여 수행될 수 있다.
이 프로토콜에서, 우리는 우리가 심각한 지적 장애 및 간질로 진단된 환자에서 확인된 Neurexin3α (Neurexin3αA687T)에있는 잘못된 감각 돌연변이가, 류신이 풍부한 반복 막 단백질 2 (LRRTM2)와 트랜스에서 상호 작용을 변경하는지 여부를 조사하는 예를 제시합니다. Neurexin3α는 사전 시냅스 세포 접착 분자의 진화적으로 보존된 가족의 일원이며, 최근 연구는 시냅스3,4,5,6,7,이 분자및 뉴렉신 가족의 모든 구성원에 대한 당사의 시냅스 이해에서 여러 역할을 확인했지만 불완전하다. LRRTM2는 시냅스 형성 및 유지 보수8,9,10에참여하는 흥분포스트 냅틱 세포 접착 단백질이다. 중요 한 것은, LRRTM2 독점적으로 스플라이스 사이트 4 대체 엑슨 (SS4-) 부족 하지만 스플라이스 사이트 4 대체 엑슨을 포함 하는 뉴렉신 등소와 상호 작용 4 대체 엑슨 (SS4+). Neurexin3α에서 확인된 인간 잘못된 감각 돌연변이(A687T)는 진화적으로 보존되고 모든 알파 뉴렉신7사이에 보존되는 연구되지 않은 세포외 지역에 위치한다. 이 두 분자 간의 상호 작용이 확립됨에 따라8,9,11,우리는 질문을 제기 : Neurexin3α SS4- LRRTM2의 결합 능력은 A687T 포인트 돌연변이에 의해 변경? 이 분석서에 따르면 A687T 점 돌연변이는 예기치 않게 Neurexin3α에서 LRRTM2로의 응집을 강화하여 점 돌연변이가 있는 세포외 영역이 신내 상호 작용을 중재하는 역할을 한다는 것을 시사합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세포 접착 중에 트랜스에서 발생하는 단백질 단백질 상호 작용을 해부하면 성숙 및 리모델링 중에 시냅스의 형성, 기능 및 유지 관리를 포함한 기본 세포 과정의 근본적인 분자 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다. 세포 대 세포 상호 작용의 의미는 신경 생물학을 넘어 확장하고 신호 전달, 세포 이동 및 조직 발달에 있는 더 넓은 역할을14. 세포 유착의 수차는 적절한 세포 기능…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 정신 건강 연구소 (R00MH103531 및 R01MH1116901 에서 J.A.), 국립 일반 의학 연구소 (T32GM0007635에서 S.R.R.)의 박사 전 교육 보조금, 고급 연구를위한 리다 힐리엄 펠로우십 (GT1101.R.1)의 보조금에 의해 지원되었습니다. 우리는 현미경에 도움을 케빈 울프리 박사, 그의 전형 현미경의 사용에 대한 박사 K 울리히 바이엘, 그리고 토마스 수호프 (스탠포드 대학) LRRTM2 플라스미드에 대한 도움을 감사드립니다.
Materials
| 1.5 mL disposable microtubes with snap caps | VWR | 89000-028 | Incubation of mixed population of HEK cells |
| 1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane | Thermo Fisher | 567-0020 | Sterilization of HEK media |
| 15 mL SpectraTube centrifuge tubes | Ward’s Science | 470224-998 | Harvesting HEK cells |
| 6 well sterile tissue culture plates | VWR | 100062-892 | culturing HEK cells |
| Calcium Chloride | Sigma | 223506-500G | Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension |
| Centrifuge- Sorvall Legend RT | Kendro Laboratory Products | 75004377 | Harvesting HEK cells |
| CO2 cell incubator | Thermo Scientific | HERACELL 150i | Incubation of HEK cells during growth |
| DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | HEK cell maintenance |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) | Gibco | 14190-144 | Passaging/harvesting HEK cell |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | ED-500G | Harvesting HEK cells |
| Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area | Corning | 9381M26 | Culturing HEK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 17L184 | HEK cell maintenance |
| HEK293T cells | ATCC | Model system | |
| ImageJ | NIH | V: 2.0.0-rc-69/1.52p | Image analysis |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272-500G | HEK cell resuspension |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher BioReagents | BP332-500 | Calcium phosphate transfection |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | GE Healthcare Life Sciences | SH30042.01 | Passaging HEK cells |
| Tube rotator | Incubation of mixed population of HEK cells | ||
| UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged | Denville Scientific Inc. | M1021 | Image acquisition |
| Wide-field microscope | Zeiss | Axio Vert 200M | Image acquisition |
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