Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स के मल्टी-पैरामीटर फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए पूरे माउस आंखों का पाचन

Published: June 17, 2020 doi: 10.3791/61348
Automatic Translation
1, *2, *1
1Department of Ophthalmology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Medicine, Division of Rheumatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल मोनोसाइट्स, माइक्रोग्लिया, मैक्रोफेज और डेंड्रिटिक कोशिकाओं सहित विशिष्ट नेत्र मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइटिक आबादी की पहचान करने के लिए बहु-पैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के उद्देश्य से एक एकल कोशिका निलंबन में पूरी आंखों को पचाने की एक विधि प्रदान करता है।

Abstract

जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली यूवेइटिस, मधुमेह रेटिनोपैथी, और उम्र से संबंधित मैकुलर अध: पतन सहित नेत्र रोगविज्ञान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं, विशेष रूप से मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स, ओवरलैपिंग सेल सतह मार्कर व्यक्त करती हैं, जो इन आबादी की पहचान करना एक चुनौती बनाती है। बहु-पैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्री माउस आंखों में मोनोसाइट्स, मैक्रोफेज, माइक्रोग्लिया और डेंड्रिटिक कोशिकाओं को अलग करने के लिए कई सेल सतह मार्कर के एक साथ, मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल पूरे माउस आंखों के परमाणु, नेत्र विच्छेदन, एक एकल कोशिका निलंबन में पाचन, और माइलॉयड सेल मार्कर के लिए एकल कोशिका निलंबन के धुंधला का वर्णन करता है। इसके अतिरिक्त, हम एकल रंग नियंत्रण का उपयोग करके वोल्टेज का निर्धारण करने और फ्लोरेसेंस माइनस वन नियंत्रण का उपयोग करके सकारात्मक फाटकों को चित्रित करने के लिए उचित तरीकों की व्याख्या करते हैं। बहु-पैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्री की प्रमुख सीमा ऊतक वास्तुकला की अनुपस्थिति है। इस सीमा को व्यक्तिगत नेत्र डिब्बों या मानार्थ इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के बहु-पैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा दूर किया जा सकता है। हालांकि, इम्यूनोफ्लोरेसेंस मात्रात्मक विश्लेषण की कमी और अधिकांश माइक्रोस्कोप पर फ्लोरोफोरस की कम संख्या से सीमित है। हम लेजर-प्रेरित कोरोइडल नियोवैस्कुलराइजेशन में मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स का अत्यधिक मात्रात्मक विश्लेषण प्रदान करने के लिए बहु-पैरामेट्रिक फ्लो साइटोमेट्री के उपयोग का वर्णन करते हैं। इसके अतिरिक्त, मल्टी-पैरामीटर फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग ट्रांस्टोमिक या प्रोटेओमिक अध्ययन के लिए मैक्रोफेज सबसेट, भाग्य मानचित्रण और सेल छंटाई की पहचान के लिए किया जा सकता है।

Introduction

जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली में कई सेल प्रकार शामिल हैं जो पूरक सक्रियण और सूजन को प्रोत्साहित करते हैं। जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं में प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाएं, मस्तूल कोशिकाएं, बासोफिल, इओसिनोफिल, न्यूट्रोफिल और मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स शामिल हैं। मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स, जो मोनोसाइट्स, मैक्रोफेज और डेंड्रिटिक कोशिकाओं से बना होते हैं, को यूवेइटिस, डायबिटिक रेटिनोपैथी और उम्र से संबंधित मैकुलर डिजनरेशन (एएमडी)1सहित कई नेत्र स्थितियों के रोगविज्ञान में फंसाया गया है। इस प्रोटोकॉल में, हम नियोवैस्कुलर एएमडी2के माउस मॉडल में बहु-पैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण का उपयोग करके मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स की पहचान पर ध्यान केंद्रित करेंगे। यह प्रोटोकॉल मधुमेह रेटिनोपैथी और/या यूवेइटिस के माउस मॉडल के लिए अनुकूलनीय है, लेकिन इन बीमारियों की प्रणालीगत प्रकृति के कारण अधिक व्यापक नेत्र विच्छेदन की सिफारिश की जाती है ।

मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स सेल सतह मार्कर को ओवरलैपिंग व्यक्त करते हैं। लंबे समय तक चलने वाले ऊतक निवासी मैक्रोफेज और माइक्रोग्लिया जर्दी सैक-व्युत्पन्न एरिथ्रोमायलॉइड जनक3से उत्पन्न होते हैं, जबकि मैक्रोफेज और डेंड्रिटिक कोशिकाओं को रीसाइक्लिंग बोन मैरो-व्युत्पन्न मैक्रोफेज डेन्ड्रिटिक सेल जनकिटर4से अलग करता है। माउस सेल सतह मार्कर मोनोसाइट्स, मैक्रोफेज, और डेंड्रिटिक कोशिकाओं के लिए आम सीडी 45, सीडी 11बी5,F4/806,Cx3cr17,और इंट्रासेलुलर मार्कर Iba18शामिल हैं। इस चुनौती से उबरने के लिए, कई ऊतकों से मैक्रोफेज, मोनोसाइट्स और डेंड्रिटिक कोशिकाओं का ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण सीडी 64 को मैक्रोफेज-विशिष्ट कोशिका सतह मार्कर6के रूप में परिभाषित करता है। स्वस्थ आंखों में आईरिस, कोरॉइड, सिलियरी बॉडी और ऑप्टिक नर्व में मैक्रोफेज का वर्णन किया गया है3। वैकल्पिक रूप से, डेंड्रिटिक सेल पहचान अधिक कठिन है; डेंड्रिटिक सेल आइडेंटिफिकेशन की सबसे विशिष्ट विधि Zbtb46-GFP रिपोर्टर माउस9का उपयोग कर भाग्य मानचित्रण की आवश्यकता है . इस रिपोर्टर लाइन से स्वतंत्र, CD64 की अनुपस्थिति के साथ संयोजन के रूप में CD11c और MHCII की अभिव्यक्ति संभावित डेंड्रिटिक कोशिकाओं की पहचान कर सकते हैं6,10। डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं की पहचान कॉर्निया, कंजक्टिवा, आइरिस और सामान्य आंखों में कोरॉइड में की गई है11। माइक्रोग्लिया रेटिना में स्थित विशेष मैक्रोफेज हैं, जो रक्त-रेटिना बाधा द्वारा संरक्षित हैं, और जर्दी थैली जनक कोशिकाओं से12प्राप्त होते हैं। नतीजतन, रेटिना माइक्रोग्लिया को सीडी 45 अभिव्यक्ति13 और Tmem119 के उच्च स्तर के अपने मंद स्तर से मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज से अलग किया जा सकता है, जो एक प्रवाह साइटोमेट्री एंटीबॉडी14के रूप में उपलब्ध है। माइक्रोग्लिया सक्रियण पर, हालांकि, सीडी 45 को विनियमित किया जा सकता है15 और Tmem119 नीचे विनियमित3हो सकता है, माइक्रोग्लिया जीव विज्ञान की जटिलता का प्रदर्शन करता है और यह एएमडी और इसके माउस मॉडल दोनों में प्रासंगिक होने की संभावना है। अंत में, मोनोसाइट्स को शास्त्रीय और गैर-शास्त्रीय सहित कम से कम दो उपप्रकारों में विभाजित किया जा सकता है। शास्त्रीय मोनोसाइट्स प्रदर्शन CCR2+Ly6Cउच्चCX3CR1कम अभिव्यक्ति, और गैर शास्त्रीय मोनोसाइट्स CCR2-Ly6CकमCX3CR1उच्च मार्कर5प्रदर्शित करता है ।

मार्कर अभिव्यक्ति के मात्रात्मक विश्लेषण की आवश्यकता के कारण, यानी, उच्च बनाम कम/मंद स्तर, बहु-पैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्री मोनोसाइट्स, मैक्रोफेज, माइक्रोग्लिया, और आंखों और अन्य ऊतकों में डेंड्रिटिक कोशिकाओं के बीच भेदभाव के लिए आदर्श तरीका है। अतिरिक्त लाभों में उप-आबादी की पहचान, ट्रांसक्रिप्टोमिक या प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए सेल आबादी को सॉर्ट करने के लिए फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (FACS) का उपयोग करने की क्षमता, और भाग्य मानचित्रण शामिल हैं। मल्टी-पैरामीटर फ्लो साइटोमेट्री का प्रमुख नुकसान ऊतक वास्तुकला की कमी है। कॉर्निया, कंजक्टिवा, आईरिस, लेंस, रेटिना, और कोरॉइड-स्क्लेरा कॉम्प्लेक्स: यह विभिन्न नेत्र उपविभाग में नेत्र विच्छेदन से दूर किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, पुष्टित्मक इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग किया जा सकता है, लेकिन मार्कर की संख्या और मजबूत मात्रा की कमी से सीमित है।

जीनोम वाइड एसोसिएशन अध्ययनों ने एएमडी16के साथ कई पूरक जीनों को जोड़ा है। पूरक सक्रियण एनाफिलाटॉक्सिन उत्पादन, ल्यूकोसिटे भर्ती और परिणामी सूजन की ओर जाता है। पूरक रिसेप्टर की कमी वाले चूहों में, लेजर चोट मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट भर्ती और लेजर-प्रेरित कोरॉइडल नियोवैस्कुलराइजेशन (सीएनवी) क्षेत्र17को कम कर देती है। इसी तरह, सी-सी आकृति केमोकीन रिसेप्टर 2 (CCR2) नॉकआउट माउस, जो ऊतक के लिए मोनोसाइट भर्ती में कमी है, दोनों को दर्शाता है मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट भर्ती और लेजर प्रेरित सीएनवी क्षेत्र18। ये डेटा पूरक और मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स को प्रायोगिक सीएनवी और संभवतः नियोवैस्कुलर एएमडी के साथ जोड़ते हैं। इस संघ के समर्थन में, पूरक रिसेप्टर्स को नियोवैस्कुलर एएमडी19,20के रोगियों में परिधीय रक्त मोनोसाइट्स पर डीसिलेट किया जाता है। ये डेटा एएमडी और मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स के बीच एक मजबूत संबंध प्रदर्शित करते हैं।

इस पांडुलिपि में, हम प्रयोगात्मक लेजर प्रेरित सीएनवी मॉडल का उपयोग बहु-पैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके माउस आंख में मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट आबादी की विशेषता के लिए करेंगे। लेजर-प्रेरित सीएनवी नियोवैस्कुलर एएमडी का मानक माउस मॉडल है, जिसने वर्तमान पहली पंक्ति नियोवैस्कुलर एएमडी थेरेपी21की प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया। यह प्रोटोकॉल माउस आंखों के नाभिक, नेत्र विच्छेदन, एक एकल कोशिका निलंबन में पाचन, एंटीबॉडी धुंधला, एकल रंग नियंत्रण का उपयोग करके लेजर वोल्टेज का निर्धारण, और फ्लोरेसेंस माइनस वन (एफएमओ) नियंत्रण का उपयोग करके गेटिंग रणनीति का वर्णन करेगा। लेजर-प्रेरित सीएनवी मॉडल के विस्तृत विवरण के लिए, कृपया पिछले प्रकाशन22देखें। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम माइक्रोग्लिया, मोनोसाइट्स, डेंड्रिटिक कोशिकाओं और मैक्रोफेज आबादी को परिभाषित करेंगे। इसके अलावा, हम लेजर प्रेरित CNV मॉडल के भीतर मैक्रोफेज सबसेट को आगे परिभाषित करने के लिए MHCII और CD11c का उपयोग करेंगे।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नॉर्थवेस्टर्न यूनिवर्सिटी इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी द्वारा सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई । C57BL/6 चूहों नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय (शिकागो, आईएल) में तुलनात्मक चिकित्सा के लिए केंद्र में एक बाधा सुविधा में रखे समूह थे । सभी जानवरों को भोजन और पानी के लिए मुफ्त पहुंच के साथ 12/12 एच प्रकाश/अंधेरे चक्र में रखे गए थे ।

1. नेत्र ऊतक का संग्रह

  1. बलिदान 10-12 सप्ताह पुराने C57BL/6J चूहों या तो सेक्स के कार्बन डाइऑक्साइड के विनियमित प्रशासन का उपयोग कर जब तक माउस अनुत्तरदायी है और अब साँस लेना । इच्छामृत्यु सुनिश्चित करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था या अन्य अनुमोदित माध्यमिक विधि करें।
    नोट: ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन को परिसंचारी ल्यूकोसाइट्स को हटाने के लिए किया जा सकता है जो नेत्र ऊतकों में नहीं हैं। इस प्रयोग में, प्रणालीगत परफ्यूजन बिना इलाज या लेजर उपचारित पूरी आंखों में पाए गए माइक्रोग्लिया, मोनोसाइट्स, मैक्रोफेज, या डेंड्रिटिक कोशिकाओं की संख्या को कम नहीं करता है। इसलिए, इन कोशिका प्रकारों के बहुमत नेत्र ऊतकों में स्थित हैं और यह कदम वैकल्पिक है।
  2. आंखों को परमाणु रखना, आंखों के सॉकेट के पास नीचे धकेलें, जबकि घुमावदार संदंश की एक जोड़ी को आंख के नीचे धीरे से रख दें क्योंकि यह सॉकेट से बाहर खड़ा है। चुटकी संदंश वास्तविक आंख निचोड़ के बिना आंख के नीचे बंद कर दिया। आसपास के कंजक्टिवा से आंख उखाड़ फेंकना (पूर्व प्रकाशन देख)23।
  3. आंखों को अलग करने के लिए ऑप्टिक तंत्रिका केवल शेष कनेक्शन होने तक आंखों को बाद में खींचें। ऑप्टिक तंत्रिका अक्सर तनाव के साथ तोड़ देती है, लेकिन ऑप्टिक तंत्रिका को काटने के लिए कभी-कभी एक छोटा कैंची आवश्यक होती है। 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ ठंडे 1x हैंक के बफर नमकीन सॉल्यूशन (एचबीएसएस) में आंख रखें।

2. नेत्र ऊतक का पाचन

  1. कोल्ड एचबीएसएस में 0.1 मिलीग्राम/एमएल पाचन एंजाइम और 0.2 मिलीग्राम/एमएल डीएनएसई युक्त पाचन बफर तैयार करें। शुरू में बाँझ पानी के 2 मिलील में 5 मिलीग्राम पाचन एंजाइम का पुनर्गठन करें। एचबीएसएस में 10 मिलीग्राम/एमएल DNase का प्रारंभिक कमजोर पड़ने की तैयारी करें । पाचन बफर के प्रत्येक 10 एमएल के लिए (3 जानवरों के लिए पर्याप्त) 0.4 मिलीएल के साथ ठंडे एचबीएसएस के 9.4 एमएल और पतला डीनैस I के 0.2 एमएल मिश्रण करते हैं।
    नोट: ये सांद्रता कोशिका मृत्यु को कम करते हुए एकल कोशिकाओं के एंटीबॉडी धुंधला के इष्टतम स्तर प्रदान करने के लिए कई प्रयोगों पर अनुभवजन्य रूप से निर्धारित की गई थी। कोलेजन डी को कम कोशिका व्यवहार्यता और सीडी 45+ कोशिकाओं में कमी के साथ पाचन एंजाइम के विकल्प के रूप में आजमाया गया था। कृपया पाचन को अनुकूलित करने के लिए पुनरावृत्ति प्रक्रिया के बारे में अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें।
  2. 10x कुल आवर्धन पर एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, ठंडे एचबीबीएस में ठीक संदंश और वसंत कैंची का उपयोग कर शेष कंजक्टिवा और ऑप्टिक तंत्रिका को हटा दें।
  3. एक सूखी विच्छेदन पकवान या छोटे वजन नाव के लिए साफ आंखें ले जाएँ। 0.15-0.20 mL/विट्रियस गुहा में 30 जी सुई के साथ लगे सिरिंज के माध्यम से पाचन बफर की आंख इंजेक्ट करें, जब दृश्य धुरी के माध्यम से आंख में दो छिद्रित घाव किए जाते हैं और पाचन बफर एग्रेस के लिए इस पहले घाव से 90 डिग्री दूर होते हैं।
  4. 0.5 मिमी x 0.5 मिमी से छोटे सभी टुकड़ों के साथ वसंत कैंची और ठीक संदंश का उपयोग करके पूरी आंखों को कीमा। बाद के चरणों में पिपेट युक्तियों को रोकने के लिए संदंश के माध्यम से कुंद यांत्रिक व्यवधान के साथ लेंस ऊतक को अलग करें। प्रत्येक नमूने के लिए, छोटे पकवान में पाचन बफर के 0.75 एमएल के साथ प्रत्येक संदंश और कैंची कुल्ला। प्रत्येक नमूने के लिए एक नई डिश का उपयोग करें।
  5. पिपेट हस्तांतरण में किसी भी सामग्री को खोने के लिए ध्यान रखते हुए P1000 पिपेट का उपयोग करके बर्फ पर एक वियोजन ट्यूब में पकवान की सामग्री स्थानांतरित करें। पाचन बफर के अतिरिक्त 1.5 एमएल के साथ डिश कुल्ला 3.25-3.50 एमएल करने के लिए वियोजन ट्यूब में कुल मात्रा लाने।
  6. इलेक्ट्रॉनिक वियोजन पर उलटा डिससोशेशन ट्यूब रखें और साइकिल "m_brain_03_01" चलाएं, जिसमें कमरे के तापमान पर 200 आरपीएम पर 1 मिनट एकदिशात्मक रोटेशन शामिल है, जो एक पूर्व-लोडेड कार्यक्रम है। सुनिश्चित करें कि सभी ऊतक पाचन बफर और इसके लिए रोटर और शेष सभी चरणों के संपर्क में वियोजन ट्यूब के नीचे हैं।
  7. 37 डिग्री सेल्सियस पर 200 आरपीएम पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर मिलाते हुए में वियोजन ट्यूब रखें।
  8. कदम 2.6 और 2.7 एक अतिरिक्त समय दोहराएं। दूसरे 30 मिनट के बाद इनक्यूबेशन कदम 2.6 में इलेक्ट्रॉनिक वियोजना का उपयोग करके एक अंतिम यांत्रिक पाचन करते हैं।
  9. ठंडे प्रवाह बफर के 10 एमएल जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो और बर्फ पर ट्यूब रखें।

3. सेल निलंबन की तैयारी

  1. एकल कोशिका निलंबन बनाने के लिए, एक 50 एमएल शंकुकीय अपकेंद्रित्र ट्यूब के शीर्ष पर रखा एक 40 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से रोका आंख पाचन प्रतिक्रिया डालना। 2.5 एमएल सिरिंज से प्लंजर का उपयोग करके, फिल्टर के माध्यम से अपाच्य आंखों के ऊतकों के किसी भी शेष टुकड़े को धक्का देते हैं।
  2. प्रवाह बफर के 10 एमएल के साथ वियोजन ट्यूब धोएं और फिल्टर के माध्यम से फिर से अपाच्य आंखों के ऊतकों के टुकड़ों को पारित करने के लिए एक ही प्लंजर का उपयोग करने से पहले फिल्टर कुल्ला।
  3. 5 एमएल फ्लो बफर का उपयोग करके चरण 3.2 दोहराएं।
  4. वियोजन ट्यूब को धोएं और फ्लो बफर के अंतिम 10 एमएल के साथ फ़िल्टर करें।
    नोट: पाचन और प्रवाह बफर की कुल मात्रा प्रत्येक नमूने के लिए लगभग 38-40 एमएल है।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर शंकु नली को सेंट्रलाइज करें। सेल पेलेट को परेशान किए बिना सुपरनेट को डिसेंट करें।
  6. बाँझ पानी में 10x lysing समाधान जोड़कर 1x lysing समाधान तैयार करें। एक और ट्यूब के खिलाफ ट्यूब फ्लिकिंग द्वारा गोली तोड़। लाल रक्त कोशिकाओं को lyse करने के लिए, कमरे के तापमान (आरटी) पर घूमता के साथ 30 एस के लिए 1x lysing समाधान के 1 एमएल जोड़ें ।
  7. फ्लो बफर के 20 एमएल के साथ प्रतिक्रिया बंद करो।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर शंकु नली को सेंट्रलाइज करें। सेल पेलेट को परेशान किए बिना सुपरनेट को डिसेंट करें।
  9. एक और ट्यूब के खिलाफ ट्यूब फ्लिकिंग द्वारा गोली को अलग करें। प्रति ट्यूब कोल्ड 1x एचबीएसएस का 5 एमएल जोड़ें।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज ट्यूब। एस्पिरेट सुपरनेट।

4. मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स के लिए सेल निलंबन का धुंधला

  1. कोल्ड एचबीएसएस में लाइव/डेड डाई 1:5,000 को कमजोर करके प्रति सैंपल लाइव/डेड दाग का ०.५ एमएल तैयार करें ।
  2. एक P1000 पिपेट का उपयोग कर प्रत्येक नमूने के लिए लाइव/मृत दाग जोड़ें जिससे गोली को पूरी तरह से अलग करना सुनिश्चित हो । नमूनों को 1.2 एमएल माइक्रो टाइटर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. हीमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर (4.4 देखें) का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करने के लिए एक छोटा एलिकोट (10 माइक्रोल) लें। अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए लाइव/मृत दाग के साथ इनक्यूबेट नमूने ।
  4. प्रति नमूना जीवित कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए ट्राइपैन ब्लू का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
    नोट: आमतौर पर, एक 10-12 सप्ताह पुराने C57BL/6J माउस से 2 आंखें 2 x 106 जीवित कोशिकाओं से कम होते हैं ।
  5. कोल्ड फ्लो बफर के 400 माइक्रोन जोड़कर नमूने धोएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर एक माइक्रो टाइटर ट्यूब रैक में सेंट्रलाइज ट्यूब। सेल पैलेट को परेशान किए बिना सुपरनेट को एस्पिरेट करें।
  6. कोल्ड फ्लो बफर के 500 माइक्रोन में पूरी तरह से कोशिकाओं को पुनर्सुल् पेंड करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर एक माइक्रो टाइटर ट्यूब रैक में सेंट्रलाइज ट्यूब। सेल पैलेट को परेशान किए बिना सुपरनेट को एस्पिरेट करें।
  7. एफसी ब्लॉक के 50 माइक्रोन में 5 x 106 जीवित कोशिकाओं को ब्लॉक करें (शुद्ध चूहा विरोधी माउस सीडी 16/सीडी32 के कोल्ड फ्लो बफर में 1:50 कमजोर पड़ने)। यदि 5 x 106 जीवित कोशिकाओं से अधिक है, तो मात्रा में उचित वृद्धि करें।
  8. नमूना को पूरी तरह से अलग करना सुनिश्चित करने के लिए गोली में एफसी ब्लॉक जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  9. एंटीबॉडी धुंधला समाधान के 50 μL जोड़ें (विकल्प और प्रत्येक एंटीबॉडी की मात्रा है कि समाधान में शामिल है के लिए तालिका 1 देखें) प्रति 5 x 10 6 जीवित कोशिकाओं को सीधे एफसी ब्लॉक में कोशिकाओं के लिए और पूरीतरह से मिश्रण । 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: एंटीबॉडी मात्रा प्रवाह साइटोमीटर विन्यास पर निर्भर हैं और हर प्रयोगशाला और साधन के लिए स्वतंत्र रूप से titrated किया जाना चाहिए। फिल्टर और दर्पण के साधन विन्यास के लिए तालिका 2 देखें। एंटीबॉडी को टिट्रेट करने के लिए, निर्माता की सिफारिश के साथ शुरू करें, और धुंधला सूचकांक की गणना करें। अलग-अलग एंटीबॉडी सांद्रता (निर्माता की सिफारिश के ऊपर और नीचे दोनों) का परीक्षण करें और एंटीबॉडी की सबसे कम एकाग्रता चुनें जहां धुंधला सूचकांक बनाए रखा जाता है। इसके अलावा, यह सुनिश्चित करें कि सकारात्मक धुंधला जो एकल रंग नियंत्रण की तुलना में कम उज्ज्वल है। यह सुनिश्चित करने के लिए दागदार कोशिकाओं का उपयोग करें कि नकारात्मक रूप से दाग वाली कोशिकाएं पैमाने पर हों और 1 x 102से कम या उससे कम पर एक चोटी हो । सकारात्मक दाग कोशिकाओं को परिभाषित करने के लिए एक फ्लोरेसेंस माइनस एक नियंत्रण का उपयोग करें।
  10. कोल्ड फ्लो बफर के 700 माइक्रोन जोड़कर नमूने धोएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर एक माइक्रो टाइटर ट्यूब रैक में सेंट्रलाइज ट्यूब। सेल पैलेट को परेशान किए बिना सुपरनेट को एस्पिरेट करें।
  11. वैकल्पिक रूप से, एंटीबॉडी धुंधला होने के बाद, नमूनों को फ्लो बफर में 2% पैराफॉर्मलडिहाइड के 500 माइक्रोन के साथ तय किया जा सकता है। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए नमूने ठीक करें। फिर, 4.10 में वर्णित एक धोने का प्रदर्शन करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर तय नमूनों की दुकान। गिनती मोती प्रवाह साइटोमेट्री डेटा संग्रह के दिन जोड़ा जाना चाहिए। फिक्स्ड नमूनों को 1-2 दिनों में फ्लो साइटोमीटर पर चलाया जाना चाहिए।
    सावधानी: पैराफॉर्मल्डिहाइड एक संक्षारक और स्वास्थ्य के लिए खतरा है।
  12. कोल्ड फ्लो बफर के 500 माइक्रोन का उपयोग करके नमूनों को फिर से धोएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर एक माइक्रो टाइटर ट्यूब रैक में सेंट्रलाइज ट्यूब। सेल पेलेट को परेशान किए बिना आधे सुपरनेट को एस्पिरेट करें।
  13. Resuspend छर्रों और एक ९६ अच्छी तरह से, यू नीचे परख प्लेट में स्थानांतरित । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज प्लेट। सुपरनैंट को कम करने के लिए, प्लेट को चालू करें और एक मजबूत शेक में तरल को सिंक बेसिन में उखाड़ फेंकें, बिना किसी परेशान किए गोली।
  14. एक नई 1.2 मिलील माइक्रो टाइटर ट्यूब में, अच्छी तरह से भंवर गिनती मोती के 50 माइक्रोल रखें।
  15. कोल्ड फ्लो बफर के 200 माइक्रोन में 96 वेल प्लेट में छर्रों को फिर से पेंड करें। पूर्व चरण से मोतियों के शीर्ष पर सेल मिश्रण जोड़ें। 250 माइक्रोटल /माइक्रो टाइटर ट्यूब की कुल मात्रा में फ्लो साइटोमीटर पर चलाएं।

5. प्रवाह साइटोमेट्री डेटा का संग्रह

  1. चालू करें और प्रवाह साइटोमीटर तैयार करें। यहां सूचीबद्ध निर्देश एक संशोधित चार लेजर साइटोमीटर(तालिका 2)के लिए हैं।
  2. एक परीक्षण नमूना चलाएं, जिसमें प्रत्येक नमूने से एक छोटा सा एलिकोट शामिल है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी कोशिकाएं प्रत्येक डिटेक्टर के लिए पैमाने पर हैं। वोल्टेज को समायोजित करें ताकि सभी कोशिकाएं पैमाने पर हों।
  3. स्टेनिंग कॉकटेल(टेबल 3)में उपयोग किए जाने वाले हर फ्लोरोफोर के लिए एकल रंग नियंत्रण (एससीसी) चलाएं। प्रवाह साइटोमीटर चरण पर प्लेसमेंट के लिए एक बड़े 5 एमएल पॉलीस्टीरिन ट्यूब में माइक्रो टाइटर ट्यूब रखें।
    नोट: BV421 (पैसिफिक ब्लू), फिटसी, पीई, एलेक्सा647 (एपीसी) और एलेक्सा700 जैसे रूट फ्लोरोफोरस को कॉकटेल (यानी, CD64 पीई के लिए CD19 पीई) के समान एंटीबॉडी की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, पीई-CF594, पीई-Cy7, या एपीसी-Cy7 जैसे मिलकर फ्लोरोफोरस को संयुग्मित फ्लोरोफोरस के संभावित वियोजन के कारण कॉकटेल के रूप में एससीसी के लिए एक ही एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है।
    1. हम्सटर एंटी-माउस सीडी 11c बीवी 421 के 1 माइक्रोन के साथ 1.2 एमएल टाइटर ट्यूब में मुआवजे के मोतियों की 2 बूंदें जोड़कर बीवी 421 के लिए एससीसी बनाएं। मुआवजा मोतियों का उपयोग इसलिए किया जाता है क्योंकि CD11c BV421 5.3.3 में वर्णित कापा के बजाय एक आईजीजी लैम्ब्डा उपप्रकार है। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट। फ्लो बफर का 0.2 एमएल जोड़ें।
    2. अमीन प्रतिक्रियाशील मोतियों से सकारात्मक धुंधला मोतियों (हरी टोपी) की एक बूंद जोड़कर लाइव/डेड डाई के लिए एससीसी बनाएं, इसके बाद लाइव/डेड डाई का 1 माइक्रोन करें । अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट। अमीन प्रतिक्रियाशील मोतियों से नकारात्मक मोतियों (सफेद टोपी) की एक बूंद जोड़ें। फ्लो बफर का 0.2 एमएल जोड़ें।
    3. एंटी-रैट और एंटी-हम्सटर आईजी कप्पा मनका सेट से सकारात्मक धुंधला मोतियों (ग्रीन कैप) की एक बूंद जोड़कर शेष एससीसी बनाएं, इसके बाद 1.2 एमएल टिटर ट्यूब में एंटीबॉडी क्वांटिटी(टेबल 3)सूचीबद्ध है। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट। विरोधी चूहे और विरोधी हम्सटर आईजी कप्पा मनका सेट से नकारात्मक मोतियों (सफेद टोपी) की एक बूंद जोड़ें। फ्लो बफर का 0.2 एमएल जोड़ें।
    4. भंवर सभी मनका मिश्रण पूरी तरह से। एससीसी को 3 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: फ्लोरोसेंट रिपोर्टर चूहों के लिए एससीसी असंता कोशिकाओं है ।
    5. एससीसी चलाते समय, वोल्टेज सेट करें जैसे कि एससीसी नमूने में एक ही डिटेक्टर चैनल में कोशिकाओं के नमूने के लिए किसी भी फ्लोरेसेंस से अधिक चोटी है। इसके अलावा, वोल्टेज सेट किया जाना चाहिए ताकि किसी भी एससीसी में किसी भी अन्य चैनल(चित्रा 1)बनाम ब्याज के चैनल में हिस्टोग्राम पीक के बीच कम से कम 0.5 लॉग अंतर हो।
  4. "कम" घटनाओं को रखने पर नमूने चलाने/ यदि प्रवाह दर को उचित रूप से कम नहीं किया जा सकता है, तो अतिरिक्त ठंडे प्रवाह बफर के साथ नमूनों को पतला करें। जोड़ा गया वॉल्यूम रिकॉर्ड करें क्योंकि यह गणना गणना के लिए आवश्यक होगा (प्रतिनिधि परिणाम देखें)।
  5. प्रति सैंपल कम से कम 3 x 106 घटनाएं लीजिए। यह वर्णक कणिकाओं और मलबे के कारण सेल संख्या से अधिक हो सकता है जो आपके साइटोमीटर पर घटनाओं के रूप में गिनती करता है।
  6. धारा 6.4 में उचित गेटिंग रणनीति के लिए लाइव/डेड के अलावा प्रत्येक फ्लोरोफोर के लिए फ्लोरेसेंस माइनस वन (एफएमओ) रिकॉर्ड करें। एक एफएमओ एक नमूना है जिसे एक को छोड़कर सभी फ्लोरोफोरस के साथ दाग दिया गया है।
  7. निर्माता या सुविधा निर्देशों के अनुसार प्रवाह साइटोमीटर को साफ और बंद करें।

6. प्रवाह साइटोमेट्री डेटा का एनोटेशन

  1. विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक नई वर्कशीट खोलें। सभी नमूनों और एकल रंग नियंत्रण के लिए साइटोमीटर से एफसीएस फ़ाइलों का आयात करें।
  2. एक मुआवजा मैट्रिक्स बनाने के लिए एससी का उपयोग करें।
  3. अपने दाग नमूनों और एफएमओ के लिए मुआवजा मैट्रिक्स लागू करें।
  4. फाटक आकर्षित करने के लिए सकारात्मक धुंधला निर्धारित करने के लिए FMOs का उपयोग करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

चित्रा 1 ने लाल लेजर के लिए एससी और कोशिकाओं के लिए बिना मुआवजा आवृत्ति हिस्टोग्राम दिखाए: Alexa647, Alexa700, और एपीसी-Cy7। चित्रा 1Aमें, मजेंटा लाइन ने एलेक्सा 647 के लिए एससीसी की चोटी को चित्रित किया, जबकि सियान लाइन ने इच्छित 0.5 लॉग अंतर दिखाया। ध्यान दें कि Alexa700 और एपीसी-Cy7 में चोटी सियान लाइन के बाईं ओर (कम उज्ज्वल) के लिए किया गया था । यह भी ध्यान रखें कि कोशिकाएं सभी मजेंटा लाइन के बाईं ओर थीं। एससीसी पीक के दाईं ओर किसी भी कोशिकाओं को मुआवजा नहीं दिया गया । विशिष्ट चैनल फ्लोरोक्रोम रंगों (यानी) के रसायन शास्त्र के आधार पर दूसरों में फैलने के लिए जाने जाते थे। वायलेट लेजर: BV421 -> V500, येलो-ग्रीन लेजर: पीई-> पीई-CF594, रेड लेजर: Alexa647 -> Alexa700, Alexa700 -> एपीसी-Cy7, क्रॉस लेजर: पीई-Cy7 -> एपीसी-Cy7) । यदि उपरोक्त शर्तों में से किसी को पूरा नहीं किया गया था, तो एक चैनल के वोल्टेज को ऊपर की ओर समायोजित किया जा सकता है जबकि किसी भी फैल चैनलों को नीचे ले जाया जा सकता है। लाल लेजर के अतिरिक्त उदाहरणों के लिए चित्रा 1B और चित्रा 1C देखें। एक बार वोल्टेज निर्धारित किया गया था और फिर दर्ज की गई, सभी नमूनों वोल्टेज मापदंडों के साथ चलाया जाना चाहिए । एक मुआवजा सेट जादूगर मौजूद है और मददगार हो सकता है ।

सेल काउंट की मात्रा के लिए मनका पहचान की गणना आवश्यक है। चित्रा 2A एक ही माउस की दो आंखों से सभी का विश्लेषण घटनाओं के लिए FSC-A बनाम एसएससी-एक गुण दिखाया । एसएससी वोल्टेज को समायोजित करना महत्वपूर्ण है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि आपकी गिनती मोती एसएससी-एउच्च और एफएससी-एकम घटनाओं के बहुत तंग संग्रह के रूप में दिखाई दे रहे हैं। मनका गिनती साफ किया गया और पीई बनाम एपीसी-Cy7 (चित्र 2B) की साजिश रचने से पुष्टि की । स्वच्छ मोती पीई+ और एपीसी-Cy7-घटनाओं के एक तंग क्लस्टर थे ।

सिंगल्स और लाइव सेल को सभी घटनाओं से अगले पहचाने गए । सिंगल्स का निर्धारण एफएससी-एच बनाम एफएससी-ए की साजिश रचकर किया गया था । इन दो गुणों में सिंगल्स सकारात्मक रूप से सहसंबद्ध थे जबकि डबल और ट्रिपल कोशिकाओं में एफएससी-एच(चित्रा 2 सी)की तुलना में अधिक एफएससी-ए था। लाइव कोशिकाओं को लाइव/डेड बनाम एफएससी-ए की साजिश रचने से चित्रित किया गया था । मृत कोशिकाओं लाइव थे/मृत सकारात्मक, और कोशिकाओं को मलबे (चित्र 2 डी) की तुलना में अधिक FSC-एक प्रदर्शित करता है । ध्यान दें कि गिनती मोती लाइव थे/

चित्र 3 लाइव, सिंगलेट कोशिकाओं से मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स के चित्रण के लिए प्रारंभिक गेटिंग रणनीति दिखाता है। लाइव सिंगल्स को सीडी 45 बनाम सीडी 11बी प्लॉट(चित्रा 3, बाएं)का उपयोग करके कल्पना की गई थी। ध्यान दें कि CD45+CD11b- (ज्यादातर बी-कोशिकाएं और टी-सेल), सीडी 45मंदसीडी 11बी+ (ख्यात माइक्रोग्लिया), और सीडी 45+सीडी 11बी+ कोशिकाएं (घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं, लेजर के साथ बढ़ी हुई [अंजीर 3 बी, बाएं]) का चयन किया गया। CD45FMO में CD45 + कोशिकाओं की अनुपस्थिति ने गेट चयन(चित्रा 3 सी, बाएं)की पुष्टि की। इसके बाद, न्यूट्रोफिल, इओसिनोफिल्स, बी-सेल, एनके कोशिकाओं और टी-कोशिकाओं को वंशावली गेट (लिन: Ly6G [न्यूट्रोफिल्स], सिग्लेसीएफ [eosinophils], B220 [बी-सेल], NK1.1 [एनके कोशिकाओं], सीडी 4 [टी-सेल], और सीडी 8 [टी-सेल]) का उपयोग करके सीडी 45+ लाइव सिंगल्स की साजिश रचने से बाहर रखा गया था। CD11b+लिनमें वृद्धि - कोई लेजर(चित्रा 3A,मध्य) और लेजर(चित्रा 3B,मध्य) समूहों के बीच कोशिकाओं को आसानी से देखा गया था। CD11b+लिन-कोशिकाओं की कमी CD11b FMO(चित्रा 3C,मध्य) और लिन एफएमओ(चित्रा 3C,सही) में लिन+ कोशिकाओं की कमी पर ध्यान दें । माइक्रोग्लिया को सीडी 45 अभिव्यक्ति13,24की मात्रा से मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स में घुसपैठ से अलग किया जा सकता है । CD11b+लिन- कोशिकाओं को CD45मंद ख्यात माइक्रोग्लिया और सीडी 45उच्च घुसपैठ मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स की पहचान करने के लिए CD11b बनाम सीडी 45 साजिश का उपयोग करके कल्पना की गई थी। CD45उच्च मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स में सापेक्ष वृद्धि लेजर-इलाज माउस(चित्रा 3ए, बी,दाएं) में स्पष्ट थी।

चित्रा 4 की पहचान माइक्रोग्लिया, तीन मैक्रोफेज सबसेट, मोनोसाइट्स, और डेंड्रिटिक कोशिकाएं। माइक्रोग्लिया एक CD64 बनाम MHCII साजिश(चित्रा 4, बाएंपैनल) पर CD45मंद कोशिकाओं की साजिश रचने से निर्धारित किया गया । माइक्रोग्लिया को CD64+MHCIIकम पहले13दिखाया गया है । माइक्रोग्लिया C64 एफएमओ(चित्रा 4ए, सी बाएं) में लेजर और अनुपस्थित के साथ अपेक्षाकृत अपरिवर्तित थे। CD45उच्च कोशिकाओं को अगले एक ही सीडी 64 बनाम MHCII ग्राफ पर साजिश रची गई । CD64+MHCII- मैक्रोफेज (MHCII- Macs), CD64-MHCII- मोनोसाइट्स, और MHCII+ कोशिकाओं की पहचान की गई (चित्रा 4ए, बी,मध्य बाएं)। MHCIIएफएमओ (चित्रा 4C,मध्य बाएं) में MHCII + कोशिकाओं की अनुपस्थिति पर ध्यान दें । MHCII+ कोशिकाओं को आगे CD64 और CD11c का उपयोग कर भेदभाव किया गया । CD64+CD11c-मैक्रोफेज (CD11c-Macs), CD64+CD11c+ मैक्रोफेज (CD11c+ Macs), और CD64-CD11c+ dendritic कोशिकाओं (DCs) परिभाषित किया गया(चित्रा 4A, B,मध्य सही) । CD11cFMO (चित्रा 4C,मध्य सही) में CD11c + कोशिकाओं की अनुपस्थिति पर ध्यान दें। मोनोसाइट्स को शास्त्रीय Ly6C+ या गैर-शास्त्रीय Ly6C- मोनोसाइट्स(चित्र 4, दाएं) केरूप में उप-प्रकारक थे। Ly6CFMO (चित्रा 4C,सही) में Ly6C + मोनोसाइट्स की अनुपस्थिति पर ध्यान दें।

माउस प्रति कोशिकाओं की संख्या (या प्रति 2 आंखें) निम्नलिखित समीकरण के साथ गणना की गई थी:

Equation 1

इस विधि में संस्करणों का उपयोग करना, समीकरण है:

Equation 2

सेल गिनती और मनका गिनती प्रत्येक नमूने के लिए विशिष्ट हो जाएगा। मोतियों की एकाग्रता प्रत्येक गणना मोतियों के प्रत्येक के लिए विशिष्ट है और प्रत्येक शीशी पर निर्माता द्वारा प्रदान की जाती है।

मैक्रोफेज लेजर इंजरी25के बाद कोरॉइड में घुसपैठ करते हैं और मैक्रोफेज घटने से सीएनवी क्षेत्र18कम हो जाता है । ये पुराने अध्ययन इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग पर भरोसा करते हैं, जो मैक्रोफेज पहचान के लिए मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स, या कम प्रवाह साइटोमेट्रिक मार्कर को मज़बूती से अलग नहीं कर सकते हैं। मैक्रोफेज विषमता जन्मजात इम्यूनोलॉजी में एक उभरती हुई अवधारणा है, जहां मैक्रोफेज अपनी उत्पत्ति और ऊतक माइक्रोएनवायरमेंट12, 26के आधार पर कई कार्यों को करने में सक्षम हैं। हमने मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स और मैक्रोफेज विषमता की पहचान करने के लिए लेजर चोट के बाद 3 दिन पर अनुपचारित और लेजर इलाज माउस आंखों पर बहु-पैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्री का प्रदर्शन किया। लेजर उपचार मेंMHCII-, CD11c-, और CD11c+ मैक्रोफेज में क्रमशः 7.0-25.6, 2.8-7.2 और 3.9-8.2 गुना(चित्रा 5ए, सी)की वृद्धि हुई । डेंड्रिटिक सेल काउंट भी लेजर(चित्रा 5F)द्वारा 4.5-4.7 गुना-विनियमित थे। माइक्रोग्लिया और मोनोसाइट मायने रखता है लेजर उपचार(चित्रा 5डी, ई)से प्रभावित नहीं थे । परमाणु से पहले प्रणालीगत परफ्यूजन के साथ या बिना कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया था। इन परिणामों में माइक्रोग्लिया या मोनोसाइट्स में कोई परिवर्तन नहीं होने के साथ लेजर चोट के बाद मैक्रोफेज आबादी और डेंड्रिटिक कोशिकाओं में वृद्धि का प्रदर्शन होता है। इसके अलावा, ये डेटा इस बात पर प्रकाश डालते हैं कि कैसे मल्टी-पैरामीटर फ्लो साइटोमेट्री मैक्रोफेज विषमता का पता लगा सकता है।

एंटीबॉडी या बफर फ्लोरोफोर क्लोन प्रति नमूना राशि (एनजी)
चूहा विरोधी माउस Ly6C फिटसी अल-21 15
माउस विरोधी माउस सीडी 64 शारीरिक शिक्षा X54-5/7.1 40
चूहा विरोधी माउस Tim4 एलेक्साफ्लूर 647 आरएमटी4-54 300
हम्सटर विरोधी माउस CD11c बीवी 421 एचएल3 300
चूहा विरोधी माउस Ly6G पीई-CF594 1A8 10
माउस विरोधी माउस NK1.1 पीई-CF594 पीके136 10
चूहा विरोधी माउस सिग्लेक एफ पीई-CF594 E50-2440 20
चूहा विरोधी माउस B220 पीई-CF594 RA3-6B2 20
चूहा विरोधी माउस सीडी 8 पीई-CF594 53-6.7 40
चूहा विरोधी माउस सीडी 4 पीई-CF594 आरएम4-5 20
चूहा विरोधी माउस MHC द्वितीय एलेक्साफ्लूर 700 M5/114.15.2 2.5
चूहा विरोधी माउस CD11b एपीसी-Cy7 M1/70 2
चूहा विरोधी माउस सीडी 45 पीई-Cy7 30-F11 6
एमएएक्स बफर

तालिका 1: एंटीबॉडी फ्लोरोफोर और क्लोन (चरण 4.9 देखें)। आम तौर पर, एक नमूना या तो एक या दो पचा आंखें है। पहले एक ट्यूब में प्रवाह बफर जोड़ें फिर प्रत्येक एंटीबॉडी। कुल प्रवाह बफर वॉल्यूम को उचित रूप से बदलते हुए, बहुत छोटी मात्रा को पाइपिंग से बचने के लिए कमजोर पड़ने का काम किया जा सकता है। उत्पाद संख्या और कंपनी के लिए सामग्री की तालिका देखें।

लेज़र पीएमटी स्लॉट फ़िल्टर शीशा रंग
वायलेट (405nm) एक 525/50 505LP V500 या AmCyan
जन्‍म 450/50 प्रशांत ब्लू, eFluor 450, V450 या BV421
ब्लू (488nm/FSC) एक 710/50 685LP PerCP-Cy5.5, PerCP, PI या 7AAD
जन्‍म 525/50 505LP फिटसी, सीएफएसई, जीएफपी या एलेक्साफ्लूर 488
के आसपास 488/10 एसएससी
पीला-हरा (561nm) एक 780/60 735LP पीई-Cy7
जन्‍म 610/20 600LP पीई-CF594, रीचेरी या DsRed2
के आसपास 582/15 शारीरिक शिक्षा
लाल (640एनएम) एक 780/60 735LP एपीसी-Cy7, एपीसी-H7 या एपीसी-eFluor 780
जन्‍म 730/45 690LP एलेक्साफ्लूर 700
के आसपास 670/30 एपीसी या एलेक्साफ्लूर 647

तालिका 2: प्रवाह साइटोमीटर का विन्यास। चार-लेजर साइटोमीटर और उपलब्ध फ्लोरोफोरस के लिए फ़िल्टर और मिरर सेटअप जो प्रत्येक चैनल में पाया जा सकता है। पीएमटी = फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब, एफएससी = फॉरवर्ड स्कैटर, एसएससी = साइड स्कैटर।

प्रतिपिंड फ्लोरोफोर क्लोन राशि प्रति एससीसी (एनजी)
चूहा विरोधी माउस सीडी 45 फिटसी 30-F11 500
चूहा विरोधी माउस CD19 शारीरिक शिक्षा 1D3 40
चूहा विरोधी माउस Tim4 एलेक्साफ्लूर 647 आरएमटी4-54 100
हम्सटर विरोधी माउस CD11c बीवी421 एचएल3 200
चूहा विरोधी माउस सिग्लेक एफ पीई-CF594 E50-2440 40
चूहा विरोधी माउस CD19 एलेक्साफ्लूर 700 1D3 200
चूहा विरोधी माउस CD11b एपीसी-Cy7 M1/70 200
चूहा विरोधी माउस सीडी 45 पीई-Cy7 30-F11 200
लाइव/डेड डाई ईफ्लूर 506 N/A 1 माइक्रोन

तालिका 3: सिंगल कलर कंट्रोल के लिए एंटीबॉडी फ्लोरोफोर और क्लोन। प्रत्येक एंटीबॉडी को उचित क्षतिपूर्ति मनका में जोड़ा जाना चाहिए जैसा कि चरण 5.3.1 - 5.3.3 में उल्लिखित है।

Figure 1
चित्रा 1: लाल लेजर के लिए स्थापित प्रतिनिधि वोल्टेज। (A)एलेक्सा647 के लिए सिंगल कलर कंट्रोल्स (एससीसी) । बाईं ओर, Alexa647 के लिए एससीसी दिखाया गया है । बाएं मध्य Alexa700 चैनल में Alexa647 एससीसी के रिसाव प्रदर्शित करता है । Alexa647 एससीसी की चोटी मजेंटा में दिखाई गई है और 0.5 लॉग गोल अंतर सियान में प्रदर्शित किया गया है। ध्यान रहे कि चोटी सियान रेखा की तुलना में बाईं ओर (कम उज्ज्वल) है। मध्य सही एपीसी-Cy7 चैनल में Alexa647 एससीसी के रिसाव को दर्शाता है । सही Alexa647 चैनल में कोशिकाओं को दिखाता है । ध्यान रहे कि सभी कोशिकाएं एससीसी (मैजेंटा लाइन) की तुलना में कम उज्ज्वल हैं। (B)एलेक्सा700 के लिए एससीसी । मध्य वाम Alexa700 के लिए एससीसी से पता चलता है । वाम Alexa700 एससीसी के फैल Alexa647 चैनल में प्रदर्शित करता है । मध्य सही एपीसी-Cy7 चैनल में Alexa700 एससीसी के रिसाव को दर्शाता है । Alexa700 एससीसी की चोटी मजेंटा में दिखाया गया है और 0.5 लॉग गोल अंतर सियान में प्रदर्शित किया जाता है। ध्यान रहे कि चोटी सियान रेखा की तुलना में बाईं ओर (कम उज्ज्वल) है। सही Alexa700 चैनल में कोशिकाओं को दिखाता है। ध्यान रहे कि सभी कोशिकाएं एससीसी (मैजेंटा लाइन) की तुलना में कम उज्ज्वल हैं। (C)एपीसी-Cy7 के लिए एससीसी । लेफ्ट और मिडिल लेफ्ट क्रमशः एलेक्सा647 और एलेक्सा700 में एपीसी-Cy7 एससीसी का बिखराव दिखाते हैं । ध्यान रहे कि दोनों चोटियां सियान रेखा के बाईं ओर हैं। मध्य अधिकार एसीपी-Cy7 एससीसी को दर्शाता है । सही एपीसी-Cy7 चैनल में कोशिकाओं को दिखाता है । ध्यान रहे कि सभी कोशिकाएं एससीसी (मैजेंटा लाइन) की तुलना में कम उज्ज्वल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: गिनती मोती, सिंगल्स, और जीवित कोशिकाओं की प्रतिनिधि पहचान। (ए)समोच्च भूखंड पर सभी कोशिकाओं के लिए साइड स्कैटर एरिया (एसएससी-ए) बनाम फॉरवर्ड स्कैटर एरिया (एफएससी-ए) । गिनती मोतियों की पहचान उच्च एसएससी-ए, कम एफएससी-ए और वर्दी मोतियों के बहुत तंग क्लस्टरिंग द्वारा की जाती है। (B)पीई बनाम एपीसी-Cy7 प्लॉट क्लीन बीड गेट के लिए । ए और बी के बीच तीर केवल गिनती मनका सकारात्मक घटनाओं की साजिश रचने इंगित करता है । स्वच्छ गणना मोती उच्च पीई और कम एपीसी-Cy7 फ्लोरेसेंस द्वारा चित्रित कर रहे हैं । (C)एफएससी-हाइट (एफएससी-एच) बनाम एफएससी-एरिया (एफएससी-ए) सभी कोशिकाओं का प्लॉट एक सकारात्मक सहसंबद्ध व्यापक लाइन में एकल कोशिकाओं को दर्शाता है । डबल्स और अन्य मल्टीप्लेक्स एफएससी-हाइट की तुलना में अधिक एफएससी-एरिया दिखाते हैं। (घ)सिंगलेट कोशिकाओं के लिए लाइव/डेड बनाम एफएससी-ए । लाइव कोशिकाओं को लाइव/डेड लो और एफएससी-ए पॉजिटिव के रूप में परिभाषित किया गया है । प्रतिशत माता-पिता के प्रतिशत का संकेत देते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स की प्रतिनिधि पहचान। बाएं: CD45 बनाम CD11b छद्म रंग की साजिश से जीवित कोशिकाओं की साजिश unlasered(ए),लेजर(बी),और फ्लोरेसेंस माइनस एक (एफएमओ) नियंत्रण (सी) । बाएं: CD45+ कोशिकाओं को ए-बी में परिभाषित किया गया है और एफएमओ में अनुपस्थित हैं। लेजर(बी)समूह में CD45+CD11b+ कोशिकाओं की वृद्धि पर ध्यान दें। मध्य: सीडी 45+ कोशिकाओं के लिए वंश (लिन) मार्कर बनाम CD11b के छद्म रंग की साजिश। CD11b+लिन- कोशिकाओं को ए-बी में चित्रित किया जाता है और सीडी 11बी (नीचे) के लिए एफएमओ में अनुपस्थित रहते हैं। सही: CD11b बनाम CD11b+लिन- कोशिकाओं की सीडी 45 साजिश। CD45मंद और सीडी 45उच्च कोशिकाओं की पहचान कर रहे हैं। लेजर (बी) समूह में सीडी 45उच्च कोशिकाओं में वृद्धि पर ध्यान दें। प्रतिशत माता-पिता के प्रतिशत का संकेत देते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: माइक्रोग्लिया, डेंड्रिटिक कोशिकाओं, मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज सबसेट की प्रतिनिधि पहचान। बाएं: CD64 बनाम MHCII छद्म रंग सीडी 45मंद कोशिकाओं की साजिश CD64+MHCIIकमके रूप में microglia परिभाषित करता है । अनलेसर(ए)और लेजर(बी)समूहों में माइक्रोग्लिया की समान मात्रा और एफएमओ नियंत्रण(सी)में माइक्रोग्लिया की अनुपस्थिति पर ध्यान दें। मध्य बाएं: CD64 बनाम MHCII सीडी 45उच्च कोशिकाओं के छद्म रंग साजिश MHCII-CD64+MHCII के रूप में मैक्रोफेज को परिभाषित करताहै-,CD64 के रूप में मोनोसाइट्स-MHCII-, और MHCII + कोशिकाओं । लेजर समूह (बी) में MHCII-मैक्रोफेज में वृद्धि पर ध्यान दें, एफएमओ (सी, मध्य) में MHCII + कोशिकाओं की अनुपस्थिति, और सीडी 64 एफएमओ (सी, बाएं) ने सीडी64+ और सीडी 64- कोशिकाओं के लिए कटऑफ निर्धारित करने में मदद की। मध्य सही: CD64 बनाम CD11c छद्म रंग MHCII+ कोशिकाओं की साजिश । CD11c- मैक्रोफेज को CD64+CD11c के रूप में परिभाषित किया गयाथा -सीडी 11सी+ मैक्रोफेज की पहचान सीडी 64 + सीडी 11सी+के रूप में की गई थी और डेंड्रिटिक कोशिकाओं (डीसी) को CD64-CD11c+के रूप में चित्रित किया गया था। लेजर (बी) के साथ मैक्रोफेज सबसेट और डेंड्रिटिक कोशिकाओं दोनों को बढ़ाया गया था। एफएमओ (सी) में CD11c+ कोशिकाओं की अनुपस्थिति पर ध्यान दें। सही: Ly6C बनाम Tim4 मोनोसाइट्स के छद्म रंग की साजिश । शास्त्रीय Ly6C+ और गैर शास्त्रीय Ly6C- मोनोसाइट्स की पहचान की गई। ध्यान दें कि Ly6CFMO (सी) में शास्त्रीय Ly6C + मोनोसाइट्स अनुपस्थित थे। प्रतिशत माता-पिता के प्रतिशत का संकेत देते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रणालीगत परफ्यूजन के साथ और बिना बिना बिना अनलेसर और लेजर चूहों के बीच मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स के लिए प्रतिनिधि डेटा। MHCII-(A), CD11c-(B), और CD11c+ (C)मैक्रोफेज गिनती सभी लेजर के साथ वृद्धि हुई थी । अनलेसर और लेजर माइक्रोग्लिया(डी)या मोनोसाइट्स(ई)के बीच कोई बदलाव नहीं पाया गया । लेजर(एफ)के साथ डेंड्रिटिक कोशिकाओं (डीसी) को भी बढ़ाया गया था। ब्राउन फोर्सिथे और वेल्च एनोवा के साथ डुनेट के T3 मल्टीपल तुलना परीक्षण का इस्तेमाल समूहों के बीच असमान विचरण के कारण सांख्यिकीय मतभेदों को परिभाषित करने के लिए किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

बहु-पैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्री एक जटिल ऊतक में कई सेल प्रकारों के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। इस रिपोर्ट में, हम माउस आंख में लेजर चोट के बाद मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट आबादी के प्रवाह साइटोमेट्रिक डिटेक्शन का वर्णन करते हैं, जिसमें मोनोसाइट्स, डेंड्रिटिक कोशिकाएं और मैक्रोफेज सबसेट शामिल हैं। लियानेज एट अल ने हाल ही में न्यूट्रोफिल, इओसिनोफिल्स, लिम्फोसाइट्स, डीसी, मैक्रोफेज, घुसपैठ मैक्रोफेज और मोनोसाइट्स27का पता लगाने के लिए इसी तरह की गेटिंग रणनीति की सूचना दी। हमारी गेटिंग रणनीति मुख्य रूप से CD64 के अलावा से अलग है। लियानेज एट अल सीडी 4 के रूप में डीसी की पहचान करता है-सीडी 8-B220-CD11b+CD11c+ कोशिकाओं, और सीडी 4 के रूप में मैक्रोफेज-सीडी 8-B220-CD11b+CD11c-NK1.1-Ly6G- कोशिकाएं। हम सीडी 4 के रूप में डीसी की पहचानकरतेहैं-सीडी 8 - बी 220-Ly6G-सिग्लेसीएफ-एनके1.1-सीडी 11बी+सीडी 11सी+सीडी64- सीडी 4 के रूप में कोशिकाएं और मैक्रोफेज-सीडी 8-B220-Ly6G-सिग्लेसीएफ-एनके11बी+सीडी64+ सेल। मैक्रोफेज से डीसी के साथ भेदभाव करने के लिए CD64 का उपयोग अच्छी तरह सेस्थापित है,और यह रणनीति हमें CD11c + मैक्रोफेज सहित मैक्रोफेज विषमता की पहचान करने की अनुमति देती है। इस विधि की प्रमुख सीमा यह है कि यह ऊतक वास्तुकला या आंख के भीतर विशिष्ट कोशिकाओं के स्थान पर डेटा प्रदान नहीं करता है। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या ये कोशिकाएं रेटिना, कोरॉइड, आईरिस या किसी अन्य नेत्र संरचना में हैं, हमारे प्रोटोकॉल को हिस्टोलॉजिकल तरीकों के साथ जोड़ा जा सकता है या प्रत्येक नेत्र उपविभाजन पर व्यक्तिगत रूप से बहु-पैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्री चलाने के लिए अधिक व्यापक नेत्र विच्छेदन को शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।

हमने विच्छेदन द्वारा बनाए गए किसी भी विचरण को रोकने के लिए पूरे माउस आंखों के पाचन के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया है। उदाहरण के लिए, कॉर्निया, आईरिस और लेंस को हटाने के साथ पीछे के आंखों के कपों का विच्छेदन बनाए रखा आईरिस या कॉर्नियल सामग्री (कम विच्छेदन) या सामान्य पीछे की आंख कप क्षेत्र (अधिक विच्छेदन) के लिए लेजर चोट में वृद्धि से परिवर्तनशीलता पैदा कर सकता है। नियंत्रण के बीच हमारी तुलना अलाजेर और लेजर आंखों के बीच रेटिनोकोरीडल चोट के कारण मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स की घुसपैठ का पता लगाती है। आंखों पर प्रणालीगत रोगों के प्रभावों के विश्लेषण के लिए, यानी यूवेइटिस और मधुमेह, व्यक्तिगत नेत्र उपविभाग विश्लेषण आवश्यक है। प्रोटोकॉल की धारा 2 में पाचन की विधि सबसे महत्वपूर्ण है, जबकि सेक्शन 3 - 5 में अन्य चरणों का उपयोग कई ऊतक प्रकार24पर सफलतापूर्वक किया गया है। हम एक पुनरावृत्ति विधि के माध्यम से अपने पाचन की स्थिति में पहुंचे जिसमें शामिल थे: (1) रासायनिक पाचन विधि (कोलेजन डी बनाम पाचन एंजाइम), (2) रासायनिक पाचन की लंबाई का निर्धारण (30, 60, और 90 मिनट), और (3) यांत्रिक पाचन के अलावा (कोई नहीं, एक बार, दो बार, तीन बार)। प्रत्येक चरण में हमने कोशिका व्यवहार्यता और सीडी 45हायसीडी 64+ (घुसपैठ मैक्रोफेज) कोशिकाओं की संख्या द्वारा पाचन स्थितियों की सफलता का न्याय किया। हमने पाया कि पाचन एंजाइम (सामग्री की अनुपूरक तालिका देखें) कोलेजनेस डी की तुलना में अधिक जीवित कोशिकाओं को बरामद किया और पाचन एंजाइम एकाग्रता के आधे प्रयास के परिणामस्वरूप कम घुसपैठ मैक्रोफेज हुई। इसके बाद, यांत्रिक पाचन के साथ रासायनिक पाचन के 60 मिनट लगभग घुसपैठ मैक्रोफेज आबादी दोगुनी हो गई। सिंगल्स की 25-30% लाइव कोशिकाओं और सबसे घुसपैठ मैक्रोफेज आबादी के साथ तीन यांत्रिक पाचन इष्टतम थे। अंत में, तेजी से यांत्रिक पाचन की स्थिति दोनों जीवित कोशिकाओं और मैक्रोफेज के गंभीर नुकसान का कारण बना ।

भविष्य में, हम कॉर्निया, आईरिस और लेंस को हटाकर विधि का विस्तार करने का प्रस्ताव करते हैं जिसके बाद रेटिना और पीछे के नेत्र कप (स्क्लेरा, कोरॉइड और रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम) को अलग से पचाने का प्रस्ताव किया जाता है। इस संशोधन के साथ, हम क्रमशः लेंस और कॉर्निया की प्रोटीनसियस और घने विशेषताओं के कारण पाचन की स्थिति को कम करने की उम्मीद करते हैं। इन कटौतियों में पाचन एंजाइम एकाग्रता कम हो सकती है, कोलेजनास में स्विच करना, पाचन के समय में कमी, या यांत्रिक पाचन की मात्रा कम हो सकती है। हम पीछे की आंखों के कप के लिए समग्र रूप से कम पाचन की स्थिति की उम्मीद करते हैं, और अकेले रेटिना के लिए पाचन की स्थिति को कम करते हैं।

अतिरिक्त भविष्य के निर्देशों में हमारे पारंपरिक मल्टी-पैरामीटर फ्लो साइटोमेट्री पैनल का पारंपरिक 6 लेजर इंस्ट्रूमेंट या स्पेक्ट्रल फ्लो साइटोमेट्री का विस्तार शामिल है। स्पेक्ट्रल फ्लो साइटोमेट्री उपलब्ध फिल्टर द्वारा निर्धारित करने के बजाय पूरे स्पेक्ट्रम में फ्लोरोफोर डिटेक्शन की अनुमति देता है। स्पेक्ट्रल फ्लो साइटोमेट्री के परिणामस्वरूप अधिक विशिष्ट रंग का पता चलता है। हालांकि, स्पेक्ट्रल फ्लो साइटोमेट्री को पालन करने के लिए विचारों के एक पूरी तरह से नए सेट की आवश्यकता होती है और यह इस पांडुलिपि के दायरे से बाहर है। अधिक जानकारी के लिए, कृपया इस हाल के JoVE अनुच्छेद28देखें । 6 लेजर उपकरणों में एक पराबैंगनी लेजर शामिल है, जो 6-9 डिटेक्टरों को जोड़ता है। माउस आई फ्लो साइटोमेट्री पैनल में मार्कर जोड़ते समय, हम अधिक नेत्र कोशिका प्रकारों का पता लगाने की सलाह देते हैं। उदाहरण के लिए, वंशावली गेट को स्वतंत्र रूप से न्यूट्रोफिल, ियोसिनोफिल, मस्तूल कोशिकाओं, एनके कोशिकाओं और लिम्फोसाइट्स का पता लगाने के लिए अलग किया जा सकता है। स्थिर स्थिति में मैक्रोफेज की कम संख्या के कारण मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स का सबसेट डिटेक्शन बढ़ाने की सिफारिश नहीं की जाती है। नई एंटीबॉडी जोड़ते समय, हम सावधान एंटीबॉडी टिटरेशन का सुझाव देते हैं।

संक्षेप में, हमने माउस की आंखों में मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट आबादी का पता लगाने के लिए एक अनुकूलनीय, मजबूत विधि प्रस्तुत की है। मोनोसाइट्स, डेंड्रिटिक कोशिकाओं, मैक्रोफेज और माइक्रोग्लिया के अत्यधिक ओवरलैपिंग सेल सतह मार्कर के कारण, इन सेलुलर आबादी का पता लगाने के लिए बहु-पैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्री सबसे अच्छा तरीका है। फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग सेल प्रकारों, भाग्य मानचित्रण और/या ट्रांसक्रिप्टोमिक या प्रोटेओमिक मूल्यांकन के लिए सेल छंटाई के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है । इसकी प्रमुख सीमा ऊतक वास्तुकला की कमी है, और पारंपरिक हिस्ट्रोलॉजी का उपयोग करके प्रमुख निष्कर्षों की पुष्टि की जा सकती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

जल को एनआईएच अनुदान K08EY030923 द्वारा समर्थित किया गया था; सीएमसी को एनआईएच नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ आर्थराइटिस एंड मस्कुलोस्केलेटल डिजीज और ल्यूपस रिसर्च एलायंस से एक उपन्यास रिसर्च ग्रांट (637405) से K01 अनुदान (5K01AR060169) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.6 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-120
1.7 ml microcentrifuge tubes Costar 3620
10 ml pipettes Fisher Scientific 431031
15 ml conicals ThermoFisher 339650
1x HBSS, 500 ml Gibco 14025-092
2.5 ml syringe Henke Sass Wolf 7886-1
20% paraformaldehyde solution Electron Microscopy Sciences 15713-S
25 ml pipettes Fisher Scientific 431032
30 G needle Exel 26437
3ml luer lock syringe Fisher Scientific 14955457
41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish Fisher Scientific 08-732-112
50 ml conicals Falcon 352070
96-well, U-bottom assay plate without lid Falcon 353910
Amine reactive beads ThermoFisher A10628
Analysis software FlowJo v 10
Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set BD Biosciences 552845
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664
Cell counter Invitrogen AMQAX1000
Cell counter slides Invitrogen C10283
Compensation beads ThermoFisher 01-1111-42
Count beads ThermoFisher 01-1234-42
Curved forceps Fisher Scientific 16-100-123
Digestion enzyme Sigma Aldrich 5401020001
Dissecting microscope National Optical and Scientific Instruments, Inc. DC3-420T
Dissociation tubes Miltenyi Biotec 130-096-334
DNase Roche 10104159001
Electronic dissociator Miltenyi Biotec 130-095-937
FACS Diva software BD Biosciences
Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553142
Fine forceps Integra Miltex 17035X
Flow buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Flow cytometer BD Biosciences
Flow tubes Falcon 352008
Hamster anti-mouse CD11c BV421 BD Biosciences 562782
Ice bucket Fisher Scientific 07-210-123
Live/Dead dye ThermoFisher 65-0866-14
Lysing solution, 10x solution BD Biosciences 555899
Micro titer tube and rack Fisher Scientific 02-681-380
Mouse anti-mouse CD64 PE BioLegend 139304
Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 BD Biosciences 562864
P1000 pipet tips Denville Scientific P2404
P1000 pipettor Gilson FA10006M
P2 pipet tips eppendorf 22491806
P2 pipettor Gilson FA10001M
P20 pipettor Gilson FA10003M
P200 pipet tips Denville Scientific P2401
P200 pipettor Gilson FA10005M
Pipet man Fisher Scientific FB14955202
Rat anti-mouse B220 PECF594 BD Biosciences 562313
Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 BD Biosciences 557657
Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 BD Biosciences 557958
Rat anti-mouse CD19 PE BD Biosciences 553786
Rat anti-mouse CD4 PECF594 BD Biosciences 562314
Rat anti-mouse CD45 FITC ThermoFisher 11-0451-82
Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 BD Biosciences 552848
Rat anti-mouse CD8 PECF594 BD Biosciences 562315
Rat anti-mouse Ly6C BD Biosciences 561085
Rat anti-mouse Ly6G PECF594 BD Biosciences 562700
Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 BioLegend 107622
Rat anti-mouse Siglec F PECF594 BD Biosciences 562757
Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 BD Biosciences 564178
Shaking incubator Labnet 311DS
Spring scissors Fine Science Tools 15024-10
Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh Fisher Scientific 22363547
Sterile water, 500 ml Gibco A12873-01
Swinging bucket centrifuge eppendorf 5910 R
Trypan blue, 0.4% solution Gibco 15250061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. Macrophage physiology in the eye. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).
  2. Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
  3. O'Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
  4. Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
  5. Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).
  6. Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
  7. Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099 (2019).
  8. Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).
  9. Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
  10. Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313 (2014).
  11. Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
  12. Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
  13. O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636 (2016).
  14. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  15. Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
  16. McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
  17. Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
  18. Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
  19. Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
  20. Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
  21. Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
  22. Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
  23. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).
  24. Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
  25. Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
  26. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  27. Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
  28. Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 160 आंख प्रवाह साइटोमेट्री मैक्रोफेज माइक्रोग्लिया मोनोसाइट माइलॉयड
मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स के मल्टी-पैरामीटर फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए पूरे माउस आंखों का पाचन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Droho, S., Cuda, C. M., Lavine, J.… More

Droho, S., Cuda, C. M., Lavine, J. A. Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes. J. Vis. Exp. (160), e61348, doi:10.3791/61348 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter