Modellazione delle metastasi cerebrali attraverso l'iniezione intracraniciale e la risonanza magnetica

Summary

La modellazione della metastasi cerebrale intracraniciale è complicata dall’incapacità di monitorare le dimensioni del tumore e la risposta al trattamento con metodi precisi e tempestivi. La metodologia presentata accoppia l’iniezione di tumore intracranico con l’analisi della risonanza magnetica, che se combinata, coltiva iniezioni precise e coerenti, un monitoraggio degli animali migliorato e misurazioni accurate del volume tumorale.

Abstract

La diffusione metastatica del cancro è una sfortunata conseguenza della progressione della malattia, dei sottotipi di cancro aggressivi e / o della diagnosi tardiva. Le metastasi cerebrali sono particolarmente devastanti, difficili da trattare e conferiscono una prognosi scadente. Mentre l’incidenza precisa delle metastasi cerebrali negli Stati Uniti rimane difficile da stimare, è probabile che aumenti man mano che le terapie extracranici continuano a diventare più efficaci nel trattamento del cancro. Pertanto, è necessario identificare e sviluppare nuovi approcci terapeutici per trattare la metastasi in questo sito. A tal fine, l’iniezione intracranale di cellule tumorali è diventata un metodo ben consolidato in cui modellare la metastasi cerebrale. In precedenza, l’incapacità di misurare direttamente la crescita tumorale è stato un ostacolo tecnico a questo modello; tuttavia, l’aumento della disponibilità e della qualità delle piccole modalità di imaging animale, come la risonanza magnetica (MRI), stanno migliorando notevolmente la capacità di monitorare la crescita del tumore nel tempo e dedurre cambiamenti all’interno del cervello durante il periodo sperimentale. In questo caso, viene dimostrata l’iniezione intracrania di cellule tumorali mammarie murine in topi immunocompetenti seguita da risonanza prima. L’approccio di iniezione presentato utilizza l’anestesia isoflurana e una configurazione stereotassica con un trapano e un’iniezione di ago automatizzati controllati digitalmente per migliorare la precisione e ridurre gli errori tecnici. La risonanza magnetica viene misurata nel tempo utilizzando uno strumento da 9,4 Tesla nella James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource dell’Ohio State University. Le misurazioni del volume tumorale sono dimostrate in ogni momento attraverso l’uso di ImageJ. Nel complesso, questo approccio di iniezione intracranico consente un’iniezione precisa, un monitoraggio giornaliero e misurazioni accurate del volume tumorale, che combinate notevolmente migliorare l’utilità di questo sistema modello per testare nuove ipotesi sui driver delle metastasi cerebrali.

Introduction

Le metastasi cerebrali sono 10 volte più comuni dei tumori del sistema nervoso primario adulto¹e sono state riportate in quasi tutti i tipi di tumore solido con cancro ai polmoni, cancro al seno e melanoma che presentano la più alta incidenza². Indipendentemente dal sito tumorale primario, lo sviluppo della metastasi cerebrale porta a una prognosi scadente spesso associata a declino cognitivo, mal di testa persistente, convulsioni, cambiamenti comportamentali e / o di^{personalità 1,,3,4,5}. In termini di cancro al seno, ci sono stati molti progressi nella prevenzione e nel trattamento della malattia. Tuttavia, il 30% delle donne a cui è stato diagnosticato un cancro al seno continuerà a sviluppare metastasi e di quelle con malattia allo stadio IV, circa il 7% (SEER 2010-2013) ha metastasi cerebrale^6,7. Le attuali opzioni di trattamento per la metastasi cerebrale comportano resezione chirurgica, radiochirurgia stereotassica e / o radioterapia cerebrale intera. Eppure, anche con questa terapia aggressiva, la sopravvivenza mediana per questi pazienti è di breve 8-11 mesi^7,8,9. Queste statistiche cupe sostengono fortemente la necessità di identificare e ae attuazione di nuove ed efficaci strategie terapeutiche. Pertanto, come per tutti i tumori che metastasi al cervello, è essenziale modellare correttamente la metastasi cerebrale associata al cancro al seno (BCBM) in laboratorio per garantire progressi significativi nel campo.

Ad oggi, i ricercatori hanno utilizzato una varietà di metodologie per studiare meccanismi di metastasi al cervello, ognuno con vantaggi e^{limiti distinti 10,,11}. Metodi sperimentali di metastasi come la vena della coda e l’iniezione intracardiaca diffondono cellule tumorali in tutto il corpo e possono causare un immenso carico tumorale in altri siti metastatici a seconda delle cellule iniettate. Questi risultati si confondono se studiano specificamente la metastasi al cervello. Il metodo di iniezione dell’arteria intracarotide è vantaggioso in quanto si rivolge specificamente alla semina cerebrale delle cellule tumorali, ma è limitato in quanto può essere tecnicamente difficile da eseguire. La resezione del tumore primario ortotopico è spesso considerata il modello di metastasi clinicamente più rilevante in quanto riassume l’intera cascata metastatica. Tuttavia, questo approccio prevede periodi di attesa prolungati per la metastasi spontanea con tassi drammaticamente più bassi di metastasi cerebrale rispetto agli altri siti metastatici come il linfonodo, il polmone e il fegato. Spesso, gli animali devono essere rimossi dagli studi a causa del carico tumorale in questi altri siti metastatici prima dello sviluppo della metastasi cerebrale. Altri metodi che coinvolgono linee cellulari tropiche cerebrali sono efficaci nel metastasi al cervello; tuttavia, questi modelli sono limitati in quanto prendono tempo per svilupparsi e spesso perdono il loro tropismo con la propagazione. Date queste limitazioni, i ricercatori hanno regolarmente utilizzato il metodo di iniezione intracranico per modellare la metastasi tumorale^{al cervello 11,,12,,13,,14} con metodologie variabili^{15,,16,,17,,18,,19}. È riconosciuto che questo approccio ha allo stesso modo dei limiti, soprattutto in quanto non consente di investigazione dei primi passaggi metastatici tra cui l’intravasazione dal tumore primario, la penetranza attraverso la barriera ematica e la creazione all’interno del cervello. Tuttavia, consente ai ricercatori di testare (1) quali fattori derivati dal tumore mediano la crescita all’interno del cervello (ad esempio, manipolazione genetica di un fattore oncogenico nelle cellule tumorali), (2) come i cambiamenti nel microambiente metastatico alterano la crescita del cancro in questo sito (ad esempio, confronto tra topi transgenici con componenti stromali alterati) e (3) efficacia di nuove strategie terapeutiche sulla crescita di lesioni consolidate.

Data la potenziale utilità del modello di iniezione intracranico, è assolutamente necessario ridurre l’errore tecnico durante l’iniezione e monitorare con precisione la crescita del tumore nel tempo. Il metodo descritto nel presente documento prevede il dosamento continuo dell’anestesia del gas inalato e l’impianto diretto di cellule tumorali nel parenchima cerebrale utilizzando un trapano stereotattico e un supporto di iniezione. La somministrazione dell’anestetico gassoso consente di perfezionare la profondità e la lunghezza dell’anestesia e di garantire un recupero rapido e fluido. Un sistema di iniezione automatizzata di trapani e aghi controllato digitalmente migliora la precisione del sito di iniezione e riduce gli errori tecnici spesso sostenuti dalla perforazione e dai metodi di iniezione a mano libera. L’uso della risonanza magnetica (MRI) aumenta ulteriormente la precisione nel monitoraggio della crescita del tumore, del volume tumorale, della risposta dei tessuti, della necrosi tumorale e della risposta al trattamento. La risonanza magnetica è la modalità di imaging preferita per i tessuti^{molli 20,,21}. Questa tecnica di imaging non utilizza radiazioni ionizzanti ed è preferita rispetto alla tomografia computerizzata (CT), specialmente per più sessioni di imaging durante il corso di uno studio. La risonanza magnetica ha una gamma molto più ampia di contrasto dei tessuti molli disponibili rispetto alla TC o all’imaging ad ultrasuoni (USG) e presenta l’anatomia in modo più dettagliato. È più sensibile e specifico per le anomalie all’interno del cervello stesso. La risonanza magnetica può essere eseguita su qualsiasi piano di imaging senza dover spostare fisicamente il soggetto, come nel caso dell’imaging ottico 2D USG o 2D. È importante ricordare che il cranio non attenua il segnale MRI come in altre modalità di imaging. La risonanza valutazione consente la valutazione di strutture che possono essere oscurate da artefatti di osso in CT o USG. Un ulteriore vantaggio è che ci sono molti agenti di contrasto disponibili per la risonanza prima, che migliora il limite di rilevamento della lesione, con tossicità relativamente bassa o effetti collaterali. È importante sottolineare che la risonanza prima è possibile monitorare in tempo reale a differenza della valutazione istologica al momento della necroscopia, che è limitata nella decifrazione del volume tumorale. Altre modalità di imaging, come l’imaging bioluminescente, sono effettivamente efficaci per il rilevamento e il monitoraggio precoce del tumore nel tempo; tuttavia, questo metodo richiede la manipolazione genetica (ad esempio, l’etichettatura luciferasi/GFP) delle linee cellulari e non consente misurazioni volumetriche. La risonanza istologica è ulteriormente vantaggiosa in quanto rispecchia il monitoraggio del paziente e l’analisi volumetrica a valle delle immagini mr è nota per essere fortemente correlata alla dimensione istologica del tumore alla^{necroscopia 22}. Il monitoraggio seriale con screening mri aumenta anche il monitoraggio clinico delle menomazioni neurologiche, in caso di insorgere.

Nel complesso, il metodo presentato di iniezione di tumore intracranico stereotassico seguito dalla risonanza prima seriale ci consente di produrre risultati affidabili, prevedibili e misurabili per studiare i meccanismi della metastasi cerebrale nel cancro.

Protocol

Tutti i metodi descritti nel presente documento sono stati approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Ohio State University (P.I. Gina Sizemore; Protocollo #2007A0120). Vengono seguite tutte le politiche della chirurgia di sopravvivenza dei roditori IACUC, incluso l’uso di tecniche sterili, forniture, strumenti, nonché la rimozione della pelliccia e la preparazione sterile del sito di incisione. 1. Iniezione intracranale di cellule tumorali del seno <p class="j…

Representative Results

La figura 3 mostra la quantificazione del volume tumorale per un singolo topo in due punti di tempo (giorno 7 e giorno 10) dopo l’iniezione di cellule tumorali mammarie murine. Per questo esperimento, sono state iniettate 50.000 cellule DB7, e il cervello dell’animale è stato valutato dalla risonanza prima. Per ogni scansione sono state catturate 30 fette (spessore 0,5 mm). La valutazione delle 30 fette per scansione ha rivelato che al giorno 7 dopo l’iniezione, 5 fette mostravano un carico…

Discussion

L’utilizzo dell’iniezione intracranici seguita dal monitoraggio seriale con risonanza prima è la capacità unica di visualizzare la crescita del tumore con precisione del volume tumorale nel tempo. L’applicazione dell’analisi digitale dell’imaging consente l’interpretazione delle lesioni cerebrali per volume tumorale, emorragia, necrosi e risposta al trattamento.

Come per qualsiasi procedura, ci sono passaggi chiave che devono essere seguiti per il successo. In primo luogo, un’attenta configu…

Materials

Surgical Materials
Betadine	Purdue Products	19-027132	Povidone-iodine, 7.5%
Bone Wax	Surgical Specialities	903	Sterile and malleable beeswax and isopropyl palmitate
Buponorphine SR-Lab	ZooPharm	N/A	Long acting injectable analgesic 5 mL (0.5 mg/mL) polymetric formulation
Cotton tip applicators	Puritan	25-806 10WC	Sterile long stemmed cotton tip applicators
Eye Ointment	Puralube	17033-211-38	Lubricating petrolatum and mineral oil based ophthalmic ointment
Handwarmers	Hothands	HH2	Air-activated heat packs
Ibuprofen	Up & Up	094-01-0245	100mg per 5mL in liquid suspension
Isoflurane	Henry Schein INC	1182097	Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer
Scalpels	Integra Miltex	4-410	#10 disposable scalpel blade
Skin Glue	Vetbond	1469SB	Skin safe wounds adhesive
Sterile Dressing	TIDI Products	25-517	Individually packed sterile drapes
Suture	Covidien	SP5686G	45cm swedged 5-0 monofilament polypropylene suture
Stereotaxic Unit
High Speed Drill (Foredom)	Kopf	Model 1474	Max of 38,000 RPM
Mouse Gas Anesthesia Head Holder	Kopf	Model 923-B	Mouth bar with teeth hole and nosecone
Non-Rupture Ear Bars	Kopf	Model 922	Ear bars suitable for mouse applications
Stereotaxic Instrument	Kopf	Model 940	Base plate, frame and linear scale assembly with digital readout monitor
Injector
Injector Needle and syringe	Hamilton	80366	26 gauge needle, 51 mm needle length and 10 μL volume syringe
Legato 130A automated Syringe Pump	KD Scientific	P/N: 788130	Programmable touch screen base with automated injector
Anesthesia Machine
SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer	Kent Scientific	SS-01	Digital anesthesia machine
SomnoSuite Starter Kit for mice	Kent Scientific	SOMNO-MSEKIT	Includes induction chamber, 2x anesthesia syringes, 18" tubing, plastic nosecone, 2x waste aneshesia gas canisters