Quantifizierung der Zufuhr von Makronährstoffen in einem thermogenetischen neuronalen Bildschirm mit Drosophila Larven

Summary

Beschrieben hier ist ein Protokoll, das die kolorimetrische Quantifizierung der Menge der Nahrung ermöglicht, die innerhalb eines definierten Zeitintervalls von Drosophila melanogaster Larven gegessen wird, die Diäten unterschiedlicher Makronährstoffqualität ausgesetzt sind. Diese Assays werden im Rahmen eines neuronalen thermogenetischen Bildschirms durchgeführt.

Abstract

Futter- und Fütterungsverhalten ermöglichen es Tieren, auf Energiequellen und Nährstoffe zuzugreifen, die für ihre Entwicklung, Gesundheit und Fitness unerlässlich sind. Die Untersuchung der neuronalen Regulation dieser Verhaltensweisen ist für das Verständnis der physiologischen und molekularen Mechanismen, die der Ernährungshomöostase zugrunde liegen, von entscheidender Bedeutung. Die Verwendung genetisch bestückbarer Tiermodelle wie Würmer, Fliegen und Fische erleichtert diese Art von Studien erheblich. In den letzten zehn Jahren wurde die Fruchtfliege Drosophila melanogaster von Neurobiologen als mächtiges Tiermodell verwendet, die die neuronale Kontrolle von Fütterungs- und Futterverhalten untersuchen. Obwohl zweifellos wertvoll, untersuchen die meisten Studien erwachsene Fliegen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das das einfachere Larvennervensystem nutzt, um neuronale Substrate zu untersuchen, die das Fütterungsverhalten kontrollieren, wenn Larven Diäten ausgesetzt sind, die sich in ihrem Protein- und Kohlenhydratgehalt unterscheiden. Unsere Methoden basieren auf einem quantitativen kolorimetrischen No-Choice-Fütterungstest, der im Rahmen eines neuronalen thermogenetischen Aktivierungsbildschirms durchgeführt wird. Als Auslese wurde die Menge an Lebensmitteln, die von Larven über ein Intervall von 1 h gegessen wurden, verwendet, wenn sie einer der drei mit Farbstoffen gekennzeichneten Diäten ausgesetzt wurde, die sich in ihrem Protein-Zu-Kohlenhydrat-Verhältnis (P:C) unterscheiden. Die Wirksamkeit dieses Protokolls wird im Kontext eines neurogenetischen Bildschirms bei Larven Drosophilademonstriert, indem kandidaten neuronale Populationen identifiziert werden, die die Menge der Nahrung regulieren, die in Diäten unterschiedlicher Makronährstoffqualität gegessen wird. Wir waren auch in der Lage, die getesteten Genotypen in phänotypische Klassen zu klassifizieren und zu gruppieren. Neben einem kurzen Überblick über die derzeit verfügbaren Methoden in der Literatur werden die Vorteile und Grenzen dieser Methoden diskutiert und es werden auch einige Vorschläge gemacht, wie dieses Protokoll an andere spezifische Experimente angepasst werden könnte.

Introduction

Alle Tiere sind auf eine ausgewogene Ernährung angewiesen, um die notwendigen Nährstoffmengen für Überleben, Wachstum und Fortpflanzung zu erhalten¹. Die Wahl dessen und wie viel zu essen wird durch eine Vielzahl von interagierenden Faktoren im Zusammenhang mit dem inneren Zustand des Tieres beeinflusst, wie die Sättigungsstufe, und Umweltbedingungen, wie Lebensmittelqualität^2,3,4,5. Protein und Kohlenhydrate sind zwei wichtige Makronährstoffe und seine ausgewogene Aufnahme ist wichtig, um die physiologischen Prozesse der Tiere aufrechtzuerhalten. Daher ist das Verständnis der neuronalen Mechanismen, die das Fütterungsverhalten steuern und eine ausgewogene Aufnahme dieser Makronährstoffe aufrechterhalten, äußerst relevant. Dies liegt daran, dass lebensgeschichtliche Merkmale wie Lebensdauer, Fruchtbarkeit und metabolische Gesundheit direkt durch die Mengen der Proteinaufnahme^6,7,8,9,10beeinflusst werden.

Die Verwendung einfacherer, haltbarer ergewöhnlicher Erregungsorganismen, die evolutionär konservierte Fütterungsgewohnheiten mit komplexen Tieren, einschließlich Säugetieren, aufweisen, ist für diese Art von Studien von wesentlicher Bedeutung. Wichtig ist, dass diese einfacheren Tiermodelle eine gute Gelegenheit bieten, komplexe biologische Fragen in einem kostspieligen, ethisch und technisch effektiveren Kontext zu sezieren. In den letzten Jahrzehnten war Drosophilamit seinem leistungsstarken genetischen Toolkit, komplizierten und stereotypen Verhalten und konservierter Architektur von peripheren und nährstoffsensorischen Mechanismen mit Säugetieren ein fruchtbares Modell für Verhaltensneurobiologen¹¹. Letztlich besteht die Hoffnung, dass wir durch das Verständnis, wie die Nahrungsaufnahme in diesem Tier mit einem einfacheren Nervensystem reguliert wird, dann beginnen können, neuronale Fehlfunktionen zu entwirren, die menschlichen Essstörungen zugrunde liegen.

Die Untersuchung neuronaler Substrate für das Fütterungsverhalten hängt stark davon ab, dass sie gleichzeitig die Nahrungsaufnahme von Tieren messen können, während sie ihre neuronale Aktivität manipulieren. Aufgrund der minimalen Menge an aufgenommenen Lebensmitteln ist die Quantifizierung der Menge an Lebensmitteln, die von Fliegen gegessen werden, äußerst anspruchsvoll, und alle derzeit verfügbaren Methoden stellen erhebliche Einschränkungen dar. Daher ist der Goldstandard eine Kombination komplementärer Methoden¹²zu verwenden. Erwachsene Fliegen wurden historisch als genetisches und Verhaltensmodell bevorzugt. Dennoch, Drosophila Larven, bieten auch Möglichkeiten, neuronale Substrate Codierung Fütterung Verhalten zu untersuchen. Das Larven-Zentralnervensystem (ZNS) mit rund 12.000 Neuronen ist deutlich weniger komplex als das des Erwachsenen, der etwa 150.000 Neuronen enthält. Diese geringere Komplexität ist nicht nur numerisch, sondern auch funktional, da Larvenverhalten auf einfacheren Lokomotivfunktionen und sensorischen Systemen beruht. Trotz der scheinbaren Einfachheit ihres Nervensystems, Larven zeigen immer noch vollständige Fütterungsverhalten, und einige Methoden zur Quantifizierung der Nahrungsaufnahme in Drosophila Larven wurden beschrieben^5,13,14,15. Durch die Kombination mit Manipulationen der neuronalen Aktivität, Drosophila Larven können ein hoch gradlierbares Modell für das Verständnis der neuronalen Regulation der Nahrungsaufnahme bilden.

Hier ist ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung der Nahrungsaufnahme in Larven, die Diäten unterschiedlicher Makronährstoffqualität ausgesetzt sind. Die Diäten, sogenannte Makronährstoffausgleichsdiäten, unterschieden sich in den Protein- und Kohlenhydratgehalten, insbesondere in Bezug auf die Protein-Kohlenhydrat-Verhältnisse (P:C) Verhältnisse: 1:1 (proteinreiche Ernährung), 1:4 (Zwischenernährung) und 1:16 (proteinarme Ernährung), wie in Abbildung 1Adargestellt. Kurz gesagt, wurde ein quantitativer No-Choice-Fütterungstest mit diesen drei isocalorischen Saccharose-Hefe (SY)-basierten Diäten mit einem blauen Lebensmittelfarbstoff gefärbt etabliert. Da Hefeextrakt und Saccharose als Protein- und Kohlenhydratquellen verwendet wurden und beide Kohlenhydrate enthalten, wurde eine Variation der P:C-Verhältnisse durch Änderung des Gleichgewichts dieser beiden Komponenten, wie zuvor beschrieben¹⁶ und wie in Abbildung 1Bangegeben, erreicht. Eine schematische Übersicht über das Protokoll mit den wichtigsten experimentellen Schritten ist in Abbildung 2verfügbar.

Dieses Protokoll wurde mit dem Ziel erstellt, die Rolle spezifischer neuronaler Populationen bei der Regulierung der Larvenfütterungsspiegel in Diäten unterschiedlicher P:C-Verhältnisse und im Rahmen eines thermogenetischen neuronalen Bildschirms zu untersuchen. Ein gut charakterisiertes neurogenetisches Werkzeug wurde aus der Transienten-Rezeptorpotential (TRP)-Familie verwendet: Drosophila Transient Receptor Potential Channel (dTRPA1), ein Temperatur- und spannungsgebundener Kationenkanal, der das Abfeuern von Aktionspotentialen ermöglicht, wenn Umgebungstemperaturen über 25 °C¹⁷steigen. Um die dTRPA1-Transgene auszudrücken, nutzten wir die Gal4-Linien, die auf cis-regulatorischenRegionen aus dem Im Rubin-Labor ansässigen Drosophila-Genom im Rahmen des FlyLight-Projekts am Janelia Research Campus^18,19basieren.

Obwohl das Protokoll, hier beschrieben, im Kontext eines Aktivierungsbildschirms eingerichtet wurde, kann es vom Experimentator leicht an andere spezifische Bedürfnisse oder Interessen angepasst werden, nämlich einen Unterdrückungsbildschirm mit dem temperaturempfindlichen neuronalen Schalldämpfer ShibireTS²⁰durchzuführen, alternativ zu dTRPA1. Diese und andere Anpassungen werden in den Protokoll- und Diskussionsabschnitten diskutiert.

Protocol

1. Zubereitung der Saccharose-Hefe-Diäten (SY) Wiegen Sie alle trockenen Zutaten (Agar, Hefe, Saccharose) für die Makronährstoffausgleich und L3-Aufzucht diäten. Die Mengen in Gramm für jeden der Zutaten, die für die Zubereitung von 1 L Lebensmittel benötigt werden, sind in Abbildung 1Bangegeben.HINWEIS: Berücksichtigen Sie, dass ca. 13 ml Lebensmittel benötigt werden, um eine 60-mm-Petrischale zu füllen. Lösen Sie alle Zutaten in sterilem destilliertem Was…

Representative Results

Drosophila-Larven regulieren ihre Proteinzufuhr auf Kosten der Einnahme überschüssiger Kohlenhydrate23 (schematische Darstellung in Abbildung 2E). Tatsächlich wurde diese Priorisierung der Proteinzufuhr bei vielen anderen Tieren beobachtet und wird als Protein-Hebel24,25bezeichnet. Unter Ausnutzung dieser robusten Fütterungsverhaltensreaktion wurde ein verhaltensbasiert…

Discussion

Mit diesem Protokoll könnte man die Fähigkeit von Larven unter thermogenetischer Aktivierung bestimmter neuronaler Populationen testen, um die Aufnahmevonwerte von Proteinen und Kohlenhydraten, zwei hauptwichtigsten Makronährstoffen, zu regulieren, wenn sie Diäten unterschiedlicher P:C-Zusammensetzung ausgesetzt sind. Diese Methode wurde im Rahmen eines Larven-Vorscreenings getestet, um neuronale Populationen zu identifizieren, die mit der Kontrolle der Nahrungsaufnahme über Diäten unterschiedlicher Makronährstoff…

Materials

1.5 mL microtubes	Sarstedt AG & Co.	72.690.001
10xPBS	Nytech	MB18201
2.0 mL microtubes	Sarstedt AG & Co.	72.695.500
60 mm petri dishes	Greiner Bio-one, Austria	628161
96 well microplates	Santa Cruz Biotechnology	SC-204453
Agar	Pró-vida, Portugal
Bench cooler	Nalgene, USA	Labtop Cooler 5115-0032
Blue food dye	Rayner, Billingshurst, UK
Cell disruption media	Scientific Industries, Inc.	888-850-6208	(0.5 mm glass beads)
Dish weight boats	Santa Cruz Biotechnology	SC-201606
Embryo collection cage for 60 mm petri dishes	Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK	FLY1212 (59-100)
Featherweight forceps	BioQuip Products, USA	4750
Fly food for stocks maintenance			1 L food contains: 10 g Agar, 100 g Yeast Extract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionic acid
Forceps #5	Dumont	0108-5-PS	Standard tips, INOX, 11cm
Incubator	LMS Ltd, UK	Series 2, Model 230	For thermogenetic feeding assay (30∘C)
Incubator	Percival Scientific, USA	DR36NL	To stage larvae (19∘C)
Janelia lines	Janelia Research Campus		Detailed information in Table 2
Macronutrient balancing diets			Composition and nutritional information in Figure 1
Methanol	VWR	CAS number: 67-56-1
Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate)	Sigma-Aldrich	H5501
Nitrile gloves	VWR, USA
Refrigerated centrifuge	Eppendorf, Germany	5804 R / Serial number: 5805CI364293
Rubin Gal4 ines	Janelia Research Campus		Stoks available at Bloomington Drosophila Stock Center
ShibireTS UAS line	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC number: 66600	Provided by Carlos Ribeiro Group
Soft brushes			For sorting anaesthetised fruit flies
Spectrophotometer plate reader	Thermo Fisher Scientific	Multiskan Go 51119300
Stereo microscope	Nikon	1016625
Sucrose	Sidul, Portugal
Third-instar larvae (L3) rearing diet			Composition and nutritional information in Figure 1
Timer
Tissue lyzer / bead beater	MP Biomedicals, USA	FastPrep-24 6004500
TRPA1 UAS line	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC number: 26264	Expresses TrpA1 under UAS control; may be used to activate neurons experimentally at 25 ∘C
Water bath	Sheldon Manufacturing Inc., USA	W20M-2 / 03068308 / 9021195
Yeast extract	Pró-vida, Portugal		51% Protein, 15% Carbohydrate