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Cancer Research

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Published: May 20, 2020 doi: 10.3791/61270
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center, 2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

ERRATUM NOTICE

Summary

Die intravenöse Injektion von Krebszellen wird häufig in der Metastasenforschung eingesetzt, aber die metastasierende Tumorbelastung kann schwer zu analysieren sein. Hierin demonstrieren wir ein Schwanzvenen-Injektionsmodell der Metastasierung und beinhalten einen neuartigen Ansatz zur Analyse der resultierenden metastasierenden Lungentumorbelastung.

Abstract

Metastasen, die Hauptursache für Morbidität und Mortalität bei den meisten Krebspatienten, können bei Mäusen präklinisch zu modellieren sein. Es stehen nur wenige spontane Metastasenmodelle zur Verfügung. Somit ist das experimentelle Metastasenmodell mit Tail-Vein-Injektion geeigneter Zelllinien eine tragende Säule der Metastasenforschung. Wenn Krebszellen in die laterale Schwanzvene injiziert werden, ist die Lunge ihr bevorzugter Ort der Kolonisation. Eine mögliche Einschränkung dieser Technik ist die genaue Quantifizierung der metastasierenden Lungentumorbelastung. Während einige Forscher Makrometastasen einer vordefinierten Größe zählen und / oder Mikrometastasen nach dem Schneiden des Gewebes einschließen, bestimmen andere den Bereich der metastatischen Läsionen relativ zum normalen Gewebebereich. Beide Quantifizierungsmethoden können äußerst schwierig sein, wenn die metastatische Belastung hoch ist. Hierin demonstrieren wir ein intravenöses Injektionsmodell der Lungenmetastasierung, gefolgt von einer fortschrittlichen Methode zur Quantifizierung der metastasierenden Tumorbelastung unter Verwendung von Bildanalysesoftware. Dieser Prozess ermöglicht die Untersuchung mehrerer Endpunktparameter, einschließlich der durchschnittlichen Metastasengröße, der Gesamtzahl der Metastasen und des gesamten Metastasenbereichs, um eine umfassende Analyse zu ermöglichen. Darüber hinaus wurde diese Methode von einem Veterinärpathologen überprüft, der vom American College of Veterinary Pathologists (SEK) zertifiziert wurde, um die Genauigkeit zu gewährleisten.

Introduction

Obwohl es sich um einen hochkomplexen und ineffizienten Prozess1 handelt, trägt die Metastasierung wesentlich zur Morbidität und Mortalität von Krebspatienten bei2. Tatsächlich werden die meisten krebsbedingten Todesfälle auf die metastasierende Ausbreitung der Krankheit zurückgeführt3,4. Damit Tumorzellen erfolgreich metastasieren können, müssen sie sich von der primären Stelle lösen, durch angrenzendes Stroma eindringen, in den Blutkreislauf oder die Lymphgefäße intravasieren, zum Kapillarbett einer sekundären Stelle wandern, in das Sekundärgewebe extravasieren und sich vermehren oder wachsen, um metastasierende Läsionen zu bilden5. Die Verwendung von Mausmodellen war entscheidend für das Verständnis der molekularen Mechanismen, die für metastatische Aussaat und Wachstum verantwortlich sind6,7. Dabei konzentrieren wir uns auf die Metastasierung von Brustkrebs, für die häufig sowohl gentechnisch veränderte Mausmodelle als auch Transplantationsmethoden eingesetzt werden – jede mit ihren eigenen Vorteilen und Einschränkungen.

Gentechnisch veränderte Brusttumormodelle nutzen brustdrüsenspezifische Promotoren, einschließlich MMTV-LTR (Mouse Mammary Tumor Virus Long Terminal Repeat) und WAP (Whey Acidic Protein), um die Expression von Transgenen im Brustepithel zu steuern8. Onkogene einschließlich Polyom mittleres T-Antigen (PyMT), ErbB2 / Neu, c-Myc, Wnt-1 und Affenvirus 40 (SV40) wurden auf diese Weise exprimiert9,10, 11, 12, 13, und während diese genetischen Modelle für die Untersuchung der Primärtumorinitiation und -progression nützlich sind, metastasieren nur wenige leicht in entfernte Organe. Darüber hinaus sind diese genetischen Mausmodelle oft zeit- und kostenintensiver als spontane oder experimentelle Metastasierungsmodelle. Angesichts der Beschränkung der meisten gentechnisch veränderten Brusttumormodelle auf die Untersuchung von Metastasen sind Transplantationstechniken zu attraktiven Methoden geworden, um diesen komplexen Prozess zu untersuchen. Dazu gehören orthotope, Schwanzvenen-, intrakardiale und intrakranielle Injektion geeigneter Zelllinien.

Obwohl mehrere Brustkrebszelllinien nach orthotopischer Injektion in das Brustfettpolster leicht metastasieren14,15, kann die Konsistenz und Reproduzierbarkeit der metastasierenden Tumorbelastung eine Herausforderung darstellen, und die Dauer solcher Studien kann in der Größenordnung von mehreren Monaten liegen. Insbesondere zur Beurteilung der Lungenmetastasierung ist die intravenöse Injektion in die Schwanzvene oft eine reproduzierbarere und zeiteffektivere Methode, wobei die metastatische Ausbreitung typischerweise innerhalb weniger Wochen auftritt. Da das intravenöse Injektionsmodell jedoch die ersten Schritte der metastatischen Kaskade umgeht, ist bei der Interpretation der Ergebnisse dieser Studien Vorsicht geboten. In dieser Demonstration zeigen wir die Schwanzveneninjektion von Brusttumorzellen zusammen mit einer genauen und umfassenden Analysemethode.

Obwohl die Forschungsgemeinschaft erhebliche Fortschritte beim Verständnis des komplexen Prozesses der Brustkrebsmetastasierung gemacht hat, wird geschätzt, dass derzeit über 150.000 Frauen an metastasierendem Brustkrebs leiden16. Von den Patienten mit Brustkrebs im Stadium IV haben >36% der Patientinnen Lungenmetastasen17; Das ortsspezifische Muster und die Inzidenz von Metastasen können jedoch je nach molekularem Subtyp variieren18,19,20,21. Patientinnen mit Brustkrebs-assoziierten Lungenmetastasen haben ein medianes Überleben von nur 21 Monaten, was die Notwendigkeit unterstreicht, wirksame Behandlungen und neuartige Biomarker für diese Krankheit zu identifizieren17. Die Verwendung experimenteller Metastasierungsmodelle, einschließlich der intravenösen Injektion von Tumorzellen, wird unser Wissen über diese wichtige klinische Herausforderung weiter voranbringen. In Kombination mit der digitalen Bildgebungspathologie und der in diesem Protokoll beschriebenen Methode der metastasierenden Lungentumorlastanalyse sind Schwanzveneninjektionen ein wertvolles Werkzeug für die Brustkrebsmetastasenforschung.

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Protocol

Die Tierverwendung folgte den Vorschriften der University Laboratory Animal Resources (ULAR) im Rahmen des vom OSU Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigten Protokolls 2007A0120-R4 (PI: Dr. Gina Sizemore).

1. Schwanzveneninjektion von Brustkrebszellen

  1. Vorbereitung von Zellen und Spritze zur Injektion
    1. Platten Sie eine geeignete Anzahl von Zellen basierend auf der Anzahl der Mäuse und der zu verwendenden Zellkonzentration.
      HINWEIS: Die Anzahl der injizierten Zellen und die Zeit bis zur Entwicklung von Metastasen hängen von der verwendeten Zelllinie ab und müssen optimiert werden. In dieser Demonstration werden 1 x 106 MDA-MB-231-Zellen intravenös in NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) -Mäuse injiziert, und makroskopische Lungenläsionen werden spätestens 24 Tage nach der Injektion beobachtet. Für die murine Brusttumorzelllinie MVT111 werden 3 x 106 Zellen in immunkompetente FVB/N-Mäuse injiziert, wobei zahlreiche Lungenmetastasen bis 14 Tage beobachtet wurden22,23.
    2. Medien absaugen und Zellplatten mit 1x PBS spülen. Trypsinisieren Sie Zellen in minimalem Volumen, fügen Sie ein geeignetes Medienvolumen hinzu und zählen Sie Zellen mit einem Hämatozytometer oder einer anderen bevorzugten Methode. Trypanblau (0,4%) oder andere lebende / tote Zellfarbstoffe können verwendet werden, um lebensfähige Zellzahlen zu bestimmen.
    3. Pelletzellen durch Spinnen bei 180 x g für 5 min.
    4. Resuspendieren Sie eine angemessene Anzahl von Zellen in sterile 1x PBS, so dass ein Volumen von 100 μL pro Maus injiziert wird. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis, um die Lebensfähigkeit zu erhalten.
    5. Vor der Injektion die Zellen gründlich mit einer 200 μL oder 1 ml Pipette resuspendieren, um eine Verklumpung zu vermeiden. 100 μL in einer 28 G Insulinspritze aufziehen (siehe Materialtabelle).
    6. Beseitigen Sie Luftblasen, indem Sie die Spritze vertikal halten, auf die Spritze klopfen und den Kolben langsam einstellen. Die Injektion von Luftblasen in die Vene verursacht wahrscheinlich eine Luft- / Gasembolie, die tödlich sein kann.
  2. Seitliche Schwanzveneninjektion
    HINWEIS: Für experimentelle Brustkrebs-Metastasen-Assays werden Injektionen an > 6 Wochen alten weiblichen Mäusen durchgeführt.
    1. Halten Sie die Maus am Schwanz und schieben Sie das Tier in ein geschlitztes Röhrchen/Rückhaltesystem einer geeigneten Größe (siehe Materialtabelle für die verwendete Rückhalteeinrichtung).
    2. Setzen Sie den Steckerteil der Rückhaltevorrichtung ein und positionieren Sie die Maus auf der Seite, so dass ihre seitliche Schwanzvene gut sichtbar ist. Die Maus hat eine ventrale Arterie in Linie mit den Genitalien, eine dorsale Vene und zwei laterale Kaudalvenen.
    3. Reinigen Sie die Oberfläche des Schwanzes der Maus mit einem aseptischen Tuch. Fassen Sie den Schwanz zwischen Zeigefinger und Daumen mit nicht dominanter Hand und üben Sie leichte Spannung aus.
    4. Beginnend am distalen Teil des Schwanzes, führen Sie die Nadel parallel zur Vene mit dem Fasenende ein.
    5. Wenn erlaubt, rekapitulieren Sie die Nadel vorsichtig und biegen Sie sie in einen Winkel von 20-30 °. Ein Einhand-Annäherungs- oder Nadelrückgewinnungsgerät wird dringend empfohlen.
      HINWEIS: Es ist nicht notwendig zu aspirieren, da dies zum Kollaps der Vene führen kann. Ein kleiner Blutschnaps kann jedoch beim ersten Platzieren gesehen werden. Die Nadel wird bei richtiger Platzierung sanft in die Vene vordringen.
    6. Geben Sie langsam das gesamte Volumen in die Vene ab. Es sollte keinen Widerstand geben, wenn der Kolben gedrückt wird.
    7. Wenn ein Widerstand zu spüren ist, entfernen Sie sofort die Spritzennadel. Falls erforderlich, führen Sie die Nadel erneut ein (idealerweise nicht mehr als 3 Versuche), die sich in Richtung des proximalen Endes des Schwanzes oder der gegenüberliegenden lateralen Vene bewegt.
    8. Ein kleines Blutvolumen wird wahrscheinlich nach der Injektion verdrängt. Mit steriler Gaze sanften Druck ausüben und mit aseptischem Tuch abwischen.
    9. Entsorgen Sie die Spritze umgehend in einem geeigneten Behälter für scharfe Gegenstände.
    10. Bringen Sie die Maus in einen sauberen, belüfteten Käfig zurück und überwachen Sie sie auf Anzeichen von Stress.
    11. Überwachen Sie Mäuse 2-3x / wöchentlich auf Anzeichen von Metastasenbildung (Atemnot, gebeugte Haltung, Gewichtsverlust) und allgemeiner Belastung. Die Zeit bis zur Entwicklung der Metastasierung hängt von der Zelllinie und dem Mausstamm ab.
    12. Wenn Sie ein In-vivo-Live-Tier-Bildgebungsgerät verwenden, bilden Sie Mäuse unmittelbar nach der Schwanzveneninjektion ab, um die erfolgreiche Injektion von Zellen zu bestätigen und Zeitdaten "Null" zu erhalten (spezifische Details zur In-vivo-Biolumineszenzbildgebung sind hierin nicht enthalten, werden aber von Yang et al.24 beschrieben).

2. Lungengewebefixierung und Analyse der metastasierenden Lungentumorbelastung

  1. Lungengewebeaufblähung zur Aufrechterhaltung des Strukturformats der Lunge für die Histopathologie
    1. Nachdem genehmigte Euthanasieverfahren (z.B. Kohlendioxid bei 30 - 70% Verschiebung des Kammervolumens/min) befolgt wurden, befestigen Sie den Mauskadaver mit Stiften an einer Seziertafel. Sprühen oder tragen Sie 70% Ethanol auf, um das Fell der Maus während der Dissektion aus dem Weg zu halten.
      HINWEIS: Kohlendioxiderstickung kann Lungenblutungen als erwartete Hintergrundläsion verursachen, insbesondere bei langsameren Flussraten.
    2. Öffnen Sie den Thorax mit einem Mittellinienschnitt, strecken Sie den Schnitt kranial / kaudal durch das Peritoneum und schneiden Sie das Zwerchfell weg, indem Sie den Xyphoidfortsatz greifen.
    3. Verwenden Sie eine separate Schere, um die Klingen nicht abzustumpfen, schneiden Sie die Rippen entlang jeder Seite des Brustbeins ab und entfernen Sie vorsichtig den Brustkorb, damit sich die Lunge ausdehnen kann.
    4. Isolieren Sie die Luftröhre, indem Sie submandibuläre Speicheldrüsen und infrahyoidale Muskulatur entfernen. Das Platzieren von Stiften auf beiden Seiten der Luftröhre kann unerwünschte Bewegungen während des Einführens der Nadel verhindern.
    5. Füllen Sie eine 26 G Spritze mit 2-3 ml 10% neutralem gepuffertem Formalin und geben Sie sie in die Luftröhre.
    6. Injizieren Sie langsam Formalin und achten Sie darauf, dass sich die Lunge ausdehnt (erfordert normalerweise ~ 1,5 ml Formalin).
    7. Sobald Formalin aus der Lunge austritt (übermäßiges Aufblasen vermeiden), drücken Sie die Luftröhre mit einer Pinzette ab, entfernen Sie die Spritzennadel und lösen Sie den gesamten Atemweg. Legen Sie Lunge, Herz usw. direkt in Formalin, da ein zusätzliches Trimmen des Gewebes nach der Fixierung erfolgen kann.
    8. Komplette Verarbeitung, Einbettung, Schnitt des Gewebes und Hämatoxylin- und Eosin (H & E) -Färbung mit Standardmethoden.
  2. Analyse der metastasierenden Lungentumorbelastung
    1. Scannen Sie H&E-gefärbte Lungenschnitte auf einem hochauflösenden Diascanner mit 40-facher Vergrößerung (Abbildung 3).
    2. Importieren Sie Bilder in bildanalytische Software (z.B. Visiopharm Image Analysis) zur Quantifizierung von Lungenmetastasen.
      HINWEIS: Wir empfehlen neuen Benutzern, entweder eine Vor-Ort- oder Online-Schulung zur Verwendung der Bildanalysesoftware zu erhalten. Zahlreiche Webinare sind auch über die kommerzielle Webseite verfügbar.
    3. Wählen Sie die Visiopharm 10118 H&E Lung Metastasis App aus der App-Bibliothek der Software aus.
      HINWEIS: Der Zweck dieser App ist es, Lungenmetastasen auf H & E-gefärbten Objektträgern zu kennzeichnen und zu quantifizieren. Im Rahmen der 10118 H&E Lung Metastasis App segmentiert der erste Bildverarbeitungsschritt das Lungengewebe mit der Tissue Detection App. Der zweite Bildverarbeitungsschritt nutzt die Metastasis Detect App, die die Metastasen im Lungengewebe identifiziert. Metastasen werden über die Form identifiziert, zusammen mit Regionen, die entweder zu unförmig, zu rot oder zu spärlich sind, um als Metastasen identifiziert zu werden.
    4. Passen Sie die Parameter, die Form und Kargheit definieren, an repräsentative Bilder an. Segmentierte Bereiche von Tumormetastasen und normalem Lungengewebe können mit unterschiedlichen Farbmarkierungen für jeden Gewebetyp dargestellt werden.
      HINWEIS: Für den Fall, dass die App Metastasen nicht genau vom normalen Lungengewebe trennen kann, muss möglicherweise eine benutzerdefinierte App mit dem Visiopharm Decision Forest-Programm geschrieben werden, wie es für die Experimente getan wurde (siehe Abbildung 2 und Abbildung 3). Details zum Schreiben eines benutzerdefinierten Algorithmus folgen unten. Fahren Sie andernfalls mit Schritt 2.2.9 fort.
    5. Öffnen Sie das Decision Forest-Programm, das funktioniert, indem sie mehrere Klassen [z. B. Lungengewebe (nicht neoplastisch), Metastasen, rote Blutkörperchen, Epithel und / oder Leerraum] auf einem gewünschten Bild trainieren. In Abbildung 2 sind Tumormetastasen blau, normales Gewebe grün und bronchiolares Epithel gelb. Auch rote Blutkörperchen sind in rot und Lufträume in rosa.
    6. Befolgen Sie die aufgeforderte Reihe von Ja- oder Nein-Fragen, um jede Klasse für ein Bild entsprechend zu trainieren. Die Genauigkeit des Algorithmus bestimmt die Anzahl der Ja/Nein-Fragen. Für die Analyse wurde der benutzerdefinierte Algorithmus/die App mit einer Genauigkeit von 50 (Bereich 0-100) geschrieben.
    7. Passen Sie Features für jede Klasse an, indem Sie Filter zum Schärfen, Verwischen, Sortieren nach Form usw. anwenden, um die Genauigkeit des Algorithmus / der App zu verbessern. Visiopharm zeigt jede Klasse durch eine oder mehrere Linsen an, die als Features bezeichnet werden. Features ändern, wie die Klasse das Bild sieht, um bestimmte Farben oder Intensitäten hervorzuheben.
      HINWEIS: Für den benutzerdefinierten Algorithmus werden Metastasen mit einer Größe von 8500 μm2 und mehr als Metastasen markiert und gemessen. Dies erklärt Größenvarianzen und Metastasen, die zu klein sind, um sie zu erkennen. Kleine unförmige Bereiche und kleine metastatische Bereiche unter 8500 μm2 wurden in die normale Gewebequantifizierung einbezogen.
    8. Speichern Sie die geänderten Einstellungen entweder in der App oder im benutzerdefinierten Algorithmus und wenden Sie dann den Algorithmus / die App auf einen ganzen Satz oder eine Reihe von H & E-gefärbten Geweben an.
    9. Exportieren Sie schließlich alle Ausgabevariablen, einschließlich der in Tabelle 1 aufgeführten Variablen. Die Fläche in Mikrometern zum Quadrat (μm2) kann für jeden Gewebetyp quantifiziert werden, und die Prozentsätze werden aus der gesamten Nettogewebefläche der Probe (d. H. Gesamtgewebe minus Luftraum) abgeleitet.
    10. Wenn Sie einen benutzerdefinierten Algorithmus erstellen, überprüfen Sie die Gewebemarkierungen in Absprache mit einem vom American College of Veterinary Pathologists zertifizierten Veterinärpathologen, um genaue Messungen sicherzustellen und zwischen Gewebetypen zu unterscheiden.

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Representative Results

Wenn nicht markierte Zellen für die Injektion von Schwanzvenen verwendet werden, kann es schwierig sein, die Lungenkolonisation bis (1) zum Zeitpunkt der Nekropsie zu bestätigen, wenn Makrometastasen beobachtet werden können, oder (2) nach einer histologischen Analyse, wenn mikroskopische Metastasen vorliegen. Bei ausgedehnter metastasierender Lungentumorbelastung haben Mäuse Atembeschwerden. Wie bei jeder Tumorstudie sollten Mäuse während der gesamten Studiendauer sorgfältig überwacht werden. Die Verwendung von markierten Zellen ist eine einfache Möglichkeit, eine erfolgreiche Schwanzveneninjektion zu bestätigen; daher die Verwendung von Luciferase-markierten MDA-MB-231-Zellen in der Demonstration. Die In-vivo-Bildgebung ist jedoch nicht immer möglich oder notwendig, abhängig vom experimentellen Design und anderen Faktoren. Abbildung 1A zeigt das Biolumineszenzsignal im Brustraum weniger als 2 Stunden nach der Tailveneninjektion von Luciferase-markierten MDA-MB-231-Zellen als Bestätigung der genauen Injektion. Für dieses Experiment nehmen die Photonenzahlen in der Thoraxregion im Laufe der Zeit zu und ein starkes Biolumineszenzsignal ist am Tag 24 nach der Injektion vorhanden (Abbildung 1B und C; beachten Sie die Änderung des Skalenbalkens). Zum Zeitpunkt der Nekropsie wurden bei diesen Mäusen viele makroskopische Lungenläsionen beobachtet (Abbildung 1D).

Nach ordnungsgemäßer Gewebeverarbeitung und Färbung können H & E-gefärbte Lungenabschnitte gescannt oder abgebildet werden. Die Quantifizierung der metastasierenden Lungentumorbelastung kann mit Einer Bildanalysesoftware und einem benutzerdefinierten Algorithmus effektiv erreicht werden. Mit dem angepassten Algorithmus wird das gesamte Lungengewebe nach verschiedenen Gewebemerkmalen segmentiert (Abbildung 2A und B). Durch diese Segmentierung des Lungengewebes kann die Software die verschiedenen in Tabelle 1 aufgeführten Parameter quantifizieren. Diese Analyse wurde an Lungengewebe von Mäusen durchgeführt, denen MDA-MB-231-Zellen injiziert wurden, gefolgt von einer Behandlung mit einem Medikament zur Blockierung der metastatischen Kolonisation oder einer Vehikelkontrolle (DMSO). Die Rohdaten aus dieser Analyse sind in Tabelle 2 dargestellt. Darüber hinaus zeigt Abbildung 3A repräsentative H&E-Bilder von MDA-MB-231-Lungenmetastasen von ENTWEDER DMSO oder medikamentenbehandelten Mäusen. Während ein Unterschied in der metastasierenden Tumorbelastung zwischen diesen Behandlungsgruppen leicht übersehen wurde, da die Gesamtzahl der Lungenknötchen nicht unterschiedlich ist, zeigt eine umfassende Analyse aller Parameter einen signifikanten Unterschied im prozentualen Netto-Lungenmetastasenbereich (Abbildung 3B, C). Dies unterstreicht die Notwendigkeit eines umfassenden und gründlichen Ansatzes zur Analyse der metastasierenden Lungentumorbelastung wie der hierin beschriebenen Methode.

Für die in Abbildung 3 dargestellten Daten wurden alle statistischen Analysen mit GraphPad Prism 7 durchgeführt. Die Daten wurden als normalverteilt betrachtet, wenn einer der folgenden Standardnormalitätstests bestanden wurde: D'Agostino-Pearson Omnibus, Shapiro-Wilk und Kolmogorov-Smirnov. Der Vergleich zwischen dem Fahrzeug und den mit Drogen behandelten Gruppen (Abbildung 3) wurde durch einen ungepaarten zweiseitigen Student's t-Test durchgeführt. Die statistische Signifikanz wurde bei P ≤ 0,05 ermittelt.

Figure 1
Abbildung 1: In-vivo-Biolumineszenzbestätigung einer erfolgreichen Schwanzveneninjektion.
(A) Repräsentatives Biolumineszenzsignal bei Mäusen 1 Stunde nach Der Injektion von Luciferase-markierten MDA-MB-231-Zellen. (B) Repräsentatives Biolumineszenzsignal in derselben Gruppe von Mäusen wie (A) 24 Tage nach der Injektion von Luciferase-markierten MDA-MB-231-Zellen. [Beachten Sie die Änderung des Maßstabsbalkens zwischen (A) und (B)]. (C) Quantifizierung der Photonenzahl im Zeitverlauf bei MDA-MB-231-Schwanzvenen-injizierten Mäusen. ± (n = 8 Mäuse) (D) Repräsentative nicht tumortragendes Lungengewebe (rechts) und MDA-MB-231 Makrometastasen in der Lunge (links) zum Zeitpunkt der Nekropsie. Maßstabsbalken = 50 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Gewebesegmentierung mit der Visiopharm-Software.
(A) Repräsentative Ausschnitte von nicht segmentierten und segmentierten Gewebemarkierungen unter Verwendung des kundenspezifischen Softwarealgorithmus. (B) Legende für alle Gewebekategorien, die mit Software segmentiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative metastasierende Lungentumorbelastungsanalyse von H&E-gefärbten Geweben.
(A) Repräsentative H&E-Färbung von Lungengewebe von nicht injizierten Mäusen und Kontrollmäusen (DMSO) und medikamentenbehandelten Mäusen nach Tail-Vein-Injektion von MDA-MB-231-Zellen. Repräsentative Tumormetastasen sind mit Pfeilen gekennzeichnet. Maßstabsbalken = 500 μm für 4-fache Vergrößerung und 200 μm für 10-fache Vergrößerung. (B) Grafik des prozentualen Netto-Lungenmetastasierungsbereichs der Kontrolle und der medikamentös behandelten Mäuse. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SD dar. (*) P = 0,022 durch den t-Test des Schülers. (C) Tabelle zur Zusammenfassung der metastasierenden Lungentumorbelastungsanalyse (n = 9 DMSO; n = 9 medikamentös behandelt). Nach der Überprüfung der Normalverteilung der Daten wurden alle P-Werte in der Tabelle durch einen ungepaarten, zweiseitigen Student's t-Test bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Parameter Beschreibung
Gesamtgewebefläche (μm2) Fläche in quadratischen Mikrometern einschließlich aller Tumormetastasen, normale Lunge und Bereiche der roten Blutkörperchen.
Anzahl der Metastasen Gesamtzahl der Metastasen im Lungengewebe.
Prozentsatz der Metastasenfläche (μm2) Gesamtmetastasenfläche geteilt durch Nettogewebefläche x 100.
Gesamtgewebe + Leerraumfläche (μm2) Fläche in quadratischen Mikrometern einschließlich des gesamten Gewebes und des Weißraums.
Nettogewebefläche (μm2) Gewebebereich in quadratischen Mikrometern (Mets und normale Lunge) ohne Weißraum und rote Blutkörperchen.
Gesamtfläche der Metastasen (μm2) Gesamtmetastasenfläche in quadratischen Mikrometern, wie durch die Entscheidungswaldalgorithim segmentiert.
Mittlere Metastasenfläche (μm2) Mittlere (durchschnittliche) Fläche in quadratischen Mikrometern von Metastasen innerhalb jedes Bildes.
Medianer Metastasenbereich (μm2) Medianer Metastasenbereich in quadratischen Mikrometern. Eine gleiche Anzahl von Metastasen fällt unter diesen Wert und eine gleiche Anzahl von Metastasen ist größer als der Medianwert.

Tabelle 1: Mit Software gemessene Parameter. Liste der Parameter zusammen mit einer Beschreibung jeder Messung, die mit dem benutzerdefinierten Algorithmus berechnet wird.

Gleiten Anzahl der Metastasen Prozentsatz der Metastasenfläche (μm2) Gesamtgewebe + Leerraumfläche (μm2) Leerraum insgesamt (μm2) Nettogewebefläche (μm2) Gesamtfläche der Metastasen (μm2) Fläche der roten Blutkörperchen (μm2) Mittlere Metastasenfläche (μm2) Medianer Metastasenbereich (μm2)
171 Lungenrutsche 1 435 8.90 185698000 83201800 92031400 8189250 10464800 18825.86 14748.73
171 Lungenrutsche 2 323 8.37 185698000 83201800 92054740 7708990 10441460 23866.84 14748.73
172 Lungenrutsche 1 151 2.73 181546000 89509904 81571296 2225220 10464800 14736.56 12486.37
172 Lungenrutsche 2 142 2.60 170708000 81735504 80558196 2093040 8414300 14739.72 12119.62
173 Lungenrutsche 1 634 11.60 234104992 102153000 115606692 13406800 16345300 21146.37 15472.22
173 Lungenrutsche 2 667 12.70 223180992 86778600 122374592 15542700 14027800 23302.40 16531.00
174 Lungenrutsche 1 40 0.55 192452992 80340896 87591096 485121 24521000 12128.03 10484.05
174 Lungenrutsche 2 34 0.51 183918000 71287904 91242796 464830 21387300 13671.47 11181.81
175 Lungenrutsche 1 780 23.93 179544992 44799200 126995782 30388600 7750010 38959.74 19307.76
175 Lungenrutsche 2 1001 12.58 169191536 43425608 120610754 15169100 5155174 15153.95 19703.08
188 Lungenrutsche 1 569 13.20 162290000 54210000 98486310 12997300 9593690 22842.36 14463.91
188 Lungenrutsche 2 271 5.15 157146000 54250800 91996500 4738100 10898700 17483.76 12657.83
189 Lungenrutsche 1 74 1.70 185292992 95700800 77779392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
189 Lungenrutsche 2 74 1.76 182272992 95700800 74759392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
816 Lungenrutsche 1 246 5.65 185876000 87568896 81916204 4631050 16390900 18825.41 14371.99
816 Lungenrutsche 2 565 6.05 183220000 76954304 90305396 5462670 15960300 9668.44 14244.82
876 Lungenrutsche 1 468 10.36 208308000 99300096 100947064 10454500 8060840 22338.68 16011.37
876 Lungenrutsche 2 528 11.74 199750896 81642568 110450391 12963400 7657937 24551.89 16699.13
877 Lungenrutsche 1 732 17.98 219340992 99918600 107869992 19397100 11552400 26498.77 18137.52
877 Lungenrutsche 2 605 14.64 207925504 88539712 108168329 15839700 11217463 26181.32 18014.64
878 Lungenrutsche 1 377 10.05 178534000 85610896 81931104 8232340 10992000 21836.45 16671.03
878 Lungenrutsche 2 376 9.88 170544000 75337904 86108406 8511710 9097690 22637.53 16754.38
879 Lungenrutsche 1 205 5.22 167556000 89999000 68123630 3553860 9433370 17335.90 13845.69
879 Lungenrutsche 2 213 4.64 167931008 80789400 78489588 3638720 8652020 17083.19 14058.12
881 Lungenrutsche 1 1122 38.81 218880000 79713504 130893816 50802300 8272680 45278.34 22044.99
881 Lungenrutsche 2 628 21.67 184200992 74502600 99122692 21475200 10575700 34196.18 19857.40
882 Lungenrutsche 1 678 24.05 194476992 83941904 98484788 23684500 12050300 34932.89 20748.06
882 Lungenrutsche 2 645 21.93 185537040 75790040 101412430 22241700 8334570 34483.26 20325.11
883 Lungenrutsche 1 429 10.79 179400992 84955696 84699866 9138800 9745430 21302.56 15080.23
883 Lungenrutsche 2 342 85.30 175220992 76210896 90472386 77170200 8537710 225643.86 17078.26
884 Lungenrutsche 1 359 6.42 206751008 87752600 103825008 6669710 15173400 18578.58 14333.41
884 Lungenrutsche 2 480 9.12 200990000 77052496 111060804 10125700 12876700 21095.21 15679.88
885 Lungenrutsche 1 332 7.79 191398000 92896304 84752596 6605490 13749100 19896.05 14500.11
885 Lungenrutsche 2 537 81.02 187475008 85938000 89378408 72411104 12158600 134843.77 15360.29
886 Lungenrutsche 1 305 7.93 158435008 80433296 76541662 6068720 1460050 19897.44 14500.11
886 Lungenrutsche 2 898 8.84 155460000 70808600 83457470 7380490 1193930 8218.81 14744.92

Tabelle 2: Repräsentative Ergebnistabelle. Tabelle der Ergebnisse für jeden Parameter des Algorithmus aus einer Kohorte von Mäusen Schwanzvene injiziert mit MDA-MB-231 Zellen.

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Discussion

Da die Forscher weiterhin die intravenöse Injektion von Tumorzellen als experimentelles Modell für die Metastasierung verwenden, fehlen Standardpraktiken zur Analyse der resultierenden metastasierenden Tumorbelastung. In einigen Fällen können signifikante Unterschiede in der metastasierenden Tumorbelastung bei Manipulation bestimmter Zelllinien und/oder Verwendung chemischer Verbindungen makroskopisch beobachtet werden. In anderen Fällen können jedoch subtile Unterschiede in der metastatischen Aussaat und im Wachstum ohne gründliche pathologische Analyse übersehen oder falsch interpretiert werden. Diese Studie erweitert zuvor veröffentlichte Schwanzvenen-Injektionsprotokolle, indem sie eine umfassende Methode der metastasierenden Lungentumorlastanalyse einschließt. Wichtig ist, dass diese Methode der digitalen Pathologieanalyse auch auf die Quantifizierung der lungenmetastasierenden Tumorbelastung nach orthotoper Injektion von Tumorzellen, die zu spontaner Metastasierung fähig sind, sowie auf andere experimentelle Metastasierungsmodelle (z. B. intrakardiale usw.) und patientenabgeleitete Xenograft-Modelle (PDX) angewendet werden kann. Der Einsatz digitaler Bildgebung und der Entwicklung von Softwarealgorithmen durch Veterinärpathologen gewährleistet die Reproduzierbarkeit, Genauigkeit und Gründlichkeit dieses Ansatzes zur Analyse der metastasierenden Lungentumorbelastung25.

Eine durchdachte Entscheidung über Zelllinien, Zellkonzentration und Endpunkte, die entweder auf zuvor veröffentlichten Studien oder einer sorgfältigen experimentellen Optimierung basieren, ist absolut notwendig. Angesichts der Tatsache, dass metastasierende Aussaat und Kolonisation stark von Interaktionen mit verschiedenen Immunzellpopulationen abhängen26,27, ist der Einsatz immunkompetenter Mäuse ideal, wenn auch nicht immer machbar. Aus dem gleichen Grund ist die Interpretation experimenteller Metastasierungsstudien mit athymischen oder NSG-Mäusen, denen wichtige Immunzellkomponenten fehlen, mit Vorsicht zu genießen. Es gibt mehrere Brusttumorzelllinien der Maus, einschließlich der in dieser Studie verwendeten MVT1-Zellen, die vom FVB/N-Mausstamm abgeleitet wurden22,28,29. Es gibt auch andere syngene Modelle. In Bezug auf die Zellkonzentration kann die Injektion einer großen Anzahl von Zellen die metastasierende Lungentumorbelastung stark beschleunigen und verstärken. Wenn die Lunge jedoch überfordert ist, kann es schwierig sein, einzelne metastatische Herde zu unterscheiden, und Embolien treten häufiger auf. Auch das Tail-Vein-Injektionsverfahren erfordert reichlich Übung und Training, bevor Injektionen sicher und / oder routinemäßig durchgeführt werden. Viele Institutionen bieten technische Schulungen an und können Mäuse für Übungszwecke zur Verfügung stellen. Die richtige Platzierung der Nadel und eine glatte Injektion sollten auf erfolg hindeuten; Für Trainings- / Übungszwecke kann der Evans Blue-Farbstoff jedoch verwendet werden, um die erfolgreiche Injektion zu bestimmen (1% in sterilem PBS). Die Extremitäten der Maus werden kurz nach der Injektion blau, aber das Tier sollte danach eingeschläfert werden.

Darüber hinaus kann die Bedeutung von Standard-Nekropsie- und Gewebeprobenahmetechniken zur Kontrolle und Vermeidung von Objektträgerartefakten, die das Scannen und Analysieren von Objektträgern durch die Bildanalysesoftware beeinträchtigen können, nicht genug betont werden. Die Aufblähung der Lunge zum Zeitpunkt der Nekropsie ist ein kritischer Schritt zur Aufrechterhaltung der Gewebeintegrität und verbessert die nachfolgende H & E-Färbung sowie die endgültige Analyse. Aus Gründen der Konsistenz mit der Auflösung und Reproduzierbarkeit wird empfohlen, alle Dias in einem Studiensatz mit demselben Objektiv zu scannen. In dieser Studie wurden alle Dias mit 40x gescannt, um die Genauigkeit der Algorithmuseinstellungen und die korrekte Identifizierung von Tumormetastasen zu gewährleisten, wenn sie auf analysierte Felder angewendet werden. Für jedes Objektträger wurden die gleichen Lungenlappen konsequent gescannt und für jede Maus analysiert. Es wird auch dringend empfohlen, dass ein Pathologe Gewebemarkierungen auf Genauigkeit des angewendeten Algorithmus überprüft und dass derselbe Algorithmus auf jeden Objektträger in einer Studie angewendet wird.

Das vorgestellte Protokoll kann je nach experimentellem Design, Benutzerpräferenzen und gewünschten Ergebnismessungen modifiziert werden. Eine solche Modifikation beinhaltet die Verwendung einer Anästhesie-Induktionskammer anstelle einer herkömmlichen Rückhaltevorrichtung für ein bewusstes Tier. In Bezug auf Tiergesundheit und Wohlbefinden ist keiner der beiden Ansätze dem anderen überlegen und jeder hat seine eigenen Vorteile und Einschränkungen30. Auch für schwarze oder braune Mäuse kann eine Lichtquelle oder ein Heizgerät benötigt werden, um die Schwanzadern zu visualisieren. Infrarotlampen oder ein Warmwasserbad können verwendet werden, um die Venen zu erweitern. Die Temperatur sollte jedoch sorgfältig überwacht werden. Darüber hinaus sind beleuchtete Rückhalteeinrichtungen sowie andere kommerzielle Versionen von Nagetierrückhalteeinrichtungen erhältlich. Einige Forscher bevorzugen Luer-Lok-Spritzen für Injektionen. Wir finden es schwieriger, Luftblasen mit Luer-Lok-Spritzen zu beseitigen, aber es ist eine Frage der Präferenz. Die Lebensfähigkeit der Zellen ist eine wichtige Überlegung für das Schwanzveneninjektionsverfahren, und daher sind genaue Zellzählungen sowie die Aufrechterhaltung der Zellen auf Eis vor der Injektion notwendige Schritte. Beim Vergleich der Lungenaussaat und der Besiedlung manipulierter Zelllinien ist es wichtig, unterschiede in der Zellgröße und Lebensfähigkeit vor der Injektion zu bestimmen, da diese die Interpretation der Ergebnisse erschweren können. Zelltod und/oder -schädigung können bei Verwendung einer Schmalspurnadel auftreten; Es wird jedoch nicht empfohlen, eine Nadel zu verwenden, die größer als 25 G ist, da sie dem Tier Schmerzen und Beschwerden bereiten kann.

Um zu validieren, dass Lungenläsionen durch injizierte Tumorzellen gebildet werden, kann eine Immunfärbung an Gewebeschnitten durchgeführt werden. Bei Verwendung menschlicher Zelllinien können humanspezifische Antikörper verwendet werden, um metastatische Läsionen zu erkennen. Alternativ können bei Verwendung von markierten Zelllinien (z. B. GFP) entsprechende Antikörper verwendet werden. Auch viele Brustkrebs-Zelllinien sind positiv für epitheliale Marker (dh Cytokeratine, E-Cadherin und EpCAM), aber Vorkenntnisse der Expression sind unerlässlich. Das Lungenepithel, das die Atemwege auskleidet, ist jedoch auch positiv für diese Marker und daher muss auch die Struktur berücksichtigt werden. Es kann Fälle geben, in denen die Entwicklung eines primären Lungentumors ausgeschlossen werden muss. Dazu kann die immunhistochemische Färbung für den Schilddrüsentranskriptionsfaktor-1 (TTF1) als Marker für das primäre Lungenadenokarzinom verwendet werden. Die TTF1-Färbung sollte von einem zertifizierten Pathologen beurteilt werden.

Hierin wurde ein benutzerdefinierter Algorithmus unter Verwendung eines Entscheidungswald-Klassifikationsalgorithmus geschrieben, da der etablierte Lungenmetastasenalgorithmus nicht für die genaue Erkennung von Metastasen mit unterschiedlicher Größe fein abgestimmt werden konnte. Dieser maßgeschneiderte Algorithmus ermöglicht komplexe Messungen, ermöglicht eine genaue Segmentierung von Metastasen nach Größe und unterstützt eine Größengrenze, so dass kleine unförmige Bereiche und normale Strukturen nicht falsch interpretiert werden und daher in den endgültigen Datensatz aufgenommen werden können. Wir gehen davon aus, dass dieser Algorithmus auf die meisten In-vivo-Lungenmetastasenstudien anwendbar sein wird, aber benutzer müssen möglicherweise die Einstellungen innerhalb der Software an ihre individuellen Studienbedürfnisse anpassen. Dieser Algorithmus dient jedoch als Plattform für Forscher, die die Lungenmetastasierung auf ähnliche Weise analysieren möchten. Es gibt viele verschiedene Optionen für Bildanalyseplattformen, bei denen der Zugriff oder die Verfügbarkeit, die Kosten und die Schulung sowie das Erfahrungsniveau die beste Plattform für die Nutzung diktieren36. Die Palette der Optionen umfasst kostenlose Plattformen wie QuPath und teurere, aber anspruchsvolleRe Plattformen wie Visiopharm. Es wird empfohlen, dass man sich mit einem Bildanalyse-Pathologie-Kern und Pathologen berät, wenn man entscheidet, welche Plattform für ein bestimmtes Forschungsprojekt verfügbar ist und am besten genutzt wird.

Spontane Maus-Brusttumormodelle (z.B. MMTV-PyMT) oder orthotope Brustfettpolster-Injektionsmethoden stellen das physiologisch relevanteste Modell für die Untersuchung von Lungenmetastasen dar. Ein schwerwiegender Nachteil des Schwanzveneninjektionsmodells besteht darin, dass es nicht die volle metastatische Kaskade rekapituliert und sich daher auf die Untersuchung der Tumorzellextravasation und der sekundären Organkolonisation beschränkt. Dieses experimentelle Metastasenmodell ist jedoch für die Brustkrebsforschung relevant, da Lungenmetastasen, die nach einer Schwanzveneninjektion gebildet werden, genomische Profile aufweisen, die metastasierenden Läsionen ähneln, die sich nach orthotopischer Implantation derselben Zellen entwickeln31. Um ein Lungenmetastasierungsmodell zu erstellen, wird oft eine große Anzahl von Zellen intravenös injiziert, die den Prozess der Metastasierung in Bezug auf Seeding, Immunreaktion und Ruhephase möglicherweise nicht genau darstellen. Basierend auf dem Kreislaufweg sind Lungenmetastasen auch am häufigsten bei der Injektion von Schwanzvenen32. Bei den meisten Brustkrebs-Zelllinien deuten veröffentlichte Berichte auf eine relativ geringe Inzidenz von Knochen-, Leber- oder Hirnmetastasen nach einer Schwanzveneninjektion hin7. Alternative experimentelle Metastasierungsmethoden wie intrakardiale, intratibiale, Pfortader- und intrakarotisäre Injektionen eignen sich besser für die Untersuchung von Metastasen an anderen Stellen33,34,35,36,37. Auch hier werden spontane Brusttumormodelle oder orthotopische Fettpolster-Injektionsmethoden bevorzugt, die alle Schritte der metastatischen Kaskade rekapitulieren. Probleme mit konsistenter metastasierender Tumorbelastung, Studiendauer und Anzahl der für solche Studien erforderlichen Tiere sind ein Nachteil. Die hier vorgestellte Methode der digitalen Pathologieanalyse kann jedoch auf Lungenmetastasen angewendet werden, die durch ein beliebiges spontanes oder experimentelles Metastasierungsmodell gebildet werden.

Die Analysemethode liefert auch bestimmte Einschränkungen wie die Subjektivität bei der Erstellung von Algorithmen. Obwohl die gesamte Objektträgerbildgebung die digitale Analyse eines gesamten Gewebeschnitts und aller Lungenlappen einer einzelnen Maus ermöglicht, beschränkt sie sich auf eine zweidimensionale Analyse eines 3D-Gewebes. Die Stereologie wird zu einer gängigen Praxis, die 3D-Informationen für die Bildanalyse erhält und Faktoren wie Gewebeschrumpfung, die während der Gewebeverarbeitung auftritt, berücksichtigen kann38. Die Stereologie hat jedoch ihre eigenen Einschränkungen wie Gewebe-, Ressourcen- und Zeitbeschränkungen.

Angesichts der Anzahl der Krebspatienten, die von der metastasierten Ausbreitung ihrer Erkrankung betroffen sind, wird die Schwanzveneninjektionsmethode zur Untersuchung der Metastasierung weiterhin ein nützliches Instrument sein, um die komplizierte Biologie der metastasierenden Ausbreitung zu verstehen und die präklinische Wirksamkeit neuartiger Therapeutika zu bestimmen. In-vivo-Mausmodelle der Metastasierung, insbesondere solche mit immunkompetenten Tieren, gewinnen angesichts des breiten Interesses an der Immuntherapie noch mehr an Bedeutung für die Krebsforschung29. Experimentelle Metastasierungsmodelle sind auch entscheidend für die Untersuchung von Metastasensuppressorgenen (d.h. solchen, die das metastatische Potenzial von Krebszellen unterdrücken, ohne das Wachstum des Primärtumors zu beeinflussen) und daher weiterhin ein wertvolles Forschungsinstrument.

Digitale Bildgebung und Objektträgeranalyse haben sich schnell zu einer tragenden Säule in der diagnostischen und experimentellen Mausmodellierung entwickelt39. Die Verwendung der hierin beschriebenen Art von Ansatz zur Analyse der lungenmetastasierenden Tumorbelastung ermöglicht Analysen mit hohem Durchsatz auf umfassendere und genauere Weise. Darüber hinaus bietet die digitale Bildgebungspathologie einen Weg für kollaborativere Forschungsprojekte mit Pathologen, die sich auf Bereiche wie Mausmodelle der Brustkrebsmetastasierung spezialisiert haben. Da Multiplex-Gewebebildgebungsverfahren und 3D-Bildgebungstechnologien (wie oben erwähnt) weiterhin entwickelt werden, werden digitale Bildgebungspathologie, ausgeklügelte Softwareprogramme für die Bildanalyse und die Expertise von Pathologen sicherlich notwendig sein, um die Metastasenforschung voranzutreiben.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

Repräsentative Daten wurden durch das National Cancer Institute (K22CA218549 bis S.T.S) finanziert. Zusätzlich zu ihrer Unterstützung bei der Entwicklung der umfassenden Analysemethode, über die hier berichtet wird, danken wir dem Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Direktorin - Krista La Perle, DVM, PhD) für Histologie und Immunhistochemie und dem Pathology Imaging Core für die Entwicklung und Analyse von Algorithmen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
alcohol prep pads Fisher Scientific 22-363-750 for cleaning tail prior to injection
dissection scissors Fisher Scientific 08-951-5 for mouse dissection and lung tissue inflation
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Fisher Scientific MT10013CV cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Fisher Scientific MT21030CV used for resuspending tumor cells for injection
ethanol (70 % solution) OSU used to minimize mouse's fur during dissection; use caution - flammable
Evan's blue dye Millipore Sigma E2129 used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution - dangerous reagent
Fetal Bovine Serum Millipore Sigma F4135 cell culture media additive; used at 10% in DMEM
forceps Fisher Scientific 10-270 for dissection and lung tissue inflation
FVB/NJ mice The Jackson Laboratory 001800 syngeneic mouse strain for MVT1 cells
hemacytometer (Bright-Line) Millipore Sigma Z359629 for use in cell culture to obtain cell counts
insulin syringe (28 G) Fisher Scientific 14-829-1B for tail-vein injections (BD 329424)
MDA-MB-231 cells ATCC human breast cancer cell line
MVT1 cells mouse mammary tumor cells
needles (26 G) Fisher Scientific 14-826-15 used to inflate the mouse's lungs
neutral buffered formalin (10%) Fisher Scientific 245685 used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution - dangerous reagent
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice The Jackson Laboratory 005557 maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource
Penicillin Streptomycin 100x ThermoFisher 15140163 cell culture media additive
sterile gauze Fisher Scientific NC9379092 for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs
syringe (5 mL) Fisher Scientific 14-955-458 used to inflate mouse lung tissue
tail-vein restrainer Braintree Scientific, Inc. TV-150 STD used to restrain mouse for tail-vein injections
Trypan blue (0.4 %) ThermoFisher 15250061 used in cell culture to assess viability
Trypsin-EDTA 0.25 % ThermoFisher 25200-114 used in cell culture to detach tumor cells from plate

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Cancer Research Schwanzveneninjektion Brustkrebs Lungenmetastasen H&E-gefärbte Schnitte quantitative digitale Pathologie Bildanalyse

Erratum

Formal Correction: Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/02/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. The author list was updated.

The author list was updated from:

Katie A. Thies1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

to:

Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen
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Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. J. Vis. Exp. (159), e61270, doi:10.3791/61270 (2020).

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