Summary
이 프로토콜은 금속 임플란트 물질에 대해 슬라이딩 하는 골연드랄 실린더의 준비, 생체 교정 테스트 및 분석을 설명합니다. 이 프로토콜에 포함된 결과 측정은 대사 활동, 유전자 발현 및 히스토로지입니다.
Abstract
중년 환자의 골연드랄 결함은 초점 금속 임플란트로 치료될 수 있습니다. 먼저 무릎 관절의 결함을 위해 개발, 임플란트는 이제 어깨, 엉덩이, 발목과 첫 번째 중족협 관절에 사용할 수 있습니다. 통증 감소 및 임상 개선을 제공 하면서, 상대 연골의 점진적 퇴행성 변화는 많은 환자에서 관찰 된다. 이 손상으로 이어지는 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 이 프로토콜은 금속 연골 페어링및 관절 연골의 포괄적 인 분석을 시뮬레이션하기 위한 마찰 학적 실험을 설명합니다. 금속 임플란트 물질은 인간 관절 연골의 모델로 소 골연드랄 실린더에 대해 테스트됩니다. 다양한 하중과 슬라이딩 속도를 적용하여 생리적 하중 조건을 모방할 수 있습니다. 관절 연골에 미치는 영향에 대한 포괄적 인 분석을 제공하기 위해, 히스토로지, 대사 활동 및 유전자 발현 분석은이 프로토콜에 설명된다. 트리고컬 테스트의 주요 장점은 로딩 매개 변수를 생체 조건에서 시뮬레이션하기 위해 자유롭게 조정할 수 있다는 것입니다. 더욱이, 다른 시험 용액은 윤활 또는 선동적인 에이전트의 영향을 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다. 연골 특이적 유전자 및 이환 유전자에 대한 유전자 발현 분석을 사용하여 기계적 적재에 반응하여 관절 연골 세포의 신진 대사의 초기 변화가 감지될 수 있습니다.
Introduction
골막 결함의 치료는 까다롭고 많은 경우에 수술이 필요합니다. 중년 환자의 초점 골연드랄 병변의 경우, 초점 금속 임플란트는 특히 골수 자극(BMS) 또는 자가 연골 세포 이식(ACI)1과같은 1차 치료의 고장 후 실행 가능한 옵션입니다. 부분 표면 교체는 통증을 줄이고 운동2의범위를 향상시킬 수있는 인양 절차로 간주 될 수 있습니다. 이러한 임플란트는 일반적으로 CoCrMo 합금으로 구성되며 정상적인 해부학3에맞게 다양한 크기와 오프셋 구성으로 사용할 수 있습니다. 처음에 무릎내막 대퇴동에 결함을 위해 개발되었지만, 이러한 임플란트는 이제 엉덩이, 발목, 어깨 및 팔꿈치4,5,6에사용할 수 있습니다. 만족스러운 결과를 위해, 상대 연골의 기계적 관절 정렬 및 상태를 평가하는 것이 중요합니다. 더욱이, 임플란트의 돌출없이 올바른 이식은 근본적인 것으로 나타났다7.
임상 연구는 다양한 위치에 대한 중년 환자의 통증 감소 및 기능 개선 측면에서 우수한 단기 결과를 보여주었다 5,6,8. 동종 이식 이식과 비교하여 초점 금속 임플란트는 조기 체중 베어링을 허용합니다. 그러나, 반대 관절 연골은환자의상당수에서 가속 마모를 보였다9,10. 따라서 적절한 배치에도 불구하고 많은 경우 기본 연골의 변성은 불가피한 것처럼 보이지만 기본 메커니즘은 불분명합니다. 유사한 퇴행성 변화는엉덩이(11)의 양극성 중혈 성형술 이후에 관찰되었으며 활동 및적재(12)로증가된다.
트리뷸리학 실험은 체외에서 이러한 페어링을 연구하고 생리적 조건 하에서 발생하는 다른 적재 상황을 시뮬레이션 할 수있는 가능성을제공한다(13). 골연드랄 핀의 사용은 토착 연골 또는 임플란트물질(14)에 대해 미끄러지는 관절 연골의 트리뷸리를 조사하는 간단한 지오메트리 모델을 제공하며 전체 조인트 시뮬레이션모델(15)에더 사용될 수 있다. 금속 온 연골 페어링은 연골 마모가 가속화되고 세포외 매트릭스 가중단및 연골 연골 페어링16에비해 피상 영역에서 세포 생존가능성이 감소함을 보여준다. 연골손상은 주로 피상권과중구역(17)사이의 박리 형태로 발생했다. 그러나 연골 변성으로 이어지는 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 이 프로토콜은 관절 연골의 생합성 활성에 대한 포괄적인 분석을 제공합니다. 대사 활동과 이화 유전자의 유전자 발현 수준의 결정에 의해 연골 고장에 대한 초기 징후가 확인 될 수 있습니다. 시험관 내 트리볼로지 실험의 장점은 로딩 파라미터를 조정하여 다양한 하중 조건을 모방할 수 있다는 것입니다.
따라서 다음 프로토콜은 실험용 간혈 성형술 모델을 나타내는 금속 온 연골 페어링을 시뮬레이션하는 데 적합합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 금속 실린더 준비
- 제조업체 프로토콜당 에너지 분산 x선 분광법을 사용하여 화학 적 구성에 대한 외과 용 임플란트의 표준 사양을 충족하는 원통형 코발트 크롬-몰리브덴 (CoCrMo) 막대를 분석합니다.
참고: 이 실험에 사용되는 CoCrMo 합금의 원소 조성물은 65% Co, 28% Cr, 5% Mo 및 2% 다른 제품입니다. - 500의 곡물 크기로 시작하는 실리콘 초경 연삭 종이로 샘플을 젖은 갈기. 4000의 곡물 크기까지 순서를 증가 분쇄 용지를 사용합니다.
- 3 μm 및 1 μm 페이스트로 실린더를 연마하여 금속 외과 용 임플란트 (ISO 5832-12:2019) 및 총 및 부분 관절 교체 임플란트 (ISO 21534:2007)에 대한 표면 마감 요구 사항 의 내성 수준 내에있는 표면 거칠기를 달성합니다.
참고: 평균 표면 거칠기는 공초점 현미경을 사용하여 결정됩니다. - CoCrMo 로드(Ø of 6mm)를 길이10mm의 실린더로 자른다.
2. 골연드랄 실린더 의 수확
- 골격성숙한 동물(희생 시 18-24개월 숙)의 소 가루 관절을 사용하고 희생 후 24시간 이내에 해부될 때까지 이를 억제하고 식힙니다.
참고: 관절은 현지 정육점에서 구입합니다. 조인트는 해부때까지 닫혀 있습니다. - 무균 조건에서 원통형 골연수 플러그를 수확하려면 무릎을 소독하고 관절 절제술을 수행하고 내측 대퇴 추도를 노출하십시오.
참고: 해부는 관절 표면을 손상시키지 않도록 주의해서 수행해야 합니다. - 아티큘러 표면을 검사하여 거시적 손상을 검사합니다.
참고: 연골이 희끄럽고 매끄럽고 광택있는 모양이 없거나 물집이 생기거나 균열이 있거나 더 큰 결함이 있는 경우 샘플을 폐기하십시오. - 커팅 튜브를 무게 베어링 영역의 관절 표면에 수직으로 정렬하고 망치로 단단한 스트로크로 연골 과 부전 골뼈로 장치를 구동합니다. 15mm 침투 깊이에서 장치를 갑작스런 움직임으로 시계 방향으로 비틀어 보냅니다.
- 장치를 제거하고 흰색 손잡이를 삽입하고 골막 플러그의 하단 끝이 보일 때까지 나사로 연결합니다.
- 테스트 중에 그에 따라 골조진 실린더를 정렬하기 위해 멸균 마커로 시료의 전방 방향을 표시한다.
참고: 3차원 콜라겐 네트워크와 복잡한 아키텍처는 관절 연골의 고유한 기계적 특성을 용이하게 하며 시료의 방향으로 고려해야 합니다. - 혈액과 지방 조직을 씻어 인산염 완충 식염수 (PBS)로 샘플을 헹구는.
- 위에서 언급한 단계를 반복하여 원하는 수의 골조온드랄 플러그(직경 8mm, 길이 15mm)를 수확합니다.
참고: 전형적으로, 9-12개의 골연드랄 실린더는 내측 대퇴추의 중량 베어링 영역에서 수확될 수 있다. - 10% 태아 소 혈청을 함유한 덜벡코의 수정된 이글 배지에 샘플을 배치하여 항생제(페니실린 200 U/mL; 연쇄상 구균 0.2 mg/mL) 및 암포프레메리신 B 2.5 μg/mL로 보충하여 시험할 때까지 4°C에 저장합니다.
- 수확 직후 제어 골연드랄 플러그를 분석하여 기준값을 설정합니다(분석 섹션 참조).
3. 마찰학적 검사
- 실린더 온 플레이트 구성으로 시판 가능한 왕복 트리보미터를 사용하여 실험을 수행합니다. 장치에 대한 요구 사항은 수직 적재 및 조정 가능한 부하 및 슬라이딩 속도입니다. 또한 액체 셀은 윤활액에서 테스트를 수행할 수 있습니다.
- 압력 측정 필름을 사용하여 CoCrMo-on-연골 시스템의 접촉 압력을 결정합니다. 압력 측정 필름을 인터페이스에 배치하고 30s의 정적 부하를 적용하여 초기 접촉 압력, 접지 크기 및 모양을 결정합니다. 금속 실린더와 관절 연골의 볼록함으로 인해 초기 접촉 영역은 이 구성에서 타원형 모양을 가지고 있습니다.
참고: 압력 측정 필름은 임계값 압력에 도달하거나 초과된 영역의 빨간색 변색을 보여주는 가속도 압력에 반응합니다. 1N 하중의 경우, 접촉 압력은 정의된 접촉 압력과 시각적 비교를 통해 약 2MPa를 결정했습니다. - 하단 샘플 홀더의 골연드랄 실린더를 슬라이딩 방향과 정렬된 마킹으로 수정하고 CoCrMo 실린더를 상부 로드 셀에 장착합니다.
- 테스트 용액(3g/L 히알루론산이 있는 PBS)을 액체 셀에 추가하여 골연드랄 실린더를 잠수하고 금속 연골 슬라이딩 인터페이스를 덮습니다.
- 테스트 매개 변수(규정된 정상 힘, 스트로크 및 슬라이딩 속도)를 설정한 다음 테스트 전반에 걸쳐 적용되고 유지관리됩니다.
참고: 왕복 모션의 스트로크 길이는 MCA(마이그레이션 컨택스 영역)를 만들기 위해 접촉 영역에 따라 설정해야 합니다. 직경 8mm의 플러그의 경우 2mm 스트로크를 통해 연골의 적절한 재수화를 허용합니다. - 세트 로딩 매개 변수를 통해 윤활액에 침지된 관절 연골에 대한 CoCrMo 실린더의 상호 슬라이딩을 시작합니다.
- 실험 중에 마찰 계수(COF)를 모니터링합니다.
참고: COF는 자동으로 평가되지만 방정식 μ=F/W(μ - 마찰 계수를 사용하여 계산할 수 있습니다. F - 마찰력; W - 시스템에 의해 적용 된 일반 부하). - 원하는 테스트 기간 후에 실험을 종료합니다.
- 샘플 홀더에서 골조드랄 플러그를 제거하고 PBS로 헹구고 생물학적 분석이 더 있을 때까지 매체에 보관하십시오(아래 참조).
- 테스트 기간 동안 실온에서 테스트 솔루션의 제어 샘플을 잠수하고 기계적 적재에 노출된 샘플과 함께 분석합니다.
4. 분석
참고: 골연드랄 실린더는 생물학적 활성을 조사하기 위해 대사 활성 및 유전자 발현을 위해 분석됩니다. 연골 표면 무결성 및 기본 매트릭스를 연구하기 위해 히스토로지 수행됩니다.
- 조직학
- 조직학적 분석을 위해, 추가 처리가 될 때까지 4% 버퍼링된 포름알데히드 용액에 골조장 플러그를 담그십시오.
- 샘플을 PBS로 헹구고 플라스틱 용기에 넣습니다.
- 모든 샘플을 커버할 수 있도록 즉시 사용할 수 있는 데칼시피어 솔루션의 초과를 추가합니다.
- 완전한 탈화에 대해 4주 동안 일정한 동요를 적용합니다.
- 탈화 후, 수용성 글리콜과 수지에 샘플을 포함하고 - 80 °C에 저장합니다.
- 접촉 영역으로 대고 극저분으로 6 μm 단면을 가져옵니다.
- 그 후 제조업체의 프로토콜을 사용하여 Safranin O 염색 및 Fastgreen 카운터스테인링용 샘플을 준비합니다.
- 이미징 처리 소프트웨어를 사용하여 현미경 및 프로세스를 사용하여 조직학적 이미지를 캡처합니다.
- 대사 활동
참고: 관절 연골에서 연골 세포의 대사 활성은 XTT 기반의 전 생체 독성학 분석으로 조사됩니다.- PBS를 사용하여 골조장 플러그를 헹구고 샘플을 페트리 접시에 놓습니다.
- 24웰 플레이트를 스케일에 놓고 스케일을 0으로 설정합니다.
- 한 조각에 메스와 골연수 접목에서 연골을 잘라.
- 연골을 두 개의 동등한 조각으로 양분하여 접촉 영역이 연골 조각에 동등하게 분포하고 반에서 1mm³ 조각으로 다진다. 후반은 유전자 발현 분석을 위해 사용된다.
- 다진 연골을 준비된 24웰 플레이트의 1웰로 옮기고 조직 중량을 결정합니다.
- 각 샘플에 대해 위에서 언급한 단계를 반복하고 플레이트의 각 웰에 1mL의 성장 매체를 추가합니다.
- 제조업체의 지시및 혼합에 따라 XTT 솔루션(XTT 라벨링 시약490 μL 및 활성화 시약 10 μL)을 추가합니다.
- 플레이트를 37°C, 4시간 동안 5%CO2로 배양한다.
- 인큐베이션 후, 상체를 제거하고 5mL 튜브로 전송합니다.
- 24웰 플레이트의 연골 조직에 0.5mL의 디메틸 설산화물(DMSO)을 첨가하여 테트라졸리움 생성물을 추출하고 실온에서 1시간 동안 연속 교반을 적용한다.
- DMSO 솔루션을 제거하고 이전에 수집한 XTT 솔루션으로 풀을 비워보라고 합니다.
- 플레이트 판독기의 96웰 플레이트에서 트리클리케이트시 100 μL을 전송하고 파장 492nm및 기준 파장에서 흡광도를 측정하여 690 nm에서 측정한다.
- 생성된 흡광도 값을 각 샘플의 젖은 중량으로 정규화하고 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행합니다.
- 유전자 발현 분석
- RNA 절연
참고: RNA 절연은 소규모 개정을 통해 제조업체가 제공한 지침에 따라 상용키트(재료 표)를사용하여 수행됩니다.- 골연드랄 플러그로부터 얻은 연골 조직의 후반을 작은 조각으로 다진다.
- 세라믹 구슬과 300 μL의 리시스 버퍼(1% β-메르카토에탄올 포함)가 포함된 튜브로 이송합니다.
참고: 시료는 추가 처리가 될 때까지 액체 질소로 냉동할 수 있습니다. - 샘플을 2 분 동안 해동하고 조직의 균질화에 대한 상업적 용액을 사용합니다. 각 실행 후 2분 냉각 단계(상업용 리서 냉각 장치를 사용하여 4°C)로 20s(균질화 단계)에 대해 6500 rpm을 적용하여 조직을 완전히 방해합니다.
- 단백질Ae K 20 μL과 RNase가 없는 물의 580 μL을 각 튜브에 넣고 55°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 원심 분리는 10,000 x g에서 3 분 동안 샘플을 원심 분리하고 1.5 mL 튜브로 상류체를 전송합니다.
- 각 튜브에 90% 에탄올의 0.5 볼륨을 추가하고 혼합합니다.
- 샘플의 700 μL을 2mL 수집 튜브에 배치된 RNA 결합 컬럼으로 옮기고 15s용 8,000 x g의 원심분리기를 전달한다.
- 흐름 스루를 버리고 전체 lysate에 대한 원심 분리 단계를 반복합니다.
- 350μL의 버퍼 RW1을 열에 추가하고, 원심분리기는 8,000 x g에서 15s에 넣고 흐름을 폐기합니다.
- DNase 스톡 용액 10 μL과 버퍼 RDD 70 μL을 혼합합니다. RNA 정화 막에 용액을 추가하고 15 분 동안 실온에서 배양하십시오.
- 15s에 대해 8,000 x g에서 350 μL의 버퍼 RW1및 원심분리기를 8,000 x g로 추가합니다. 흐름을 삭제합니다.
- 버퍼 RPE 500 μL과 원심분리기를 8,000 x g에서 15s에 추가합니다. 흐름을 삭제합니다.
- RNA 정화 열과 원심분리기에 버퍼 RPE 500 μL을 2분 동안 8,000 x g로 추가합니다.
- 컬럼을 1.5mL 수집 튜브에 넣고 RNase가 없는 물 30μL을 추가합니다. 원심 분리기 8,000 x g에서 1 분 동안.
- cDNA 합성될 때까지 -80°C에 절연 된 RNA를 저장합니다.
- cDNA 합성
참고: 메신저 RNA(mRNA)로부터 보완DNA(cDNA)를 합성하기 위해 상용 키트(재료표)가 사용되었다. 박테리아 세포 MS2에서 RNA는 cDNA 합성 도중 고립된 RNA를 안정시키기 위하여 추가되었습니다.- 해동하고 시약을 섞습니다. 단일 반응에 대한 구성은 표 1에도시된다.
- 단일 반응(14 μL)을 위해 부피에 RNA 샘플 16μL을 추가합니다.
- 다음 매개 변수를 사용하여 열 사이클러에서 cDNA 합성을 수행 : 25 °C에서 10 분 (프라이머 어닐링), 50 ° C에서 60 분 (DNA 합성), 85 ° C에서 5 분 (데니처레이션) 및 20 °C에서 5 분 (냉각 상).
- 실시간 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(RT-qPCR)까지 -20°C에 cDNA를 저장합니다.
- RT-qPCR
참고: 소 샘플의 RT-qPCR의 경우, 프라이머 와 프로브는 상업용 실시간 qPCR 소프트웨어(예: IDT) 유전자 GAPDH (글리세랄데히드 3-인산염 탈수소효소), COL2A1(콜라겐 타입 2), ACAN(아그레칸), COL1A1(콜라겐 타입 1), MMP-1(매트릭스 메탈로프로테나제-1), MMP-13(매트릭스 메탈로프로틴아제-1)을 위한 유전자를 갖는다. 소 프라이머와 이중 담금질 프로브는 IDT에 의해 제공되었다. 단일 반응에 사용되는 시약은 표 2에 표시되어 효율성 및 유전자 발현을 평가한다.- 단일 반응(9 μL)의 마스터 믹스를 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 분배하고 각 반응에 1 μL의 cDNA를 추가합니다. 트리플리세이트에서 각 샘플에 대한 테스트를 수행합니다.
- 밀봉 오일과 원심분리기를 사용하여 PCR 플레이트를 877 x g에서 4°C에서 10분 동안 닫습니다.
- RT-qPCR은 다음 프로토콜을 사용하여 정밀 열 사이클러를 사용하여 10분 동안 95°C, 45사이클의 증폭(10초동안 95°C), 30초, cDNA 합성용 어닐링), 37°C를 30초동안 수행한다.
참고: 각 프라이머에는 특정 어닐링 온도가 필요합니다. - GAPDH를 표적 유전자와 함께 사용하여 효율성을 확인합니다.
- 제공된 소프트웨어를 사용하여 각 유전자의 효율성을 계산합니다.
- 사이클 임계값(CT) 값을 기준 유전자 GAPDH의 발현으로 정규화하고 정량화를 위해 ΔΔCT 방법을 사용합니다.
- RNA 절연
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
접촉 영역 및 접촉 압력은 압력 측정필름(도 1)을사용하여 확인되어야 합니다. 생리적 적재 상태는 정의된 접촉 압력에 대한 참조 각인물과 비교하여 확인할 수 있습니다. 테스트 하는 동안 마찰계수를 지속적으로 모니터링 합니다. 이동 접촉 영역을 사용하면 마찰 계수를 최소 1h(도2)에대해 유지할 수 있습니다. 세포외 매트릭스 조성 및 구조를 염색하는 사프란린 O를 사용하여 결정될 수있다(도 3). 사프란 오 스테인링의 강도는 프로테오글리칸 함량에 비례합니다. 패스트 그린은 비 콜라겐 부위를 대응하고 사프란오 스테닝과 뚜렷한 대조를 제공합니다. 프로테오글리칸 함량은 관절 표면에 따라 다르지만 기준선샘플(도 3A)의조직 섹션 전체에 걸쳐 균일해야 한다. 테스트 솔루션에 침수된 제어 샘플은 기계적 적재(도3B, 3C)에의해 상쇄될 수 있는 GAGs의 추출을 보여 준다. 소 관절 연골세포의 대사 활성은 수확 부위와 무관하지만 언로드 된 제어(도 4)에비해 기계적 적재로 증가함을 나타낸다. 연골 특이적 유전자(COL2A1, ACAN)의 유전자 발현 수준은 생리적 적재 조건으로 증가하지만, 이발성 유전자(COL1A1 및 MMP13)는 고정접촉영역(도 5)으로조절된다.
| 부피(μl) | |
| 전사RT 반응 버퍼 5배 콘. | 6 |
| 수호자 RNase 억제제 40U/μl | 0.75 |
| 탈옥뉴클레오티드 믹스 10mM 각 | 3 |
| 랜덤 히사스터 프라이머 600 μM | 3 |
| 전사 역 전사 20 U/μl | 0.75 |
| MS2 RNA (0,8 μg/μl) | 0.375 |
| 뉴클레아제 프리 증류수 | 0.125 |
| 총 볼륨 | 14 |
표 1: cDNA 합성을 위한 단일 반응시 시약.
| 부피(μl) | |
| 패스트스타트 프로브 마스터 2X | 5 |
| 가수 분해 프로브 2,5 μM | 1 |
| 왼쪽 프라이머GAPDH 5 μM | |
| 오른쪽 프라이머 GAPDH 5 μM | |
| 뉴클레아제 프리 증류수 | 3 |
| 총 마스터 믹스 | 9 |
표 2: 단일 PCR용 마스터 믹스시약입니다.
그림 1: 테스트 전에 금속 연골 인터페이스에서 초기 접촉 영역의 P ressure 측정. 금속 실린더의 볼록함과 관절 표면 및 탄성 특성으로 인해 초기 접촉 영역은 타원형입니다. 슬라이딩 하는 동안, 이 초기 접촉 영역의 스트로크와 함께 이동 2 m m, 기계적 하중에 노출 되는 더 큰 영역의 결과; 스케일 바 = 2mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 8mm/s 슬라이딩 속도와 1N 하중(MPa 접촉 압력 2개)으로 테스트된 7개의 샘플에 대한 시간 의존적 마찰 계수(지속시간 1시간). 각 색상 선은 하나의 골연드랄 실린더의 COF를 나타냅니다. 관찰된 가변성은 생물학적 샘플의 한계 내에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 사프란-O와 패스트 그린으로 염색된 소 골조오공드랄 샘플의 조직학적 단면. (A)기준선 샘플은 관절 연골 전체에 걸쳐 높은 GAG 함량을 표시합니다. (B)기계적 로딩 없이 테스트 용액에 침수된 제어 샘플은 중간 영역에서 사프란-O 염색이 적고 프로테오글리칸의 추출을 나타냅니다. (C)테스트된 샘플은 제어에 비해 더 높은 GAG 함량을 나타내며, 이는 기계적 자극을 나타낸다; 스케일 바 = 250 μm이 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 다른 하중 변형 및 제어와 트리브론 테스트 후 소 관절 연골세포의 대사 활동. 가로 점선은 기준 수준을 나타냅니다. 비parametric 크루칼- 월리스 테스트는 중요한 경우 던의 포스트 호크 테스트 다음에 테스트 그룹 사이의 비교를 위해 수행되었다. *p & 0.05. 이 그림은 스토터 등 에서수정되었습니다. 18. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 다른 하중 조건 및 제어를 가진 마찰 학 테스트 후 연골 특이 적 유전자의 유전자 발현. COL2A1=콜라겐 유형 2; ACAN =아그레칸; COL1A1= 콜라겐 유형 1; MMP13 = 매트릭스 메탈로프로테나아제 13. 발현 수준은 가사 키핑 유전자 GAPDH(글리세랄데히드 3-인산염 탈수소효소)로 정규화되었다. 가로 점선은 기준식 수준을 나타냅니다. 비parametric 크루칼- 월리스 테스트는 중요한 경우 던의 포스트 호크 테스트 다음에 테스트 그룹 사이의 비교를 위해 수행되었다. *p & 0.05. 이 그림은 스토터 등 에서수정되었습니다. 18. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
초점 금속 임플란트는 특히 중년 환자및 실패한 1 차 치료 후에 골연드랄 결함에 대한 인양 절차를 나타냅니다. 임상 연구는 유망한 단기 결과를 입증했지만, 관찰 된 합병증은 반대, 토착 연골10에손상이다. 시체 및 생체 역학 연구는 평평하거나 약간 오목한 포지셔닝을 가진 적당한 이식이 자연적인 접촉 압력을 유지한다는 명확한 증거를 보여줍니다19. 마찰 실험은 체외에서 다양한 연골 쌍을 테스트 할 수있는 가능성을 제공합니다. 이러한 경우 적재 조건, 윤활, 재료 페어링 및 지속 시간이 원하는 대로 조정할 수 있습니다.
소 연골은 현지 아바토이르에서 대량으로 구입할 수 있습니다. 세포성 및 구역 구조는 인간대퇴동체(20)와매우 유사하다. 그러나, 프로테오글리칸 함량은 현장특이적이지만, 유전자 발현 수준은 관절 표면을 통해 균일한 것으로 나타났다. 이 프로토콜에서, 골조오진 플러그는 무게 베어링 영역에서 수확되었다. 연골 두께, 콜라겐 아키텍처 및 그로 인한 마찰 학적 특성은 관절표면(16)에비해 지역적 차이를 보여준다. 중단된 콜라겐 네트워크와 전체 조인트 모델에 비해 유체 가압이 변경된 밀폐되지 않은 로딩 설정에서 골조장 플러그를 사용하는 제한을 고려해야 합니다.
대부분의 트리뷸리컬 연구에서 PBS만으로도 보다 강력한 데이터를 생성하는 테스트 솔루션으로 사용됩니다. PBS는 동위 원소 학적 방아력과 버퍼 솔루션이며 생물학적 실험 중에 일정한 pH를 유지하는 데 도움이됩니다. 히알루론산과 PBS를 사용하면 경계 윤활 및 마찰감소(21)를제공한다. 이에 따라, 활액은 마찰 계수를 감소시키고식염수(22)에비해 유체 가압을 향상시킨다. 마찰 계수는 고전적인 Stribeck 곡선에 의해 입증 된 다양한 시스템 특성에 따라 달라집니다. Stribeck 곡선은 마찰 계수와 점도, 속도 및 부하에 관한 것이며 경계, 혼합 및 유체역학윤활의 기본 윤활 제기를 제공합니다. 경계 윤활은 윤활유체로서 PBS만으로 얻을 수 있지만, 로딩 파라미터는 그에 따라 조정되어야 합니다. 테스트에서 전달되는 COF는 스트로크에 대한 평균 값입니다. 따라서, 사이클 동안 상이한 윤활 조건이 발생한다고 가정할 수 있다. 반전 위치에서 정지하는 동안 경계 조건이 우세할 수 있지만 슬라이딩 중에 혼합 윤활이 우세할 수 있습니다. 슬라이딩 사이클 동안 절대 지속 시간을 기준으로, 후자는 평균 COF 값에 더 많은 영향을 미쳤을 것입니다.
일상 활동 중 관절에서 발생하는 생리적 상태를 조사하기 위해 트리미터 소프트웨어에서 로딩 조건을 적절히 조정할 수 있습니다. 압력 민감 측정을 사용하여 원하는 접촉 압력을 확인해야 합니다. 보고된 펨모로티비얼 접촉 압력 범위는 서 있는 동안 1MPa와 내리막 달리기23동안최대 10MPa 사이입니다. 초점 재포장으로, 임플란트 압력은 건강한 관절에 비해 약간 상승(24). 보행 주기 동안 보고된 상대 슬라이딩 속도는 다른 단계에서 높은 변화와 함께 최대 100mm/s로 보고됩니다. 즉, 상대 관절 움직임은 이 트리뷸리컬 설정에 적용할 수 있는 속도를 초과합니다. 건강한 무릎 관절에서 자연적인 운동 조건과 접촉 압력을 모방하기 위해 로딩 조건은 1에서 10 MPa 접촉 압력 및 5 ~ 100mm / s 슬라이딩 속도 범위입니다. 그러나 이 실험용 설정에는 높은 하중을 적용할 수 있지만 슬라이딩 속도의 범위는 제한됩니다. 과부하와 부적절한 부하 모두 병리학 적하 조건도 시뮬레이션될 수 있습니다. 낮은 슬라이딩 속도 또는 정전기 적재는 고정을 동일시하며, 높은 하중은 비생리적 기계적 자극을 나타냅니다.
효소 소화가 연골 특이적 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 이러한 프로토콜에 기재된 원고조직 균질화. cDNA 합성 중, 지침 이외에, 박테리아 MS2로부터의 RNA가 안정화 목적으로 첨가된다. 유전자 발현 수준은 단백질이 아닌, 관절 연골세포의 생합성 활성의 초기 변화를 검출하기 위해 분석되었다. 조직학적 섹션 과 대사 활동 외에도, 이러한 아세약은 관절 연골에 기계적 적재의 효과에 대한 포괄적 인 정보를 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 그들이 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 NÖ Forschungs-und Bildungsges.m.b.H에 의해 투자되었습니다. 생명 과학 호출을 통해 낮은 오스트리아의 지방 정부 (프로젝트 ID: LSC15-019) 오스트리아 COMET 프로그램에 의해 (프로젝트 K2 XTribology, 그랜트 번호 849109).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | A-2942-100ML | |
| buffered formaldehyde solution 4% | VWR | 97131000 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) | Roche Diagnostics | 11465015001 | XTT-based ex vivo toxicology assay |
| CoCrMo raw material | Acnis International | CoCrMo rods 6mm in diameter | |
| CryoStar NX70 Cryostat | Thermo Fischer Scientific | cryosectioning device | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sidma-Aldrich Chemie | D 2438-10ML | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | medium | |
| fetal bovine serum | Gibco | ||
| Hyaluronic acid | Anika Therapeutics Inc. | component of lubricating solution | |
| iCycler | BioRad | thermal cycler | |
| Leica microscope DM?1000 | Leica | microscope for histology | |
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche Diagnostics | ||
| LightCycler 96 | Roche Diagnostics | thermal cycler for PCR | |
| MagNA Lyser Green Beads | Roche Diagnostics | 3358941001 | |
| Osteochondral Autograft Transfer System (OATS) | Arthrex Inc. | cutting tube for harvesting osteochondral cylinders | |
| osteosoft | Merck | 1017279010 | decalcifier-solution |
| Penicillin /Streptomycin | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ML | |
| phosphate?buffered saline | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | PBS | |
| Prescale Low Pressure | Fujifilm | pressure indicating film | |
| RNeasy Fibrous Tissue Kit | QIAGEN | 74404 | |
| Synergy 2 | BioTek Instruments | plate reader | |
| Tetra?Falex MUST | Falex Tribology | Tribometer | |
| Tissue? Tek O.C.T. | SAKURA | 4583 | embedding formulation |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche Diagnostics | 40897030001 | |
| β-mercaptoethanol | Sidma-Aldrich Chemie | M3148 |
References
- Zengerink, M., Struijs, P. A. A. A., Tol, J. L., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral lesions of the talus: a systematic review. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 18 (2), 238-246 (2009).
- Aurich, M., et al. Behandlung osteochondraler Läsionen des Sprunggelenks: Empfehlungen der Arbeitsgemeinschaft Klinische Geweberegeneration der DGOU. Zeitschrift fur Orthopadie und Unfallchirurgie. 155 (1), 92-99 (2017).
- Van Bergen, C. J. A., Zengerink, M., Blankevoort, L., Van Sterkenburg, M. N., Van Oldenrijk, J., Van Dijk, C. N. Novel metallic implantation technique for osteochondral defects of the medial talar dome. Acta Orthopaedica. 81 (4), 495-502 (2010).
- Sweet, S. J., Takara, T., Ho, L., Tibone, J. E. Primary Partial Humeral Head Resurfacing. The American Journal of Sports Medicine. 43 (3), 579-587 (2015).
- Becher, C., et al. Minimum 5-year results of focal articular prosthetic resurfacing for the treatment of full-thickness articular cartilage defects in the knee. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 131 (8), 1135-1143 (2011).
- Lea, M. A., Barkatali, B., Porter, M. L., Board, T. N. Osteochondral Lesion of the Hip Treated with Partial Femoral Head Resurfacing. Case Report and Six-Year Follow-up. HIP International. 24 (4), 417-420 (2018).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Paessler, H. H., Skrbensky, G. Effects of a contoured articular prosthetic device on tibiofemoral peak contact pressure: a biomechanical study. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 16 (1), 56-63 (2007).
- Malahias, M. -A., Chytas, D., Thorey, F. The clinical outcome of the different HemiCAP and UniCAP knee implants: A systematic and comprehensive review. Orthopedic Reviews. 10 (2), (2018).
- Dhollander, A. A. M., et al. The use of a prosthetic inlay resurfacing as a salvage procedure for a failed cartilage repair. Knee Surgery, Sports Traumatology. 23 (8), 2208-2212 (2014).
- Van Bergen, C. J. A. A., van Eekeren, I. C. M. M., Reilingh, M. L., Sierevelt, I. N., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral defects of the talus with a metal resurfacing inlay implant after failed previous surgery. Bone and Joint Journal. 95 (12), 1650-1655 (2013).
- Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Hwang, K. -T. T., Choi, I. -Y. Y. The cartilage degeneration and joint motion of bipolar hemiarthroplasty. International Orthopaedics. 36 (10), 2015-2020 (2012).
- Moon, K. H., et al. Degeneration of Acetabular Articular Cartilage to Bipolar Hemiarthroplasty. Yonsei Medical Journal. 49 (5), 716-719 (2008).
- Wimmer, M. A., Pacione, C., Laurent, M. P., Chubinskaya, S. In vitro wear testing of living cartilage articulating against alumina. Journal of Orthopaedic Research. , (2016).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Simple geometry tribological study of osteochondral graft implantation in the knee. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 232 (3), 249-256 (2018).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Development of a preclinical natural porcine knee simulation model for the tribological assessment of osteochondral grafts in vitro. Journal of Biomechanics. 77, 91-98 (2018).
- Trevino, R. L., et al. Establishing a live cartilage-on-cartilage interface for tribological testing. Biotribology. 9, 1-11 (2017).
- Oungoulian, S. R., et al. Wear and damage of articular cartilage with friction against orthopedic implant materials. Journal of Biomechanics. 48 (10), 1957-1964 (2015).
- Stotter, C., et al. Effects of Loading Conditions on Articular Cartilage in a Metal-on-Cartilage Pairing. Journal of Orthopaedic Research. 37 (12), 2531-2539 (2019).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Tibesku, C. O., von Skrbensky, G. Tibiofemoral contact mechanics with a femoral resurfacing prosthesis and a non-functional meniscus. Clinical biomechanics. 24 (8), Bristol, Avon. 648-654 (2009).
- Temple, D. K., Cederlund, A. A., Lawless, B. M., Aspden, R. M., Espino, D. M. Viscoelastic properties of human and bovine articular cartilage: a comparison of frequency-dependent trends. BMC Musculoskeletal Disorders. , 1-8 (2016).
- Caligaris, M., Ateshian, G. A. Effects of sustained interstitial fluid pressurization under migrating contact area, and boundary lubrication by synovial fluid, on cartilage friction. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (10), 1220-1227 (2008).
- Burris, D. L., Ramsey, L., Graham, B. T., Price, C., Moore, A. C. How Sliding and Hydrodynamics Contribute to Articular Cartilage Fluid and Lubrication Recovery. Tribology Letters. 67 (2), 1-10 (2019).
- Mamat, N., Nor, M. Numerical measurement of contact pressure in the tibiofemoral joint during gait. International Conference on Biomedical Engineering (ICoBE). , 27-28 (2012).
- Manda, K., Ryd, L., Eriksson, A. Finite element simulations of a focal knee resurfacing implant applied to localized cartilage defects in a sheep model. Journal of Biomechanics. 44 (5), 794-801 (2011).
