Karakterisering af immunceller og proinflammatoriske mediatorer i lungemiljøet
Summary
Denne protokol beskriver brugen af flowcytometri til at identificere ændringerne i immuncellesammensætning, cytokinprofil og kemokinprofil i lungemiljøet efter forbigående mellem cerebral arterieokklusion, en murinmodel af iskæmisk slagtilfælde.
Abstract
Immuncelleudvidelse, aktivering og handel med lungerne, som styres ved ekspression af flere cytokiner og kemokiner, kan ændres ved alvorlig hjerneskade. Dette fremgår af, at lungebetændelse er en væsentlig årsag til dødelighed hos patienter, der har lidt af iskæmisk slagtilfælde. Målet med denne protokol er at beskrive brugen af flerfarvet flowcytometrisk analyse til at identificere 13 typer immunceller i lungerne hos mus, herunder alveolære makrofager, interstitielle makrofager, CD103+ eller CD11b+ dendritiske celler (DC’er), plasmacytoid DC’er, eosinofiler, monocytter / monocytafledte celler, neutrofiler, lymfoidafledte T- og B-celler, NK-celler og NKT-celler efter iskæmisk slagtilfælde induktion ved forbigående mellem cerebral arterieokklusion. Desuden beskriver vi fremstillingen af lungehomogenater ved anvendelse af en perlehomogeniseringsmetode til bestemmelse af ekspressionsniveauer for 13 forskellige cytokiner eller kemokiner samtidigt ved multiplexperlearrays kombineret med flowcytometrisk analyse. Denne protokol kan også bruges til at undersøge det pulmonale immunrespons i andre sygdomsindstillinger, såsom infektiøs lungesygdom eller allergisk sygdom.
Introduction
Lungerne er et barriereorgan, der udsættes for det ydre miljø og derfor konstant modtager immunologiske udfordringer som patogener og allergener1. Aktiveringen af lungeboende immunceller og infiltration af immunceller fra periferien er nødvendig for at fjerne patogener fra lungemiljøet. Derudover opretholder lungeboende immunceller tolerance over for kommensale bakterier, hvilket tyder på, at disse celler spiller en rolle i patogenclearance og opretholder homeostase1. Alveolære og interstitielle makrofager er blandt de lunge-residente sentinelimmunceller, der sanser patogener via mønstergenkendelsesreceptorer og rydder disse patogener ved fagocytose2. Lunge-residente dendritiske celler bygger bro over det medfødte og adaptive immunrespons gennem antigenpræsentation3. Derudover producerer aktiverede lokale medfødte immunceller cytokiner og kemokiner, der forstærker det inflammatoriske respons og stimulerer infiltrationen af immunceller såsom monocytter, neutrofiler og lymfocytter i lungerne1. Iskæmisk slagtilfælde har vist sig at ændre systemisk immunitet og føre til øget modtagelighed for lungeinfektion; få undersøgelser har dog evalueret lungerummet efter iskæmisk slagtilfælde, selvom nogle undersøgelser har undersøgt det under inflammatoriske tilstande 4,5,6,7,8,9. Målet med de metoder, der er beskrevet heri, er samtidig at bestemme lungepatologi, immuncellesammensætning og niveauerne af cytokin og kemokinekspression i lungerne for at evaluere ændringer i lungerummet og vurdere potentielle ændringer i det pulmonale immunrespons efter iskæmisk angreb.
Beskrevet her er en protokol til opnåelse af enkeltcellesuspensioner fra musenes lunger for at identificere 13 typer immunceller. Denne protokol er baseret på vævsfordøjelse med collagenase D uden behov for en automatiseret vævsdissociator. Derudover udviklede vi en protokol til fremstilling af vævshomogenater, der kan bruges til at bestemme ekspressionsniveauer for 13 forskellige cytokiner eller kemokiner ved hjælp af flowcytometribaserede multiplexperlearrays. Denne protokol blev med succes brugt til at undersøge virkningerne af iskæmisk slagtilfælde på lungeimmunitet og kan også bruges i andre sygdomsmodeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
De protokoller, der er beskrevet her, giver mulighed for identifikation af lungeimmuncelletyper og ekspression af kemokiner eller cytokiner i samme mus. Hvis der ønskes en histopatologisk undersøgelse, kan en individuel lap fjernes og fastgøres til dette formål, inden man går videre til enkeltcelleisoleringstrinnene. En begrænsning ved denne metode er, at denne tilgang muligvis ikke er egnet i nogle sygdomsindstillinger, hvis ændringen i immuncellesammensætningen og ekspressionen af kemokiner og / eller cytokiner…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH-bevilling P20 GM109098 og Innovation Award-programmet fra Praespero til Edwin Wan. Flowcytometri eksperimenter blev udført i WVU Flow Cytometry &Single Cell Core Facility, som understøttes af NIH tilskud S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 og P20 GM103434.
Materials
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
Riferimenti
- Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hartl, D., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Prass, K., et al. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).
- Smith, C. J., et al. Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression. Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).
- McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke. Nature Communications. 8 (1), 15051 (2017).
- Dames, C., et al. Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke. Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).
- Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice. Frontiers in Neurology. 10, 853 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments. (69), e4038 (2012).
- Farris, B. Y., et al. Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection. Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. Journal of Visualized Experiments. (129), e56440 (2017).
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
- Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2779 (2019).
- Zhai, X., et al. A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells. Science Reports. 9 (1), 12757 (2019).
- Platzer, B., et al. Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites. Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).
- Shinoda, K., et al. Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).
- Nakahashi-Oda, C., et al. Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces. Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).
- Barrott, J. J., et al. Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3′-lipid signaling and inflammation. Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).
- Bouté, M., et al. The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection. Veterinary Research. 48 (1), 73 (2017).
- Bal, S. M., et al. IL-1β, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs. Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).
