腱由来幹細胞の発熱分化を誘導する三次元単軸機械刺激バイオリアクターシステムの適用
Summary
三次元単軸的な機械的刺激バイオリアクターシステムは、腱由来幹細胞の形質特異的分化およびネオ腱形成のための理想的なバイオリアクターである。
Abstract
腱障害は、整形外科領域における炎症および変性に関連する一般的な慢性腱疾患である。高い罹患率、限られた自己修復能力、そして最も重要なことは、決定的な治療法がない、腱症は依然として患者の生活の質に悪影響を及ぼさない。腱由来幹細胞(TDSC)は、腱細胞の原発前細胞として、腱障害の発症と腱障害後の機能および構造的回復の両方において重要な役割を果たす。従って、インビトロでTDcSCの腱細胞への分化を模倣できる方法が有用であろう。ここで、本プロトコルは、TDSCを刺激して腱様組織に分化する三次元(3D)単軸ストレッチシステムに基づく方法を説明する。本プロトコルの7つの段階があります:マウスTDSCの単離、マウスTDSCの培養および拡大、細胞シート形成のための刺激培養培地の調製、刺激媒体中の培養による細胞シート形成、3D腱幹細胞構築物の調製、単軸伸張機械的刺激複合体の組立、および機械的刺激体型腱様組織の評価。有効性は、ヒストロジーによって実証された。全体の手順は3週間未満かかります。細胞外マトリックス沈着を促進するために、4.4mg/mLアスコルビン酸を刺激培養培地に使用した。線形モーターが付いている分離された部屋は正確な機械負荷を提供し、携帯用および容易に調節されるバイオリアクターのために適用される。本プロトコルにおける負荷レジームは、6%の株、0.25 Hz、8 h、続いて6日間16時間休息であった。このプロトコルは腱の細胞分化を模倣することができ、腱障害の病理学的プロセスの調査に有用である。さらに、腱様組織は、設計された自家移植片として腱損傷における腱治癒を促進するために使用される可能性がある。要約すると、現在のプロトコルはシンプルで経済的で、再現性があり、有効です。
Introduction
腱障害は、一般的なスポーツ傷害の一つです。それは主に痛みによって現れます, 局所腫れ, 患部の筋肉の緊張の低下, 機能不全.腱障害の発生率は高い。アキレス腱症の存在は、中長距離ランナー(最大29%)に最も一般的であり、膝蓋腱症の存在はバレーボール(45%)、バスケットボール(32%)、陸上競技(23%)、ハンドボール(15%)、サッカー(13%)1、2、3、4、5の選手でも高い。1,2,3,4,5しかし、腱の自己治癒能力が限られているため、効果的な治療が不足しているため、腱症は依然として患者の生活に負の66,77に影響を及ぼす。さらに、腱障害の病因は不明のままである。その病因について多くの調査が行われてきましたが、主に「炎症理論」、「変性理論」、「使い過ぎ理論」など8.現在、多くの研究者は、腱障害は、腱の経験99、1010の過度の機械的負荷によって引き起こされる微小傷害への自己修復の失敗によるものだと考えていた。
腱由来幹細胞(TDSC)は、腱細胞の原発前細胞として、腱障害11、12、13後の腱障害および機能および構造的回復の両方の発達において重要な11,役割を13果たす。機械的ストレス刺激は、骨細胞、骨芽細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、間葉系幹細胞および他の力感受性細胞14、15、16、17、1814,15,16,17,18の増殖および分化を引き起こす可能性があると報告された。従って、TDcSCは、メカノイ感受性および多能性細胞の一つとして、機械的負荷19、20,20によって同様に分化するように刺激することができる。
しかし、異なる機械的負荷パラメータ(荷重強度、積載頻度、積載タイプおよびローディング期間)は、TDCが異なるセル21に分化するように誘導する可能性がある。したがって、効果的かつ有効な機械的負荷のレジームは、テノジェネシスにとって非常に重要です。さらに、TDCに機械的負荷を提供するために現在使用されている刺激システムとして、バイオリアクターの種類が異なります。バイオリアクターの各種類の原理は異なるので、異なるバイオリアクターに対応する機械的負荷パラメータも異なります。したがって、バイオリアクターの種類、対応する刺激媒体、および機械的負荷体制を含む、簡便で経済的で再現可能な刺激プロトコルが要求されている。
本稿では、TDSCを刺激して腱様組織に分化する三次元(3D)単軸ストレッチシステムに基づく方法について説明する。プロトコルには、マウスTDSCの単離、マウスTDSCの培養および拡大、細胞シート形成のための刺激培養培地の調製、刺激媒体中の培養による細胞シート形成、3D腱幹細胞構築物の調製、単軸伸張機械的刺激複合体の組立、および機械的刺激体型腱様組織の評価の7段階がある。全体の手順は、いくつかの既存の方法22、23,23よりもはるかに少ない3D細胞構造を得るために3週間未満かかります。本プロトコルは、TDSCを腱組織に分化するように誘導できることが証明されており、現在一般的に使用されている2次元(2D)延伸システム21よりも信頼性が高い。有効性は、ヒストロジーによって実証された。要するに、本プロトコルは、シンプルで経済的で、再現性があり、有効である。
Protocol
記載された方法は、西オーストラリア大学動物倫理委員会のガイドラインと規制に従って承認され、実施されました。 1. マウスTDSCの分離 6-8週齢のC57BL/6マウスを子宮頸部脱臼で安楽死させる。 収穫膝蓋腱24とアキレス腱25. I型コラゲザーゼ(3mg/mL)の6mLを持つ腱を3時間消化します。注:マウスの腱のサイズが小さ?…
Representative Results
機械的刺激の前に、TDSCは完全な媒体で100%合流まで成長し、組織化されていない超構造形態を示した(図2A)。機械的ローディングの6日間の単軸ストレッチの後、細胞外マトリックス(ECM)および細胞の配向が良好に配向された(図2B)。細胞は、機械的な負荷の後にECMによく入り込み、よく包まれました。細胞形態は伸長するように提示され、伸張しないものに比べて通常?…
Discussion
腱は、メカノイ感受性線維性結合組織である。以前の研究によると、過剰な機械的負荷は腱幹細胞の骨形成分化につながる可能性があり、一方、不十分な負荷は腱分化中にコラーゲン線維構造の乱れにつながる。
一般的な見解は、理想的なバイオリアクターの鍵は、生体内の細胞が受けるインビトロ細胞微小環境をシミュレートする能力であるという?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者が「西オーストラリア大学国際料奨学金と西オーストラリア大学大学院賞」を受けている間に研究が行われました。この研究は中国国立自然科学財団(81802214)によって支援されました。
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich | PHR1008-2G | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibcoä by Life Technologies | 1908361 | |
| Histology processor | Leica | TP 1020 | |
| Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) | Gibcoä by Life Technologies | 2003802 | |
| Mouse Tendon Derived Stem Cell | Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions. | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | 441244 | |
| Streptomycin and penicillin mixture | Gibcoä by Life Technologies | 15140122 | |
| Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System | Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia | Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809 | |
| Trypsin | Gibcoä by Life Technologies | 1858331 |
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Citazione di questo articolo
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