Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

التحليل المرضي لنقائل الرئة بعد الحقن الجانبي الوريد الذيل من الخلايا السرطانية

Published: May 20, 2020 doi: 10.3791/61270
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center, 2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

ERRATUM NOTICE

Summary

غالبا ما يستخدم الحقن الوريدي للخلايا السرطانية في أبحاث الانبثاث ، ولكن عبء الورم النقيلي قد يكون من الصعب تحليله. هنا، ونحن نظهر نموذج حقن ذيل الوريد من الانبثاث وتشمل نهجا جديدا لتحليل عبء ورم الرئة النقيلي الناتجة.

Abstract

الانبثاث، السبب الرئيسي للمراضة والوفيات بالنسبة لمعظم مرضى السرطان، يمكن أن يكون تحديا لنموذج قبل السريرية في الفئران. تتوفر نماذج قليلة من الانبثاث التلقائي. وبالتالي ، فإن نموذج الانبثاث التجريبي الذي ينطوي على حقن الوريد الخلفي لخطوط الخلايا المناسبة هو الدعامة الأساسية لأبحاث الانبثاث. عندما يتم حقن الخلايا السرطانية في الوريد الذيل الجانبي ، فإن الرئة هي موقعها المفضل للاستعمار. أحد القيود المحتملة لهذه التقنية هو التحديد الكمي الدقيق لعبء ورم الرئة النقيلي. في حين أن بعض المحققين عد macrometastases من حجم محدد مسبقا و / أو تشمل micrometastases بعد تقسيم الأنسجة، والبعض الآخر تحديد منطقة الآفات النقيلي بالنسبة لمنطقة الأنسجة العادية. كل من هذه الطرق الكمي يمكن أن تكون صعبة للغاية عندما يكون العبء النقيلي عالية. هنا، ونحن نظهر نموذج حقن الوريد من الانبثاث الرئة تليها طريقة متقدمة لقياس عبء الورم النقيلي باستخدام برنامج تحليل الصورة. تسمح هذه العملية بالتحقيق في معلمات متعددة لنقطة النهاية ، بما في ذلك متوسط حجم الانبثاث ، والعدد الإجمالي للنقائل ، وإجمالي منطقة الانبثاث ، لتوفير تحليل شامل. وعلاوة على ذلك، تم استعراض هذه الطريقة من قبل مجلس الأمراض البيطرية معتمدة من قبل الكلية الأمريكية لأخصائيي الأمراض البيطرية (SEK) لضمان الدقة.

Introduction

على الرغم من كونه عملية معقدة للغاية وغير فعالة1 ، فإن الانبثاث هو مساهم كبير في مراضة ووفيات مرضى السرطان2. وفي الواقع، تعزى معظم الوفيات المرتبطة بالسرطان إلى الانتشار النقيلي للمرض 3،4. من أجل أن تنتشر الخلايا السرطانية بنجاح ، يجب أن تنفصل عن الموقع الأساسي ، وتغزو من خلال ستروما المجاورة ، وتتغلغل في الدورة الدموية أو اللمفاويات ، والسفر إلى السرير الشعري لموقع ثانوي ، والبذخ في الأنسجة الثانوية ، وتتكاثر أو تنمو لتشكيل الآفات النقيلية5. وكان استخدام نماذج الماوس حاسما لتعزيز فهم الآليات الجزيئية المسؤولة عن البذر النقيلي والنمو6،7. هنا، ونحن نركز على الانبثاث سرطان الثدي، والتي غالبا ما تستخدم نماذج الماوس المعدلة وراثيا، فضلا عن أساليب زرع - كل مع مجموعة خاصة بهم من المزايا والقيود.

نماذج الورم الثديي المعدلة وراثيا الاستفادة من المروجين الغدة الثديية محددة، بما في ذلك MMTV-LTR (الماوس فيروس الورم الثديي تكرار محطة طويلة) وWAP (بروتين مصل اللبن الحمضية)، لدفع التعبير عن المتحولين جنسيا في ظهارة الثديي8. وقد تم التعبير عن الأورام المتجانسة بما في ذلك مستضد بوليوما تي الأوسط (PyMT) ، ErbB2 / Neu ، c-Myc ، Wnt-1 ، وفيروس سيميان 40 (SV40) بهذه الطريقة9،10،11،12،13 ، وبينما هذه النماذج الوراثية مفيدة لدراسة بدء الورم الأولي وتطوره ، إلا أن القليل منها ينتشر بسهولة إلى الأعضاء البعيدة. وعلاوة على ذلك، فإن نماذج الماوس الوراثية هذه غالبا ما تكون أكثر تكلفة والوقت باهظة من نماذج الانبثاث التلقائي أو التجريبي. نظرا للحد من معظم نماذج الأورام الثديية المعدلة وراثيا لدراسة الانبثاث ، أصبحت تقنيات الزرع طرقا جذابة لدراسة هذه العملية المعقدة. وهذا يشمل orthotopic, ذيل الوريد, داخل القلب, وحقن داخل الجمجمة من خطوط الخلايا المناسبة.

على الرغم من أن العديد من خطوط خلايا سرطان الثدي تنتشر بسهولة بعد الحقن التقويمي في وسادة الدهون الثديية14,15 ، فإن اتساق واستنساخ عبء الورم النقيلي يمكن أن يكون تحديا ، ويمكن أن تكون مدة هذه الدراسات على مدار عدة أشهر. لتقييم الانبثاث الرئوي، على وجه الخصوص، الحقن الوريدي في الوريد الذيل غالبا ما يكون طريقة أكثر استنساخا وفعالة من حيث الوقت مع انتشار النقيلي التي تحدث عادة في غضون بضعة أسابيع. ومع ذلك ، بما أن نموذج الحقن الوريدي يتجاوز الخطوات الأولية لسلسلة النقيلي ، يجب توخي الحذر في تفسير نتائج هذه الدراسات. في هذه المظاهرة، نعرض حقن الوريد الذيل من الخلايا السرطانية الثديية جنبا إلى جنب مع طريقة دقيقة وشاملة للتحليل.

على الرغم من أن مجتمع الأبحاث قد أحرز تقدما كبيرا في فهم العملية المعقدة للانبثاث سرطان الثدي، ويقدر أن أكثر من 150،000 امرأة حاليا سرطان الثدي النقيلي16. من بين المصابين بسرطان الثدي في المرحلة الرابعة، يعاني >36٪ من المرضى من انبثاث الرئة17؛ ومع ذلك، يمكن أن يختلف نمط وحدوث الانبثاث الخاصة بالموقع استنادا إلى النوع الفرعي الجزيئي18,19,20,21. المرضى الذين يعانون من انبثاث الرئة المرتبطة بسرطان الثدي لديهم متوسط البقاء على قيد الحياة من 21 شهرا فقط تسليط الضوء على الحاجة إلى تحديد العلاجات الفعالة والمؤشرات الحيوية الجديدة لهذا المرض17. استخدام نماذج الانبثاث التجريبية، بما في ذلك الحقن الوريدي للخلايا السرطانية، سوف تستمر في تعزيز معرفتنا بهذا التحدي السريري الهام. عند دمجها مع علم أمراض التصوير الرقمي وطريقة تحليل عبء ورم الرئة النقيلي الموصوف في هذا البروتوكول ، فإن حقن الوريد الخلفي هي أداة قيمة لأبحاث الانبثاث لسرطان الثدي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يتبع استخدام الحيوان لوائح الموارد الحيوانية في مختبر الجامعة (ULAR) بموجب لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات (IACUC) - البروتوكول المعتمد 2007A0120-R4 (PI: Dr. Gina Sizemore).

1. حقن الوريد الذيل من خلايا سرطان الثدي

  1. إعداد الخلايا والمحاقن للحقن
    1. لوحة عدد مناسب من الخلايا على أساس عدد الفئران وتركيز الخلايا لاستخدامها.
      ملاحظة: عدد الخلايا حقن والوقت لتطوير الانبثاث سوف تعتمد على خط الخلية المستخدمة، وسوف تحتاج إلى تحسين. في هذه المظاهرة، يتم حقن 1 × 106 خلايا MDA-MB-231 عن طريق الوريد في فئران NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)، ويلاحظ وجود آفات رئوية بالمنظار الكلي في موعد لا يتجاوز 24 يوما بعد الحقن. بالنسبة لخط الخلية السرطانية MVT1 murine mammary17 ، يتم حقن 3 × 106 خلايا في فئران FVB / N المختصة بالمناعة مع العديد من الانبثاث الرئوي الذي لوحظ من قبل 14 days22،23.
    2. أسبيرات وسائل الإعلام وشطف لوحات الخلية مع برنامج تلفزيوني 1x. جرب الخلايا في الحد الأدنى من الحجم، إضافة حجم مناسب من الوسائط، وعدد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو طريقة أخرى مفضلة. يمكن استخدام التريبان الأزرق (0.4٪) أو غيرها من الأصباغ الحية / الميتة لتحديد عدد الخلايا القابلة للتطبيق.
    3. بيليه الخلايا عن طريق الغزل في 180 × ز لمدة 5 دقائق.
    4. Resuspend العدد المناسب من الخلايا في برنامج تلفزيوني 1x عقيمة بحيث يتم حقن حجم 100 ميكرولتر لكل فأر. الحفاظ على تعليق الخلية على الجليد للحفاظ على البقاء.
    5. قبل الحقن، إعادة ضغط الخلايا بدقة مع ماصة 200 ميكرولتر أو 1 مل لتجنب تكتل. وضع 100 ميكرولتر في حقنة الأنسولين 28 غرام (انظر جدول المواد).
    6. القضاء على أي فقاعات الهواء عن طريق الحفاظ على حقنة عمودية، والتنصت على الحقنة، وضبط ببطء المكبس. حقن فقاعات الهواء في الوريد من المرجح أن يسبب انسداد الهواء / الغاز التي يمكن أن تكون قاتلة.
  2. حقن ذيل الوريد الجانبي
    ملاحظة: بالنسبة لمقايسات الانبثاث التجريبية لسرطان الثدي، يتم إجراء الحقن على الفئران الأنثوية البالغة من العمر 6 أسابيع >.
    1. التعامل مع الماوس من الذيل والشريحة الحيوانية في أنبوب مشقوق / جهاز ضبط النفس من حجم مناسب (انظر جدول المواد لجهاز ضبط النفس المستخدمة).
    2. أدخل الجزء المكون لجهاز ضبط النفس وضع الماوس على جانبها بحيث يكون من السهل عرض الوريد الذيل الجانبي. يحتوي الفأر على شريان بطني يتماشى مع الأعضاء التناسلية ، وريد الظهر ، وعروقين وريديين وريديين.
    3. تنظيف سطح ذيل الماوس مع مسح مطهر. فهم الذيل بين السبابة والإبهام مع اليد غير المهيمنة وتطبيق التوتر طفيف.
    4. بدءا من الجزء القاصي من الذيل ، أدخل الإبرة الموازية للوريد مع شطبة في نهاية المطاف.
    5. إذا سمح، وتلخيص بعناية الإبرة والانحناء إلى زاوية 20-30 درجة. ينصح بشدة باتباع نهج بيد واحدة أو جهاز لتلخيص الإبر.
      ملاحظة: ليس من الضروري أن يستنشق لأن هذا قد يتسبب في طي الوريد. ومع ذلك، يمكن رؤية ومضة صغيرة من الدم عند وضعها لأول مرة. الإبرة سوف تتقدم بسلاسة في الوريد مع الموضع الصحيح.
    6. الاستغناء ببطء عن حجم كامل في الوريد. لا ينبغي أن تكون هناك مقاومة عندما يتم دفع المكبس.
    7. إذا شعر أي مقاومة, إزالة فورا إبرة حقنة. إذا لزم الأمر، إعادة إدراج الإبرة (من الناحية المثالية لا أكثر من 3 محاولات) تتحرك نحو الطرف القريب من الذيل أو الوريد الجانبي المعارض.
    8. ومن المرجح أن يتم إزاحة كمية صغيرة من الدم بعد الحقن. تطبيق ضغط لطيف مع الشاش العقيم ومسح مع مسح مطهر.
    9. التخلص فورا من حقنة في حاوية حادة المناسبة.
    10. أعد الماوس إلى قفص نظيف ومهوى وراقب علامات الضيق.
    11. رصد الفئران 2-3x / أسبوعيا لعلامات تشكيل الانبثاث (التنفس شاقة، موقف حدب، وفقدان الوزن) والضيق العام. الوقت لتطوير الانبثاث سوف تعتمد على خط الخلية وسلالة الماوس.
    12. إذا كنت تستخدم جهاز تصوير حي للحيوانات الحية في الجسم الحي ، فإن فئران الصور مباشرة بعد حقن الوريد الخلفي لتأكيد الحقن الناجح للخلايا والحصول على بيانات "صفر" للوقت (لا يتم تضمين تفاصيل محددة حول التصوير الحيوي في الجسم الحي هنا ، ولكن يتم وصفها من قبل Yang et al.24).

2. تثبيت أنسجة الرئة وتحليل عبء ورم الرئة النقيلي

  1. تضخم أنسجة الرئة للحفاظ على الشكل الهيكلي للرئتين لعلم الأمراض النسيجية
    1. بعد اتباع إجراءات القتل الرحيم المعتمدة (مثل ثاني أكسيد الكربون في 30 - 70٪ من حجم الغرفة / دقيقة) ، قم بتأمين جثة الماوس إلى لوحة تشريح مع دبابيس. إما رش أو تطبيق الإيثانول 70٪ للحفاظ على الفراء الماوس للخروج من الطريق أثناء تشريح.
      ملاحظة: يمكن أن يسبب اختناق ثاني أكسيد الكربون الهمورهاج الرئوي كآفة خلفية متوقعة ، خاصة بمعدلات تدفق أبطأ.
    2. فتح الصدر مع شق خط الوسط، وتوسيع شق cranially / caudally من خلال الصفاق، وقطع الحجاب الحاجز عن طريق استيعاب عملية xyphoid.
    3. باستخدام مجموعة منفصلة من مقص لا مملة ريش، وقطع الأضلاع على طول كل جانب من القص وإزالة القفص الصدري بعناية ترك مجالا للرئتين لتوسيع.
    4. عزل القصبة الهوائية عن طريق إزالة الغدد اللعابية تحت الفك السفلي والعضلات تحت الهيداوي. يمكن أن يؤدي وضع دبابيس على جانبي القصبة الهوائية إلى منع الحركة غير المرغوب فيها أثناء إدخال الإبرة.
    5. ملء حقنة 26 G مع 2-3 مل من 10٪ محايدة عازلة الفورمالين وإدراجها في القصبة الهوائية.
    6. حقن ببطء الفورمالين ومشاهدة للرئتين لتوسيع (عادة ما يتطلب ~ 1.5 مل من الفورمالين).
    7. بمجرد أن يبدأ الفورمالين في التسرب من الرئتين (تجنب التضخم) ، قرصة قبالة القصبة الهوائية مع زوج من ملقط ، وإزالة إبرة حقنة وفصل الجهاز التنفسي بأكمله. وضع الرئتين والقلب، وما إلى ذلك مباشرة في الفورملين كما يمكن أن يتم تشذيب إضافية من الأنسجة بعد التثبيت.
    8. معالجة كاملة، وتضمين، وتقسم من الأنسجة، والهيماتوكسيلين واليوزين (H &؛ E) تلطيخ باستخدام الطرق القياسية.
  2. تحليل عبء ورم الرئة النقيلي
    1. تفحص أقسام الرئة الملطخة ب H&E على ماسح ضوئي عالي الدقة، وشريحة عند تكبير 40x (الشكل 3).
    2. استيراد الصور إلى برامج تحليل الصور (مثل تحليل صورة Visiopharm) من أجل تحديد كمي لنقائل الرئة.
      ملاحظة: نوصي المستخدمين الجدد إما الحصول على التدريب في الموقع أو عبر الإنترنت لاستخدام برنامج تحليل الصور. كما تتوفر العديد من الندوات عبر الإنترنت من خلال صفحة الويب التجارية.
    3. حدد تطبيق Visiopharm 10118 H&E Lung Metastasis من مكتبة تطبيقات البرنامج.
      ملاحظة: الغرض من هذا التطبيق هو تسمية وقياس انبثاث الرئة على الشرائح H & E الملطخة. كجزء من تطبيق H&E Lung Metastasis 10118، فإن الخطوة الأولى لمعالجة الصور تجزئ أنسجة الرئة باستخدام تطبيق اكتشاف الأنسجة. تستخدم الخطوة الثانية لمعالجة الصور تطبيق اكتشاف الانبثاث الذي يحدد الانبثاث داخل أنسجة الرئة. يتم تحديد الانبثاث عن طريق الشكل جنبا إلى جنب مع المناطق التي هي إما مشوه جدا، أحمر جدا أو متناثرة جدا بحيث لا يمكن تحديدها على أنها الانبثاث.
    4. ضبط المعلمات تحديد الشكل والتشتت لتناسب أفضل الصور التمثيلية. يمكن عرض المناطق المجزأة من الانبثاث الورم وأنسجة الرئة الطبيعية باستخدام تسميات لون مختلفة لكل نوع من أنواع الأنسجة.
      ملاحظة: في حالة عدم تمكن التطبيق من فصل الانبثاث بدقة عن أنسجة الرئة العادية، قد يحتاج تطبيق مخصص يستخدم برنامج Visiopharm Decision Forest إلى الكتابة كما تم إجراؤه للتجارب (انظر الشكل 2 والشكل 3). تفاصيل لكتابة خوارزمية مخصصة اتبع أدناه. وإلا، انتقل إلى الخطوة 2.2.9.
    5. افتح برنامج غابة القرار، الذي يعمل من خلال تدريب فئات متعددة [أي أنسجة الرئة (غير النيوبلاستيك)، والانبثاث، وخلايا الدم الحمراء، والظهارة، و / أو الفضاء الأبيض] على الصورة المطلوبة. في الشكل 2، الانبثاث الورم الأزرق، والأنسجة الطبيعية خضراء، وظهارة الشعب الهوائية هو الأصفر. أيضا، خلايا الدم الحمراء في مساحات حمراء وهوائية باللون الوردي.
    6. اتبع السلسلة التي تمت المطالبة بها من الأسئلة نعم أو لا لتدريب كل فئة بشكل مناسب للحصول على صورة. دقة الخوارزمية ستحدد عدد الأسئلة نعم / لا. للتحليل، تمت كتابة الخوارزمية/التطبيق المخصص بدقة تم تعيينها إلى 50 (النطاق 0-100).
    7. ضبط ميزات لكل فئة من خلال تطبيق مرشحات لشحذ، طمس، فرز حسب الشكل، وما إلى ذلك لتعزيز دقة الخوارزمية / التطبيق. تغير الميزات كيفية رؤية الفئة للصورة لإخراج ألوان أو شدة معينة.
      ملاحظة: بالنسبة للخوارزمية المخصصة، يتم تصنيف الانبثاثات التي تبلغ مساحتها 8500 ميكرومتر2 وما فوق وقياسها على أنها نقائل. وهذا يفسر تباين الحجم ونقائل صغيرة جدا للكشف. تم تضمين المناطق الصغيرة المشوهة والمناطق النقيلية الصغيرة تحت 8500 ميكرومتر2 في القياس الكمي الطبيعي للأنسجة.
    8. حفظ الإعدادات المعدلة من التطبيق أو خوارزمية مخصصة ومن ثم، تطبيق خوارزمية / التطبيق على مجموعة كاملة أو سلسلة من الأنسجة الملطخة H & E.
    9. وأخيرا، تصدير كافة متغيرات الإخراج، والتي تشمل تلك المدرجة في الجدول 1. ويمكن قياس المساحة في ميكرون مربع (μm2) كميا لكل نوع من أنواع الأنسجة وتستمد النسب المئوية من إجمالي مساحة الأنسجة الصافية للعينة (أي إجمالي الأنسجة ناقص الفضاء الجوي).
    10. عند إنشاء خوارزمية مخصصة، قم بمراجعة علامات الأنسجة بالتشاور مع مجلس الأمراض البيطرية المعتمد من قبل الكلية الأمريكية لأخصائيي علم الأمراض البيطرية لضمان قياسات دقيقة والتمييز بين أنواع الأنسجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إذا كان استخدام الخلايا غير الملساء لحقن الوريد الذيل، قد يكون من الصعب تأكيد استعمار الرئة حتى (1) وقت التشريح إذا كان يمكن ملاحظة الماكروميتاستاز أو (2) بعد التحليل النسيجي إذا كانت الانبثاث المجهرية موجودة. مع عبء ورم الرئة النقيلي واسعة النطاق، الفئران سيكون لها التنفس شاقة. كما هو الحال مع أي دراسة الورم، الفئران يجب أن تراقب بعناية طوال مدة الدراسة. استخدام الخلايا المسماة هو وسيلة سهلة لتأكيد حقن الوريد الذيل ناجحة; ومن ثم استخدام لوسيفيراز الموسومة MDA- MB-231 الخلايا في المظاهرة. ومع ذلك ، في التصوير في الجسم الحي ليست دائما ممكنة أو ضرورية اعتمادا على التصميم التجريبي وغيرها من العوامل. يظهر الشكل 1A إشارة الإضاءة الحيوية في الفضاء الصدري بعد أقل من ساعتين من حقن الوريد الذيل لخلايا MDA-MB-231 الموسومة باللوسيفيراز كتأكيد للحقن الدقيق. لهذه التجربة، عدد الفوتونات في منطقة الصدر زيادة مع مرور الوقت وإشارة الإضاءة الحيوية قوية موجودة في اليوم 24 بعد الحقن (الشكل 1B و C؛ لاحظ التغير في شريط المقياس). في وقت التشريح ، لوحظت العديد من آفات الرئة العيانية في هذه الفئران (الشكل 1D).

بعد معالجة الأنسجة السليمة وتلطيخها، يمكن مسح أقسام الرئة الملطخة ب H&E أو تصويرها. يمكن تحقيق القياس الكمي لعبء ورم الرئة النقيلي بشكل فعال باستخدام برنامج تحليل الصور خوارزمية مخصصة. باستخدام خوارزمية مخصصة، يتم تقسيم أنسجة الرئة بأكملها من قبل ميزات الأنسجة المختلفة (الشكل 2A وباء). من خلال تقسيم أنسجة الرئة بهذه الطريقة ، يمكن للبرنامج تحديد المعلمات المختلفة المدرجة في الجدول 1. وقد تم إجراء هذا التحليل على أنسجة الرئة من الفئران حقن مع خلايا MDA-MB-231 تليها العلاج مع دواء مصمم لمنع الاستعمار النقيلي أو السيطرة على السيارة (DMSO). وتظهر البيانات الأولية من هذا التحليل في الجدول 2. وعلاوة على ذلك، يظهر الشكل 3A الصور التمثيلية H&E لنقائل الرئة MDA-MB-231 من فئران DMSO أو الفئران المعالجة بالمخدرات. في حين أن الفرق في عبء الورم النقيلي بين هذه المجموعات العلاجية قد يكون تم تجاهله بسهولة لأن العدد الإجمالي للعقيدات الرئوية لا يختلف ، فإن التحليل الشامل لجميع المعلمات يشير إلى اختلاف كبير في منطقة انبثاث الرئة الصافية في المئة (الشكل 3B ، C). وهذا يؤكد الحاجة إلى نهج شامل وشامل لتحليل عبء ورم الرئة النقيلي مثل الطريقة الموصوفة هنا.

10 - وبالنسبة للبيانات المقدمة في الشكل 3، أجريت جميع التحليلات الإحصائية باستخدام منشور GraphPad Prism 7. واعتبرت البيانات موزعة عادة عند اجتياز أي من اختبارات الحياة الطبيعية القياسية التالية: داغوستينو بيرسون أومنيبوس، وشابيرو ويلك، وكولموغوروف - سميرنوف. وأجريت المقارنة بين السيارة والمجموعات المعالجة بالمخدرات (الشكل 3) عن طريق اختبار الطالب ذو الذيلين غير المدفوع الأجر. وقد حددت الأهمية الإحصائية في ≤ 0.05.

Figure 1
الشكل 1: في تأكيد الإضاءة الحيوية في الجسم الحي للحقن الناجح في الوريد الذيل.
(أ) إشارة الإضاءة الحيوية التمثيلية في الفئران بعد ساعة واحدة من حقن الوريد الذيل من خلايا MDA-MB-231 الموسومة باللوسيفراز. (ب) إشارة الإضاءة الحيوية التمثيلية في نفس مجموعة الفئران مثل (A) بعد 24 يوما من حقن الوريد الذيل من خلايا MDA-MB-231 الموسومة باللوسيفيراز. [لاحظ التغيير في شريط المقياس بين (أ) و (ب)]. (ج) تحديد عدد فوتونات مع مرور الوقت في الفئران حقن ذيل الوريد MDA-MB-231. تمثل أشرطة الخطأ متوسط ± SEM. (n = 8 فئران) (D) ممثل أنسجة الرئة غير السرطانية الحاملة (يمين) وMDA-MB-231 macrometastases في الرئتين (يسار) في وقت التشريح. أشرطة المقياس = 50 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تجزئة الأنسجة باستخدام برنامج Visiopharm.
(أ) القصاصات التمثيلية للعلامات الأنسجة غير المقسمة والمجزئة باستخدام خوارزمية البرامج المخصصة. (ب) وسيلة إيضاح لجميع فئات الأنسجة المجزأة باستخدام البرمجيات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحليل عبء ورم الرئة النقيلي التمثيلي للأنسجة الملطخة ب H&E.
(أ) تلطيخ الممثل H&E لأنسجة الرئة من الفئران غير المنضورة والتحكم (DMSO) والفئران المعالجة بالمخدرات بعد حقن الوريد الخلفي لخلايا MDA-MB-231. يشار إلى انبثاث الورم التمثيلي بالسهام. أشرطة المقياس = 500 ميكرومتر للتكبير 4x و 200 ميكرومتر للتكبير 10x. (ب) الرسم البياني للنسبة المئوية صافي منطقة الانبثاث الرئوي للسيطرة والفئران المعالجة بالمخدرات. تمثل أشرطة الخطأ متوسط ± SD. (*) P = 0.022 بواسطة اختبار t للطالب. (ج) جدول يلخص تحليل عبء ورم الرئة النقيلي (ن = 9 DMSO؛ n = 9 معالجة بالعقاقير). بعد التحقق من التوزيع العادي للبيانات، تم تحديد جميع قيم P في الجدول من خلال اختبار T للطالب غير المدفوع، ذو الذيلين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

البارامتر وصف
إجمالي مساحة الأنسجة (μm2) منطقة في ميكرون مربع شاملة لجميع الانبثاث الورم والرئة العادية ومناطق خلايا الدم الحمراء.
عدد الانبثاث العدد الإجمالي للنقائل داخل أنسجة الرئة.
نسبة منطقة الانبثاث (μm2) إجمالي منطقة الانبثاث مقسومة على صافي مساحة الأنسجة × 100.
مجموع الأنسجة + منطقة الفضاء الأبيض (μm2) منطقة في ميكرون مربع شاملة لجميع الأنسجة والمساحات البيضاء.
صافي منطقة الأنسجة (μm2) منطقة الأنسجة في ميكرون مربع (ميتس والرئة العادية) دون مساحة بيضاء وخلايا الدم الحمراء.
إجمالي منطقة الانبثاث (μm2) إجمالي مساحة الانبثاث في ميكرون مربع كما مجزأة من قبل algorithim غابة القرار.
متوسط منطقة الانبثاث (μm2) متوسط (متوسط) المساحة في ميكرون مربع من الانبثاث داخل كل صورة.
متوسط منطقة الانبثاث (μm2) متوسط منطقة الانبثاث في ميكرون مربع. عدد متساو من الانبثاث يقع تحت هذه القيمة وعدد متساو من الانبثاث أكبر من القيمة الوسيطة.

الجدول 1: المعلمات التي تقاس بالبرمجيات. قائمة المعلمات مع وصف لكل قياس يتم حسابها باستخدام خوارزمية مخصصة.

تزحلق عدد الانبثاث نسبة منطقة الانبثاث (μm2) مجموع الأنسجة + منطقة الفضاء الأبيض (μm2) المساحة البيضاء الإجمالية (μm2) صافي منطقة الأنسجة (μm2) إجمالي منطقة الانبثاث (μm2) منطقة خلايا الدم الحمراء (μm2) متوسط منطقة الانبثاث (μm2) متوسط منطقة الانبثاث (μm2)
171 الرئة الشريحة 1 435 8.90 185698000 83201800 92031400 8189250 10464800 18825.86 14748.73
171 الرئة الشريحة 2 323 8.37 185698000 83201800 92054740 7708990 10441460 23866.84 14748.73
172 الرئة الشريحة 1 151 2.73 181546000 89509904 81571296 2225220 10464800 14736.56 12486.37
172 الرئة الشريحة 2 142 2.60 170708000 81735504 80558196 2093040 8414300 14739.72 12119.62
173 الرئة الشريحة 1 634 11.60 234104992 102153000 115606692 13406800 16345300 21146.37 15472.22
173 الرئة الشريحة 2 667 12.70 223180992 86778600 122374592 15542700 14027800 23302.40 16531.00
174 الرئة الشريحة 1 40 0.55 192452992 80340896 87591096 485121 24521000 12128.03 10484.05
174 الرئة الشريحة 2 34 0.51 183918000 71287904 91242796 464830 21387300 13671.47 11181.81
175 الرئة الشريحة 1 780 23.93 179544992 44799200 126995782 30388600 7750010 38959.74 19307.76
175 الرئة الشريحة 2 1001 12.58 169191536 43425608 120610754 15169100 5155174 15153.95 19703.08
188 الرئة الشريحة 1 569 13.20 162290000 54210000 98486310 12997300 9593690 22842.36 14463.91
188 الرئة الشريحة 2 271 5.15 157146000 54250800 91996500 4738100 10898700 17483.76 12657.83
189 الرئة الشريحة 1 74 1.70 185292992 95700800 77779392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
189 الرئة الشريحة 2 74 1.76 182272992 95700800 74759392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
816 الرئة الشريحة 1 246 5.65 185876000 87568896 81916204 4631050 16390900 18825.41 14371.99
816 الرئة الشريحة 2 565 6.05 183220000 76954304 90305396 5462670 15960300 9668.44 14244.82
876 الرئة الشريحة 1 468 10.36 208308000 99300096 100947064 10454500 8060840 22338.68 16011.37
876 الرئة الشريحة 2 528 11.74 199750896 81642568 110450391 12963400 7657937 24551.89 16699.13
877 الرئة الشريحة 1 732 17.98 219340992 99918600 107869992 19397100 11552400 26498.77 18137.52
877 الرئة الشريحة 2 605 14.64 207925504 88539712 108168329 15839700 11217463 26181.32 18014.64
878 الرئة الشريحة 1 377 10.05 178534000 85610896 81931104 8232340 10992000 21836.45 16671.03
878 الرئة الشريحة 2 376 9.88 170544000 75337904 86108406 8511710 9097690 22637.53 16754.38
879 الرئة الشريحة 1 205 5.22 167556000 89999000 68123630 3553860 9433370 17335.90 13845.69
879 الرئة الشريحة 2 213 4.64 167931008 80789400 78489588 3638720 8652020 17083.19 14058.12
881 الرئة الشريحة 1 1122 38.81 218880000 79713504 130893816 50802300 8272680 45278.34 22044.99
881 الرئة الشريحة 2 628 21.67 184200992 74502600 99122692 21475200 10575700 34196.18 19857.40
882 الرئة الشريحة 1 678 24.05 194476992 83941904 98484788 23684500 12050300 34932.89 20748.06
882 الرئة الشريحة 2 645 21.93 185537040 75790040 101412430 22241700 8334570 34483.26 20325.11
883 الرئة الشريحة 1 429 10.79 179400992 84955696 84699866 9138800 9745430 21302.56 15080.23
883 الرئة الشريحة 2 342 85.30 175220992 76210896 90472386 77170200 8537710 225643.86 17078.26
884 الرئة الشريحة 1 359 6.42 206751008 87752600 103825008 6669710 15173400 18578.58 14333.41
884 الرئة الشريحة 2 480 9.12 200990000 77052496 111060804 10125700 12876700 21095.21 15679.88
885 الرئة الشريحة 1 332 7.79 191398000 92896304 84752596 6605490 13749100 19896.05 14500.11
885 الرئة الشريحة 2 537 81.02 187475008 85938000 89378408 72411104 12158600 134843.77 15360.29
886 الرئة الشريحة 1 305 7.93 158435008 80433296 76541662 6068720 1460050 19897.44 14500.11
886 الرئة الشريحة 2 898 8.84 155460000 70808600 83457470 7380490 1193930 8218.81 14744.92

الجدول 2: جدول النتائج التمثيلي. جدول النتائج لكل معلمة من الخوارزمية من مجموعة من الفئران ذيل الوريد حقن مع خلايا MDA-MB-231.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مع استمرار الباحثين في استخدام الحقن الوريدي للخلايا السرطانية كنموذج تجريبي للانبثاث ، تفتقر إلى الممارسات القياسية لتحليل عبء الورم النقيلي الناتج. في بعض الحالات، يمكن ملاحظة اختلافات كبيرة في عبء الورم النقيلي عند التلاعب بخطوط خلايا معينة و / أو استخدام المركبات الكيميائية بشكل كلي. ومع ذلك ، في حالات أخرى ، قد يتم تجاهل الاختلافات الدقيقة في البذر والنمو النقيلي أو يساء تفسيرها دون تحليل مرضي شامل. تقدم هذه الدراسة بروتوكولات حقن الوريد الخلفي المنشورة سابقا من خلال تضمين طريقة شاملة لتحليل عبء ورم الرئة النقيلي. الأهم من ذلك ، يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة في تحليل علم الأمراض الرقمي على التحديد الكمي لعبء الورم النقيلي في الرئة بعد الحقن التقويمي للخلايا السرطانية القادرة على الانبثاث التلقائي بالإضافة إلى نماذج الانبثاث التجريبية الأخرى (أي داخل القلب ، وما إلى ذلك) ونماذج xenograft المشتقة من المريض (PDX). استخدام التصوير الرقمي وتطوير خوارزمية البرمجيات من قبل علماء الأمراض البيطرية يضمن استنساخ ودقة ودقة هذا النهج لتحليل عبء ورم الرئة النقيلي25.

قرار مدروس من خطوط الخلية، وتركيز الخلية، ونقاط النهاية على أساس الدراسات المنشورة سابقا أو التحسين التجريبي الدقيق ضروري للغاية. وبالنظر إلى أن البذر والاستعمار النقيلي يعتمدان بشكل كبير على التفاعلات مع مختلف مجموعات الخلايا المناعية26,27 ، فإن استخدام الفئران ذات الكفاءة المناعية مثالي ، وإن لم يكن ممكنا دائما. وللسبب نفسه، ينبغي توخي الحذر في تفسير دراسات الانبثاث التجريبية باستخدام فئران اللامياء أو NSG، التي تفتقر إلى مكونات الخلايا المناعية الرئيسية. هناك العديد من خطوط الخلايا السرطانية الثديية الماوس، بما في ذلك خلايا MVT1 المستخدمة في هذه الدراسة، التي تم اشتقاقها من سلالة الماوس FVB/N22،28،29. نماذج أخرى syngeneic موجودة أيضا. وفيما يتعلق بتركيز الخلايا، قد يؤدي حقن عدد كبير من الخلايا إلى تسريع وتعزيز عبء ورم الرئة النقيلي. ومع ذلك ، إذا كانت الرئتين غارقة ، فقد يكون من الصعب التمييز بين البؤر النقيلية الفردية والجمولي أكثر عرضة للحدوث. أيضا, إجراء حقن ذيل الوريد يتطلب ممارسة وافرة والتدريب قبل بأمان و / أو إجراء الحقن بشكل روتيني. وستقدم العديد من المؤسسات التدريب التقني وقد توفر فئرانا لأغراض الممارسة. وينبغي أن الموضع السليم للابرة وحقن سلس تشير إلى النجاح; ومع ذلك، لأغراض التدريب / الممارسة، يمكن استخدام صبغة إيفانز الأزرق للمساعدة في تحديد الحقن الناجح (1٪ في برنامج تلفزيوني معقم). سوف تتحول أطراف الفأر إلى اللون الأزرق بعد وقت قصير من الحقن ، ولكن يجب قتل الحيوان بعد ذلك.

بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن التأكيد بما فيه الكفاية على أهمية تقنيات التشريح وأخذ عينات الأنسجة القياسية للتحكم ومنع القطع الأثرية للشرائح التي قد تضعف مسح الشرائح وتحليلها من خلال برنامج تحليل الصور. التضخم في الرئتين في وقت التشريح هو خطوة حاسمة في الحفاظ على سلامة الأنسجة ويحسن تلطيخ H & E اللاحقة وكذلك التحليل النهائي. للاتساق مع الدقة وقابلية النسخ، يوصى بمسح جميع الشرائح في مجموعة الدراسة بنفس الهدف. في هذه الدراسة، تم مسح جميع الشرائح في 40x لضمان دقة إعدادات الخوارزمية وتحديد السليم للانبثاث الورم عند تطبيقها على الحقول المحللة. لكل شريحة، تم مسح نفس فصوص الرئة باستمرار وتحليلها لكل فأر. كما يوصى بشدة بأن يقوم أخصائي علم الأمراض بمراجعة علامات الأنسجة للتأكد من دقة الخوارزمية المطبقة وتطبيق نفس الخوارزمية على كل شريحة في الدراسة.

يمكن تعديل البروتوكول المقدم وفقا للتصميم التجريبي وتفضيلات المستخدم وقياسات النتائج المرجوة. ويشمل أحد هذه التعديلات استخدام غرفة تحريض التخدير بدلا من جهاز التقييد التقليدي للحيوان الواعي. من حيث صحة الحيوان والعافية ، لا يتفوق أي من النهجين على الآخر ولكل منهما مجموعة من المزايا الخاصة به بالإضافة إلى القيود30. أيضا، للفئران السوداء أو البنية، قد تكون هناك حاجة لمصدر الضوء أو جهاز التدفئة من أجل تصور عروق الذيل. يمكن استخدام مصابيح الأشعة تحت الحمراء أو حمام الماء الدافئ لتوسيع الأوردة. ومع ذلك، ينبغي رصد درجة الحرارة بعناية. وعلاوة على ذلك، هناك أجهزة ضبط النفس مضيئة المتاحة، فضلا عن الإصدارات التجارية الأخرى من أجهزة ضبط النفس القوارض. بعض المحققين يفضلون حقن لوير لوك للحقن. نجد صعوبة أكبر في القضاء على فقاعات الهواء مع حقن Luer-Lok ، ولكنها مسألة تفضيل. إن صلاحية الخلايا هي اعتبار مهم لإجراء حقن الوريد الذيل ، وبالتالي ، فإن تعداد الخلايا الدقيق بالإضافة إلى الحفاظ على الخلايا على الجليد قبل الحقن هي خطوات ضرورية. إذا قارنت بين بذر الرئة والاستعمار لخطوط الخلايا المتلاعب بها، فمن الأهمية بمكان تحديد أي اختلافات في حجم الخلية وقابليتها للحياة قبل الحقن لأن هذه قد تعقد تفسير النتائج. قد يحدث موت الخلايا و/أو تلفها عند استخدام إبرة قياس ضيقة؛ ومع ذلك، لا ينصح باستخدام إبرة أكبر من 25 G لأنها قد تسبب الألم وعدم الراحة للحيوان.

كوسيلة للتحقق من أن آفات الرئة تتشكل عن طريق حقن الخلايا السرطانية، يمكن أن يتم الإصابة بالمناعة على أقسام الأنسجة. إذا كان استخدام خطوط الخلايا البشرية، يمكن استخدام الأجسام المضادة الخاصة بالإنسان لتمييز الآفات النقيلية. بدلا من ذلك، إذا كنت تستخدم خطوط الخلايا الموسومة (مثل GFP)، يمكن استخدام الأجسام المضادة المقابلة. أيضا، العديد من خطوط خلايا سرطان الثدي إيجابية للعلامات الظهارية (أي السيتوكيراتين، E-cadherin، وEpCAM)، ولكن المعرفة المسبقة للتعبير أمر ضروري. ومع ذلك، فإن ظهارة الرئة بطانة الشعب الهوائية أيضا أن تكون إيجابية لهذه العلامات، وبالتالي، يجب أيضا النظر في هيكل. قد تكون هناك حالات يجب فيها استبعاد نمو ورم الرئة الأولي. للقيام بذلك، يمكن استخدام تلطيخ المناعة الكيميائية لعامل النسخ الغدة الدرقية-1 (TTF1) كعلامة على الورم الغدي الرئة الأولية. يجب تقييم تلطيخ TTF1 من قبل أخصائي أمراض معتمد.

هنا، تمت كتابة خوارزمية مخصصة باستخدام خوارزمية تصنيف غابة القرار لأنه لا يمكن ضبط خوارزمية الانبثاث الرئوي المنشأة للكشف الدقيق عن الانبثاث التي تختلف في الحجم. تمكن هذه الخوارزمية المخصصة من إجراء قياسات معقدة ، وتسمح بتقسيم دقيق للنقائل حسب الحجم ، وتدعم قطع الحجم بحيث لا يساء تفسير المناطق الصغيرة المشوهة والهياكل العادية وبالتالي يمكن تضمينها في مجموعة البيانات النهائية. نتوقع أن تكون هذه الخوارزمية قابلة للتطبيق على معظم دراسات الانبثاث الرئوي الحي ، ولكن قد يحتاج المستخدمون إلى ضبط الإعدادات داخل البرنامج لتناسب احتياجاتهم الدراسية الفردية. ومع ذلك ، فإن هذه الخوارزمية بمثابة منصة للمحققين الراغبين في تحليل عبء النقيلي الرئة بطريقة مماثلة. هناك العديد من الخيارات المختلفة لمنصات تحليل الصور حيث الوصول أو التوافر والتكلفة والتدريب ، وكذلك مستوى الخبرة قد تملي أفضل منصة للاستفادة36. مجموعة من الخيارات تشمل منصات مجانية مثل QuPath ومنصات أكثر تكلفة ، ولكن متطورة ، مثل Visiopharm. ينصح بأن يتشاور المرء مع جوهر علم الأمراض وتحليل الصور وأخصائي علم الأمراض عند تحديد المنصة التي قد تكون متاحة وأفضل استخدام لمشروع بحثي معين.

نماذج الورم الثديي الماوس التلقائي (على سبيل المثال، MMTV-PyMT) أو طرق حقن وسادة الدهون الثديية التقويمية تمثل النموذج الأكثر صلة من الناحية الفسيولوجية لدراسة الانبثاث الرئوي. عيب خطير لنموذج حقن ذيل الوريد هو أنه لا يلخص سلسلة النقيلي الكامل ، وبالتالي يقتصر على دراسة البذخ الخلايا السرطانية والاستعمار الجهاز الثانوي. ومع ذلك ، فإن هذا النموذج التجريبي للنقائل وثيق الصلة بأبحاث سرطان الثدي حيث أن الانبثاث الرئوي الذي تشكل بعد حقن الوريد الخلفي له ملامح جينومية مشابهة للآفات النقيلية التي تتطور بعد زرع العظام لنفس الخلايا31. من أجل إنشاء نموذج الانبثاث الرئوي ، يتم حقن عدد كبير من الخلايا عن طريق الوريد والتي قد لا تمثل بدقة عملية الانبثاث لأنها تتعلق البذر ، رد الفعل المناعي ، والانحسار. أيضا، استنادا إلى مسار الدورة الدموية، الانبثاث الرئوي هي الأكثر شيوعا مع حقن ذيل الوريد32. مع معظم خطوط خلايا سرطان الثدي، تشير التقارير المنشورة إلى حدوث انخفاض نسبي في حالات الانبثاث العظمي أو الكبدي أو الدماغي بعد حقن الوريد الخلفي7. طرق الانبثاث التجريبية البديلة مثل داخل القلب، داخل القلب، الوريد البوابي والحقن داخل السباتي هي أكثر ملاءمة لفحص الانبثاث إلى مواقع أخرى33،34،35،36،37. مرة أخرى، يفضل نماذج الورم الثديي التلقائي أو طرق حقن وسادة الدهون التقويمية التي تلخص جميع خطوات السلسلة النقيلية. القضايا مع عبء الورم النقيلي متسقة، ومدة الدراسة، وأعداد الحيوانات المطلوبة لمثل هذه الدراسات هي الجانب السلبي. ومع ذلك ، يمكن تطبيق طريقة تحليل علم الأمراض الرقمية المعروضة هنا على انبثاث الرئة التي تشكلت من خلال أي نموذج انبثاث عفوي أو تجريبي.

كما تسفر طريقة التحليل عن بعض القيود مثل الذاتية في إنشاء الخوارزميات. على الرغم من أن تصوير الشريحة بأكمله يسمح بإجراء تحليل رقمي على قسم الأنسجة بأكمله وعلى جميع فصوص الرئة من فأر واحد ، إلا أنه يقتصر على تحليل ثنائي الأبعاد للأنسجة ثلاثية الأبعاد. أصبح علم المجسمة ممارسة شائعة تحصل على معلومات ثلاثية الأبعاد لتحليل الصور ويمكن أن تفسر عوامل مثل انكماش الأنسجة الذي يحدث أثناء معالجة الأنسجة38. ومع ذلك، فإن علم الجسم له حدوده الخاصة مثل الأنسجة والموارد وقيود الوقت.

وبالنظر إلى عدد مرضى السرطان المتضررين من الانتشار النقيلي لمرضهم ، فإن طريقة حقن الوريد الخلفي لدراسة الانبثاث ستظل أداة مفيدة من حيث فهم البيولوجيا المعقدة للانتشار النقيلي وفي تحديد الفعالية قبل السريرية للعلاجات الجديدة. في نماذج الفئران الحية من الانبثاث، وخاصة تلك التي تستخدم الحيوانات المختصة بالمناعة، أصبحت أكثر أهمية لأبحاث السرطان نظرا للاهتمام على نطاق واسع في immunotherapy29. أيضا، نماذج الانبثاث التجريبية حاسمة من حيث التحقيق في الجينات المثبط الانبثاث (أي تلك التي قمع الإمكانات النقيلية للخلايا السرطانية دون التأثير على نمو الورم الأولي)، وبالتالي، لا تزال أداة بحثية قيمة.

أصبح التصوير الرقمي وتحليل الشرائح بسرعة دعامة أساسية في نمذجة الماوس التشخيصية والتجريبية39. استخدام نوع النهج الموصوف هنا لتحليل عبء الورم النقيلي في الرئة سيسمح بتحليلات عالية الإنتاجية بطريقة أكثر شمولا ودقة. وعلاوة على ذلك ، يوفر علم أمراض التصوير الرقمي وسيلة لمشاريع بحثية أكثر تعاونا تشمل أخصائيي علم الأمراض المتخصصين في مجالات مثل نماذج الماوس من الانبثاث سرطان الثدي. مع استمرار تطوير طرق تصوير الأنسجة المتعددة وتقنيات التصوير ثلاثي الأبعاد (كما ذكر أعلاه) ، فإن علم أمراض التصوير الرقمي ، والبرامج البرمجية المتطورة لتحليل الصور ، وخبرة أخصائيي علم الأمراض ستكون ضرورية بالتأكيد لتعزيز أبحاث الانبثاث.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

تم تمويل البيانات التمثيلية من خلال المعهد الوطني للسرطان (K22CA218549 إلى S.T.S). بالإضافة إلى مساعدتهم في تطوير طريقة التحليل الشامل المذكورة هنا ، نشكر مركز السرطان الشامل بجامعة ولاية أوهايو على علم الأمراض المقارن والموارد المشتركة في Phenotyping Mouse (مدير - كريستا لا بيرل ، DVM ، دكتوراه) لخدمات الأنسجة والكيمياء المناعية وجوهر تصوير علم الأمراض لتطوير الخوارزميات وتحليلها.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
alcohol prep pads Fisher Scientific 22-363-750 for cleaning tail prior to injection
dissection scissors Fisher Scientific 08-951-5 for mouse dissection and lung tissue inflation
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Fisher Scientific MT10013CV cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Fisher Scientific MT21030CV used for resuspending tumor cells for injection
ethanol (70 % solution) OSU used to minimize mouse's fur during dissection; use caution - flammable
Evan's blue dye Millipore Sigma E2129 used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution - dangerous reagent
Fetal Bovine Serum Millipore Sigma F4135 cell culture media additive; used at 10% in DMEM
forceps Fisher Scientific 10-270 for dissection and lung tissue inflation
FVB/NJ mice The Jackson Laboratory 001800 syngeneic mouse strain for MVT1 cells
hemacytometer (Bright-Line) Millipore Sigma Z359629 for use in cell culture to obtain cell counts
insulin syringe (28 G) Fisher Scientific 14-829-1B for tail-vein injections (BD 329424)
MDA-MB-231 cells ATCC human breast cancer cell line
MVT1 cells mouse mammary tumor cells
needles (26 G) Fisher Scientific 14-826-15 used to inflate the mouse's lungs
neutral buffered formalin (10%) Fisher Scientific 245685 used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution - dangerous reagent
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice The Jackson Laboratory 005557 maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource
Penicillin Streptomycin 100x ThermoFisher 15140163 cell culture media additive
sterile gauze Fisher Scientific NC9379092 for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs
syringe (5 mL) Fisher Scientific 14-955-458 used to inflate mouse lung tissue
tail-vein restrainer Braintree Scientific, Inc. TV-150 STD used to restrain mouse for tail-vein injections
Trypan blue (0.4 %) ThermoFisher 15250061 used in cell culture to assess viability
Trypsin-EDTA 0.25 % ThermoFisher 25200-114 used in cell culture to detach tumor cells from plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews: Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
  2. Steeg, P. S. Targeting metastasis. Nature Reviews: Cancer. 16 (4), 201-218 (2016).
  3. Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  4. Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nature Medicine. 12 (8), 895-904 (2006).
  5. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  6. Eckhardt, B. L., Francis, P. A., Parker, B. S., Anderson, R. L. Strategies for the discovery and development of therapies for metastatic breast cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (6), 479-497 (2012).
  7. Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
  8. Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
  9. Schoenenberger, C. A., et al. Targeted c-myc gene expression in mammary glands of transgenic mice induces mammary tumours with constitutive milk protein gene transcription. EMBO Journal. 7 (1), 169-175 (1988).
  10. Nusse, R., Varmus, H. E. Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome. Cell. 31 (1), 99-109 (1982).
  11. Muller, W. J., Sinn, E., Pattengale, P. K., Wallace, R., Leder, P. Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenic mice bearing the activated c-neu oncogene. Cell. 54 (1), 105-115 (1988).
  12. Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. American Journal of Pathology. 163 (5), 2113-2126 (2003).
  13. Green, J. E., et al. The C3(1)/SV40 T-antigen transgenic mouse model of mammary cancer: ductal epithelial cell targeting with multistage progression to carcinoma. Oncogene. 19 (1), 1020-1027 (2000).
  14. Iorns, E., et al. A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis. PloS One. 7 (10), 47995 (2012).
  15. Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (3), 443-447 (2010).
  16. Mariotto, A. B., Etzioni, R., Hurlbert, M., Penberthy, L., Mayer, M. Estimation of the Number of Women Living with Metastatic Breast Cancer in the United States. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention. 26 (6), 809-815 (2017).
  17. Xiao, W., et al. Risk factors and survival outcomes in patients with breast cancer and lung metastasis: a population-based study. Cancer Medicine. 7 (3), 922-930 (2018).
  18. Smid, M., et al. Subtypes of breast cancer show preferential site of relapse. Cancer Research. 68 (9), 3108-3114 (2008).
  19. Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
  20. Soni, A., et al. Breast cancer subtypes predispose the site of distant metastases. American Journal of Clinical Pathology. 143 (4), 471-478 (2015).
  21. Leone, B. A., et al. Prognostic impact of metastatic pattern in stage IV breast cancer at initial diagnosis. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (3), 537-548 (2017).
  22. Pei, X. F., et al. Explant-cell culture of primary mammary tumors from MMTV-c-Myc transgenic mice. In Vitro Cellular and Developmental Biology: Animal. 40 (1-2), 14-21 (2004).
  23. Mathsyaraja, H., et al. CSF1-ETS2-induced microRNA in myeloid cells promote metastatic tumor growth. Oncogene. 34 (28), 3651-3661 (2015).
  24. Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).
  25. La Perle, K. M. D. Comparative Pathologists: Ultimate Control Freaks Seeking Validation. Veterinary Pathology. 56 (1), 19-23 (2019).
  26. Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
  27. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes and Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
  28. Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical and Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
  29. Yang, Y., et al. Immunocompetent mouse allograft models for development of therapies to target breast cancer metastasis. Oncotarget. 8 (19), 30621-30643 (2017).
  30. Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia. Laboratory Animals. 53 (2), 190-201 (2019).
  31. Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
  32. Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 75 (4), 344-355 (2009).
  33. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  34. Wright, L. E., et al. Murine models of breast cancer bone metastasis. BoneKEy Reports. 5, 804 (2016).
  35. Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
  36. Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
  37. Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
  38. Brown, D. L. Practical Stereology Applications for the Pathologist. Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).
  39. Aeffner, F., et al. Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 159، حقن الوريد الذيل، سرطان الثدي، انبثاث الرئة، أقسام H & E الملطخة، علم الأمراض الرقمي الكمي، تحليل الصور

Erratum

Formal Correction: Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/02/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. The author list was updated.

The author list was updated from:

Katie A. Thies1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

to:

Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

التحليل المرضي لنقائل الرئة بعد الحقن الجانبي الوريد الذيل من الخلايا السرطانية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh,… More

Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. J. Vis. Exp. (159), e61270, doi:10.3791/61270 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter