Kvantificering af makronæringsstoffer Indtag i en termogentisk neuronal skærm ved hjælp af Drosophila Larver

Summary

Beskrevet her er en protokol, der muliggør den kolorimetriske kvantificering af mængden af mad, der spises inden for et defineret tidsinterval af Drosophila melanogaster larver udsat for kost af forskellig makronæringskvalitet. Disse assays udføres i forbindelse med en neuronal termogentisk skærm.

Abstract

Fouragering og fodring adfærd giver dyr adgang til energikilder og næringsstoffer afgørende for deres udvikling, sundhed og fitness. Undersøgelse af neuronal regulering af disse adfærdsmåder er afgørende for forståelsen af de fysiologiske og molekylære mekanismer, der ligger til grund for ernæringsmæssige homøostase. Brugen af genetisk tractable dyremodeller som orme, fluer og fisk letter i høj grad disse typer undersøgelser. I det sidste årti er frugtfluen Drosophila melanogaster blevet brugt som en kraftfuld dyremodel af neurobiologer, der undersøger den neuronale kontrol af fodring og fourageringsadfærd. Mens utvivlsomt værdifulde, undersøger de fleste undersøgelser voksne fluer. Her beskriver vi en protokol, der udnytter det enklere larvenervesystem til at undersøge neuronale substrater, der styrer fodringsadfærd, når larver udsættes for kost, der adskiller sig i deres protein- og kulhydratindhold. Vores metoder er baseret på en kvantitativ kolorimetrisk no-choice fodring assay, udført i forbindelse med en neuronal termogentisk-aktivering skærm. Som en aflæsning blev mængden af mad spist af larver over et 1 timers interval brugt, når den blev udsat for en af de tre farvemærkede kostvaner, der varierer i deres protein til kulhydrater (P: C) nøgletal. Effekten af denne protokol demonstreres i forbindelse med en neurogenetisk skærm i larve Drosophila, ved at identificere kandidat neuronale populationer, der regulerer mængden af mad, der spises i kostvaner af forskellig makronæringskvalitet. Vi var også i stand til at klassificere og gruppere genotyper testet i fænotypiske klasser. Ud over en kort gennemgang af de metoder, der i øjeblikket er tilgængelige i litteraturen, diskuteres fordelene og begrænsningerne ved disse metoder, og der gives også nogle forslag til, hvordan denne protokol kan tilpasses andre specifikke eksperimenter.

Introduction

Alle dyr er afhængige af en afbalanceret kost for at erhverve de nødvendige mængder næringsstoffer til overlevelse, vækst og reproduktion¹. Valget af hvad og hvor meget at spise er påvirket af en lang række interagerende faktorer relateret til dyrets indre tilstand, som mæthedsniveauet og miljøforholdene, såsom fødevarekvalitet^2,3,4,5. Protein og kulhydrater er to store makronæringsstoffer, og dets afbalancerede indtag er afgørende for at opretholde dyrenes fysiologiske processer. Derfor er forståelsen af de neurale mekanismer, der styrer fodringsadfærd og opretholder et afbalanceret indtag af disse makronæringsstoffer, yderst relevant. Dette skyldes, at livshistorieegenskaber som levetid, fecundity og metabolisk sundhed er direkte påvirket af niveauerne af^{proteinindtagsindtag 6,7,8,9,10}.

Brugen af enklere mere tractable organismer, der udviser evolutionært bevarede fodringsvaner med komplekse dyr, herunder pattedyr, er afgørende for denne type undersøgelser. Det er vigtigt, at disse enklere dyremodeller giver en god mulighed for at dissekere komplekse biologiske spørgsmål i en dyr, etisk og teknisk mere effektiv sammenhæng. I de sidste årtier har Drosophila, med sin kraftfulde genetiske værktøjskasse, indviklet og stereotyp adfærd og bevaret arkitektur af perifere og næringsstoffølsomhedsmekanismer med pattedyr, været en frugtbar model for adfærdsmæssige neurobiologer¹¹. I sidste ende er håbet, at ved at forstå, hvordan fødeindtagelse er reguleret i dette dyr, med et enklere nervesystem, kan vi derefter begynde at udrede neuronale funktionsfejl, der ligger til grund for menneskelige spiseforstyrrelser.

Undersøgelsen af neuronale substrater til fodring af adfærd er dybt afhængig af at kunne måle dyrs fødeindtagelse samtidig, mens de manipulerer deres neuronale aktivitet. På grund af de minimale mængder mad, der indtages, er det ekstremt udfordrende at kvantificere mængden af mad, der spises af fluer, og alle tilgængelige metoder udgør i øjeblikket betydelige begrænsninger. Guldstandarden er således at bruge en kombination af komplementære metoder¹². Voksne fluer er historisk set blevet foretrukket som en genetisk og adfærdsmæssig model. Ikke desto mindre tilbyder Drosophila larver også muligheder for at undersøge neuronale substrater, der kodper fodringsadfærd. Larve centralnervesystemet (CNS), med omkring 12.000 neuroner, er betydeligt mindre komplekst end den voksne, som indeholder ca. 150.000 neuroner. Denne lavere kompleksitet er ikke kun numerisk, men også funktionel, da larveadfærd er afhængig af enklere lokomotivfunktioner og sensoriske systemer. På trods af den tilsyneladende enkelhed i deres nervesystemer udviser larver stadig fuldstændig fodringsadfærd, og nogle metoder til at kvantificere madindtagelse i Drosophila larver er blevet beskrevet^5,13,14,15. Ved at parre sig med manipulationer af neuronal aktivitet kan Drosophila larver udgøre en meget tractable model til forståelse af den neurale regulering af fødeindtagelse.

Forudsat her er en detaljeret protokol til at kvantificere fødeindtagelse i larver udsat for kost af forskellig makronæringsstoffer kvalitet. Kostvanerne, såkaldte makronæringsstoffer balancering kostvaner, afveg i protein og kulhydrater indhold, specielt med hensyn til protein til kulhydrat (P: C) nøgletal: 1:1 (protein-rige kost), 1:4 (mellemliggende kost), og 1:16 (protein-dårlig kost), som vist i figur 1A. Kort, en kvantitativ no-choice fodring assay blev etableret ved hjælp af disse tre isocaloric saccharose-gær (SY)-baserede kostvaner farvet med en blå fødevare farvestof. Da gærekstrakt og saccharose blev anvendt som protein- og kulhydratkilder, og begge indeholder kulhydrater, blev variationen i P:C-forholdet opnået ved at ændre balancen mellem disse to komponenter, som tidligere beskrevet¹⁶ og som angivet i figur 1B. En skematisk oversigt over protokollen, der viser de vigtigste eksperimentelle trin, findes i figur 2.

Denne protokol blev oprettet med det formål at undersøge specifikke neuronale populationers rolle i reguleringen af larvefodringsniveauer i kostvaner med forskellige P:C-forhold og i forbindelse med en termogentisk neuronal skærm. Et velkarakterisk neurogenetisk værktøj blev brugt fra Transient Receptor Potential (TRP) familien: Drosophila Transient Receptor Potential kanal (dTRPA1), som er en temperatur og spænding-gated kation kanal, så fyring af handling potentialer, når omgivelsestemperaturerne stiger over 25 ° C¹⁷. For at udtrykke dTRPA1 transgene, vi benyttede os af Gal4 linjer baseret på cis-regulerenderegioner fra Drosophila genom, der er etableret i Rubin laboratorium, i forbindelse med FlyLight projektet på Janelia Research Campus^18,19.

Selvom protokollen, her beskrevet, er blevet etableret i forbindelse med en aktiveringsskærm, kan den let tilpasses af eksperimentatoren til andre specifikke behov eller interesser, nemlig at udføre en undertrykkelsesskærm ved hjælp af den temperaturfølsomme neuronale lyddæmper ShibireTS²⁰, alternativt til dTRPA1. Denne og andre tilpasninger behandles i protokol- og diskussionsafsnittene.

Protocol

1. Tilberedning af saccharosegær (SY) Afveje alle de tørre ingredienser (agar, gær, saccharose) til makronæringsstoffer balancering og L3 opdræt kostvaner. Mængderne i gram for hver af de ingredienser, der er nødvendige for at tilberede 1 L fødevarer, er angivet i figur 1B.BEMÆRK: Tag højde for, at der er behov for ca. 13 mL mad for at fylde en 60 mm petriskål. Opløs alle ingredienser i sterilt destilleret vand (brug ca. 50% af den samlede mængde vand, de…

Representative Results

Drosophila larver regulerer deres proteinindtag på bekostning af indtagelse af overskydende kulhydrater23 (skematisk plot i figur 2E). Faktisk er denne prioritering af proteinindtag blevet observeret hos mange andre dyr og kaldes proteinet, der udnytter24,25. Ved at drage fordel af denne robuste fodring adfærdsmæssige reaktion, en adfærdsbaseret skærm blev designet til…

Discussion

Med denne protokol kunne man teste larvernes evne under termogentisk aktivering af specifikke neuronale populationer til at regulere indtagelsesniveauerne for protein og kulhydrater, to store makronæringsstoffer, når de udsættes for kost af forskellig P:C-sammensætning. Denne metode blev testet i forbindelse med en larveforundersøgelse med det formål at identificere neuronale populationer forbundet med kontrol af fødeindtagelse på tværs af kostvaner af forskellig makronæringskvalitet. Dette arbejde bidrager ogs…

Materials

1.5 mL microtubes	Sarstedt AG & Co.	72.690.001
10xPBS	Nytech	MB18201
2.0 mL microtubes	Sarstedt AG & Co.	72.695.500
60 mm petri dishes	Greiner Bio-one, Austria	628161
96 well microplates	Santa Cruz Biotechnology	SC-204453
Agar	Pró-vida, Portugal
Bench cooler	Nalgene, USA	Labtop Cooler 5115-0032
Blue food dye	Rayner, Billingshurst, UK
Cell disruption media	Scientific Industries, Inc.	888-850-6208	(0.5 mm glass beads)
Dish weight boats	Santa Cruz Biotechnology	SC-201606
Embryo collection cage for 60 mm petri dishes	Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK	FLY1212 (59-100)
Featherweight forceps	BioQuip Products, USA	4750
Fly food for stocks maintenance			1 L food contains: 10 g Agar, 100 g Yeast Extract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionic acid
Forceps #5	Dumont	0108-5-PS	Standard tips, INOX, 11cm
Incubator	LMS Ltd, UK	Series 2, Model 230	For thermogenetic feeding assay (30∘C)
Incubator	Percival Scientific, USA	DR36NL	To stage larvae (19∘C)
Janelia lines	Janelia Research Campus		Detailed information in Table 2
Macronutrient balancing diets			Composition and nutritional information in Figure 1
Methanol	VWR	CAS number: 67-56-1
Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate)	Sigma-Aldrich	H5501
Nitrile gloves	VWR, USA
Refrigerated centrifuge	Eppendorf, Germany	5804 R / Serial number: 5805CI364293
Rubin Gal4 ines	Janelia Research Campus		Stoks available at Bloomington Drosophila Stock Center
ShibireTS UAS line	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC number: 66600	Provided by Carlos Ribeiro Group
Soft brushes			For sorting anaesthetised fruit flies
Spectrophotometer plate reader	Thermo Fisher Scientific	Multiskan Go 51119300
Stereo microscope	Nikon	1016625
Sucrose	Sidul, Portugal
Third-instar larvae (L3) rearing diet			Composition and nutritional information in Figure 1
Timer
Tissue lyzer / bead beater	MP Biomedicals, USA	FastPrep-24 6004500
TRPA1 UAS line	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC number: 26264	Expresses TrpA1 under UAS control; may be used to activate neurons experimentally at 25 ∘C
Water bath	Sheldon Manufacturing Inc., USA	W20M-2 / 03068308 / 9021195
Yeast extract	Pró-vida, Portugal		51% Protein, 15% Carbohydrate