Quantificação da ingestão de Macronutrientes em uma Tela Neuronal Termogenética usando Larvas de Drosophila

Summary

Descrito aqui é um protocolo que permite a quantificação colorimétrica da quantidade de alimentos comidos dentro de um intervalo definido de tempo por larvas de melanogaster Drosophila expostas a dietas de diferentes qualidades macronutrientes. Esses ensaios são conduzidos no contexto de uma tela termogenética neuronal.

Abstract

Comportamentos de forrageamento e alimentação permitem que os animais acessem fontes de energia e nutrientes essenciais para seu desenvolvimento, saúde e condicionamento físico. Investigar a regulação neuronal desses comportamentos é essencial para a compreensão dos mecanismos fisiológicos e moleculares subjacentes à homeostase nutricional. O uso de modelos animais geneticamente tratáveis, como vermes, moscas e peixes, facilita muito esses tipos de estudos. Na última década, a mosca-das-frutas Drosophila melanogaster tem sido usada como um poderoso modelo animal por neurobiólogos que investigam o controle neuronal dos comportamentos de alimentação e forrageamento. Embora sem dúvida valioso, a maioria dos estudos examina moscas adultas. Aqui, descrevemos um protocolo que se aproveita do sistema nervoso larval mais simples para investigar substratos neuronais que controlam comportamentos alimentares quando larvas são expostas a dietas diferentes em seu teor de proteínas e carboidratos. Nossos métodos são baseados em um ensaio de alimentação colorimétrico quantitativo, realizado no contexto de uma tela de ativação termogenética neuronal. Como leitura, a quantidade de alimentos comidos por larvas durante um intervalo de 1h foi usada quando exposta a uma das três dietas rotuladas por corantes que diferem em suas proporções de proteína para carboidratos (P:C). A eficácia deste protocolo é demonstrada no contexto de uma tela neurogenética na Drosophilalarval, identificando populações neuronais candidatas que regulam a quantidade de alimentos consumidos em dietas de diferentes qualidades macronutrientes. Também conseguimos classificar e agrupar os genótipos testados em classes fenotípicas. Além de uma breve revisão dos métodos atualmente disponíveis na literatura, são discutidas as vantagens e limitações desses métodos e, também, algumas sugestões são fornecidas sobre como esse protocolo pode ser adaptado a outros experimentos específicos.

Introduction

Todos os animais dependem de uma dieta equilibrada para adquirir as quantidades necessárias de nutrientes para sobrevivência, crescimento e reprodução¹. A escolha do que e do quanto comer é influenciada por uma infinidade de fatores de interação relacionados ao estado interno do animal, como o nível de saciedade, e condições ambientais, como a qualidade dos alimentos^2,3,4,5. Proteínas e carboidratos são dois grandes macronutrientes e sua ingestão equilibrada é essencial para sustentar os processos fisiológicos dos animais. Portanto, a compreensão dos mecanismos neurais que controlam os comportamentos alimentares e sustentam uma ingestão equilibrada desses macronutrientes é extremamente relevante. Isso ocorre porque traços da história da vida como vida útil, fecundidade e saúde metabólica são diretamente afetados pelos^níveisde ingestão de proteínas 6^,7,8,9,10.

O uso de organismos mais simples e tratáveis que exibem hábitos alimentares evolutivamente conservados com animais complexos, incluindo mamíferos, é essencial para esse tipo de estudo. É importante ressaltar que esses modelos animais mais simples proporcionam uma boa oportunidade para dissecar questões biológicas complexas em um contexto caro, ético e tecnicamente mais eficaz. Nas últimas décadas, a Drosophila, com seu poderoso kit de ferramentas genéticas, comportamento intrincado e estereotipado e arquitetura conservada de mecanismos periféricos e sensoriais de nutrientes com mamíferos, tem sido um modelo frutífero para neurobiólogos comportamentais¹¹. Em última análise, a esperança é que, ao entender como a ingestão de alimentos é regulada neste animal, com um sistema nervoso mais simples, podemos então começar a desembaraçar os defeitos neuronais subjacentes aos distúrbios alimentares humanos.

O estudo de substratos neuronais para comportamentos alimentares depende profundamente de ser capaz de medir simultaneamente a ingestão alimentar dos animais enquanto manipula sua atividade neuronal. Devido às quantidades mínimas de alimentos ingeridos, quantificar a quantidade de alimentos comidos por moscas é extremamente desafiador, e todos os métodos atualmente disponíveis apresentam limitações significativas. Assim, o padrão-ouro é utilizar uma combinação de metodologias complementares¹². Moscas adultas têm sido historicamente favorecidas como um modelo genético e comportamental. No entanto, as larvas de Drosophila também oferecem oportunidades para investigar substratos neuronais codificando o comportamento alimentar. O sistema nervoso central larval (SNC), com cerca de 12.000 neurônios, é significativamente menos complexo que o do adulto, que contém aproximadamente 150.000 neurônios. Essa menor complexidade não é apenas numérica, mas também funcional, uma vez que os comportamentos larvais dependem de funções locomotivas mais simples e sistemas sensoriais. Apesar da aparente simplicidade de seus sistemas nervosos, as larvas ainda apresentam comportamentos alimentares completos, e alguns métodos para quantificar a ingestão de alimentos em larvas de Drosophila foram descritos^5,13,14,15. Ao emparelhar-se com manipulações da atividade neuronal, as larvas de Drosophila podem constituir um modelo altamente tratável para entender a regulação neural da ingestão alimentar.

Prevê-se aqui um protocolo detalhado para quantificar a ingestão de alimentos em larvas expostas a dietas de diferentes qualidades de macronutrientes. As dietas, as chamadas dietas de equilíbrio macronutrientes, diferem nos teores de proteínas e carboidratos, especificamente no que diz respeito às relações proteína-carboidrato (P:C): 1:1 (dieta rica em proteínas), 1:4 (dieta intermediária) e 1:16 (dieta pobre em proteínas), como mostra a Figura 1A. Resumidamente, um ensaio quantitativo de alimentação sem escolha foi estabelecido usando essas três dietas isocalóricas à base de sacarose (SY) tingidas com um corante alimentar azul. Como o extrato de levedura e a sacarose foram utilizados como fontes de proteína e carboidratos, e ambos contêm carboidratos, a variação nas relações P:C foi obtida pela alteração do equilíbrio desses dois componentes, conforme descrito anteriormente¹⁶ e como indicado na Figura 1B. Uma visão geral esquemática do protocolo, mostrando as principais etapas experimentais, está disponível na Figura 2.

Este protocolo foi estabelecido com o objetivo de investigar o papel de populações neuronais específicas na regulação dos níveis de alimentação larval em dietas de diferentes relações P:C e no contexto de uma tela neuronal termogenética. Uma ferramenta neurogenética bem caracterizada foi utilizada a partir da família Transitório Receptor Potential (TRP): Drosophila Transient Receptor Potential channel (dTRPA1), que é um canal de cáção fechado de temperatura e tensão, permitindo o disparo de potenciais de ação quando as temperaturas ambientes sobem acima de 25 °C¹⁷. Para expressar o transgene dTRPA1, aproveitamos as linhas Gal4 baseadas em regiões cis-regulatórias do genoma Drosophila, estabelecidas no laboratório Rubin, no contexto do projeto FlyLight no Janelia Research Campus^18,19.

Embora o protocolo, aqui descrito, tenha sido estabelecido no contexto de uma tela de ativação, ele pode ser facilmente adaptado pelo experimentador para outras necessidades ou interesses específicos, ou seja, realizar uma tela de supressão usando o silenciador neuronal sensível à temperatura ShibireTS^20,em alternativa ao dTRPA1. Esta e outras adaptações são discutidas nas seções de protocolo e discussão.

Protocol

1. Preparação das dietas de sacarose-levedura (SY) Pesar todos os ingredientes secos (ágar, levedura, sacarose) para o balanceamento de macronutrientes e dietas de criação L3. As quantidades em gramas para cada um dos ingredientes necessários para preparar 1 L de alimentos são indicadas na Figura 1B.NOTA: Leve em conta que aproximadamente 13 mL de alimentos são necessários para encher uma placa de Petri de 60 mm. Dissolva todos os ingredientes em água destil…

Representative Results

Larvas de drosophila regulam sua ingestão de proteínas ao custo de ingestão de carboidratos em excesso23 (parcela esquemática na Figura 2E). Na verdade, essa priorização da ingestão de proteínas tem sido observada em muitos outros animais e é chamada de proteína alavancando24,25. Aproveitando-se dessa resposta comportamental de alimentação robusta, uma tela base…

Discussion

Com este protocolo, pode-se testar a capacidade das larvas sob ativação termogenética de populações neuronais específicas para regular os níveis de ingestão de proteínas e carboidratos, dois grandes macronutrientes, quando expostos a dietas de diferentes composiçãos P:C. Este método foi testado no contexto de uma triagem preliminar larval com o objetivo de identificar populações neuronais associadas ao controle da ingestão alimentar em dietas de diferentes qualidades de macronutrientes. Este trabalho tamb?…

Materials

1.5 mL microtubes	Sarstedt AG & Co.	72.690.001
10xPBS	Nytech	MB18201
2.0 mL microtubes	Sarstedt AG & Co.	72.695.500
60 mm petri dishes	Greiner Bio-one, Austria	628161
96 well microplates	Santa Cruz Biotechnology	SC-204453
Agar	Pró-vida, Portugal
Bench cooler	Nalgene, USA	Labtop Cooler 5115-0032
Blue food dye	Rayner, Billingshurst, UK
Cell disruption media	Scientific Industries, Inc.	888-850-6208	(0.5 mm glass beads)
Dish weight boats	Santa Cruz Biotechnology	SC-201606
Embryo collection cage for 60 mm petri dishes	Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK	FLY1212 (59-100)
Featherweight forceps	BioQuip Products, USA	4750
Fly food for stocks maintenance			1 L food contains: 10 g Agar, 100 g Yeast Extract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionic acid
Forceps #5	Dumont	0108-5-PS	Standard tips, INOX, 11cm
Incubator	LMS Ltd, UK	Series 2, Model 230	For thermogenetic feeding assay (30∘C)
Incubator	Percival Scientific, USA	DR36NL	To stage larvae (19∘C)
Janelia lines	Janelia Research Campus		Detailed information in Table 2
Macronutrient balancing diets			Composition and nutritional information in Figure 1
Methanol	VWR	CAS number: 67-56-1
Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate)	Sigma-Aldrich	H5501
Nitrile gloves	VWR, USA
Refrigerated centrifuge	Eppendorf, Germany	5804 R / Serial number: 5805CI364293
Rubin Gal4 ines	Janelia Research Campus		Stoks available at Bloomington Drosophila Stock Center
ShibireTS UAS line	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC number: 66600	Provided by Carlos Ribeiro Group
Soft brushes			For sorting anaesthetised fruit flies
Spectrophotometer plate reader	Thermo Fisher Scientific	Multiskan Go 51119300
Stereo microscope	Nikon	1016625
Sucrose	Sidul, Portugal
Third-instar larvae (L3) rearing diet			Composition and nutritional information in Figure 1
Timer
Tissue lyzer / bead beater	MP Biomedicals, USA	FastPrep-24 6004500
TRPA1 UAS line	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC number: 26264	Expresses TrpA1 under UAS control; may be used to activate neurons experimentally at 25 ∘C
Water bath	Sheldon Manufacturing Inc., USA	W20M-2 / 03068308 / 9021195
Yeast extract	Pró-vida, Portugal		51% Protein, 15% Carbohydrate