Visualizzazione cinetica delle interazioni batteriche interspecie a uni cell
Summary
Questo protocollo di imaging cellulare vivo-batterico consente di vedere le interazioni tra più specie batteriche a livello di singola cellula nel tempo. L’imaging time-lapse consente l’osservazione di ogni specie batterica in monocultura o cocoltura per interrogare le interazioni interspecie in comunità batteriche multispecie, tra cui la motilità e la vitalità delle singole cellule.
Abstract
Le comunità polimicrobiche sono onnipresenti in natura, ma studiare le loro interazioni a livello di una singola cellula è difficile. Pertanto, è stato sviluppato un metodo basato sulla microscopia per osservare le interazioni tra le specie tra due patogeni batterici. L’uso di questo metodo per interrogare le interazioni tra un patogeno motile Gram-negativo, Pseudomonas aeruginosa e un patogeno Gram-positivo non motile, Staphylococcus aureus è dimostrato qui. Questo protocollo consiste nel co-inoculare ogni specie tra un coverslip e un pad di agarose, che mantiene le cellule in un unico piano e consente la visualizzazione dei comportamenti batterici sia nello spazio che nel tempo.
Inoltre, la microscopia time-lapse qui dimostrata è ideale per visualizzare le prime interazioni che si svolgono tra due o più specie batteriche, compresi i cambiamenti nella motilità delle specie batteriche nella monocultura e nella coculazione con altre specie. A causa della natura dello spazio campione limitato nella configurazione della microscopia, questo protocollo è meno applicabile per studiare le interazioni successive tra le specie batteriche una volta che le popolazioni cellulari sono troppo alte. Tuttavia, ci sono diverse applicazioni del protocollo che includono l’uso della colorazione per l’imaging di cellule batteriche vive e morte, la quantificazione dell’espressione genica o proteica attraverso giornalisti fluorescenti e il monitoraggio del movimento delle cellule batteriche sia nelle singole specie che negli esperimenti multispecie.
Introduction
Le comunità polimicrobiche sono comuni in natura, che abbracciano una varietà dinicchie ambientali 1,2,3 e umane4,5. Alcune delle infezioni polimicrobiche più note nella malattia umana includono biofilm dentali6, ferite croniche7,8e infezioni respiratorie in individui con malattia polmonare ostruttivacronica 9, polmonite associata al ventilatore10e la fibrosi cistica della malattia genetica (CF)11,12. Queste infezioni sono spesso composte da diverse specie microbiche; tuttavia, è emerso un recente focus sulle interazioni tra il batterio Gram-positivo Staphylococcus aureus e il batterio Gram-negativo Pseudomonas aeruginosa. Studi che includono pazienti coinfettati con questi organismi e analisi in vitro rivelano interazioni competitive e cooperative che possono avere influenze profonde e inaspettate sulla progressione della malattia, la sopravvivenza microbica, la virulenza, il metabolismo e la suscettibilità agli antibiotici (esaminate in dettaglio da Hotterbeekx et al. 201713 e Limoli Hoffman 20193).
Il crescente interesse per le interazioni interspecie durante l’infezione ha prodotto una varietà di metodi per studiare i comportamenti della comunità polimicrobica. Tipicamente, questi studi hanno utilizzato saggi a base di piatti o brodo per studiare le differenze fenotipici tra monocultura e cocoltura. Ad esempio, la cocultura di P. aeruginosa e S. aureus su superfici solide ha permesso la visualizzazione dell’inibizione della crescita o dei cambiamenti nella produzione di fenotipo, pigmento o polisaccharidedella colonia 14,15,16. I biofilm di specie miste, su superfici biotiche o abiotiche, nonché le specie batteriche coculturing nella coltura liquida hanno anche permesso di misurazione dei cambiamenti nella crescita, nel metabolismo, nella tolleranza agli antibiotici, nella concorrenza e nella vitalità, oltre all’espressione genica e proteica17,18. Mentre questi esperimenti di coltura di massa hanno rivelato una visione di come P. aeruginosa e S. aureus potrebbero influenzarsi a vicenda su scala comunitaria, non sono in grado di rispondere a domande importanti sulle interazioni che si svolgono a livello di singola cellula. Il metodo qui presentato si aggiunge agli approcci per studiare le interazioni traspecie concentrandosi sui cambiamenti nel movimento, la vitalità cellulare e l’espressione genica di singole cellule all’interno di una comunità coculuta nel tempo.
Le interazioni a cella singola possono differire ampiamente dalle interazioni che si svolgono in una comunità di celle di massa. Attraverso l’analisi a una singola cellula, l’eterogeneità all’interno di una comunità può essere quantificata per studiare come il posizionamento spaziale delle cellule influenza le dinamiche della comunità o come i livelli di espressione genica e proteica cambiano all’interno dei singoli membri di un gruppo. Le celle di monitoraggio possono anche fornire informazioni su come le singole celle si muovono e si comportano nel tempo, attraverso più generazioni. Monitorando contemporaneamente il movimento cellulare e i cambiamenti nell’espressione genica, è possibile fare correlazioni tra le fluttuazioni geniche e i fenotipi corrispondenti. Sono stati descritti protocolli precedenti per lo studio di singole specie batteriche a livello di singola cellula. Questi studi sfruttano le cellule di imaging dal vivo nel tempo in un unico piano, e sono stati utili per osservare fenotipi come la divisione cellulare e la suscettibilità agli antibiotici19,20. Ulteriore microscopia a imaging vivo è stata utilizzata per monitorare la crescita, la motilità, la colonizzazione superficiale e la formazione di biofilm di singole speciebatteriche 21,22,23. Tuttavia, mentre questi studi sono stati perspicenti per comprendere la fisiologia dei batteri nella monocultura, gli esperimenti per osservare il comportamento di più cellule di più specie batteriche nel tempo nella coculazione sono limitati.
Qui, i protocolli precedenti utilizzati per l’imaging di singole specie sono stati adattati per studiare le interazioni tra P. aeruginosa e S. aureus. Questi organismi possono essere differenziati in fase di contrasto in base alle loro morfologie cellulari (P. aeruginosa sono bacilli e S. aureus sono cocci). Lo sviluppo di questo metodo ha recentemente permesso la visualizzazione dei comportamenti di motilità precedentemente non descritto di P. aeruginosa in presenza di S. aureus24. P. aeruginosa è stato trovato in grado di percepire S. aureus da lontano e rispondere con movimenti uni cellulali aumentati e direzionali verso cluster di cellule S. aureus. P. aeruginosa movimento verso S. aureus è stato trovato per richiedere il tipo IV pili (TFP), proiezioni capelli-come la cui estensione coordinata e retrazione generano un movimento chiamato motilità contrazione25.
Questi studi dimostrano l’utilità di questo metodo per interrogare le interazioni precedenti tra le specie. Tuttavia, l’imaging ad alte densità cellulari nei punti di tempo di interazione successivi è difficile dato che non è più possibile identificare singoli strati di cellule, il che pone principalmente problemi durante l’analisi post-imaging. Data questa limitazione, il metodo è più adatto per le interazioni precedenti che potrebbero quindi essere seguite con saggi macroscopici tradizionali a densità cellulari più elevate rappresentative delle interazioni successive. Ulteriori limitazioni di questo metodo includono la natura a bassa velocità effettiva, poiché è possibile eseguire l’immagine di un solo campione alla volta e il costo del microscopio, della fotocamera e della camera ambientale. Inoltre, la microscopia a fluorescenza pone rischi per le cellule batteriche come la fototossicità e la fotobleaching, limitando così la frequenza con cui le immagini di fluorescenza possono essere acquisite. Infine, i cuscinetti di agarose utilizzati in questo metodo sono altamente suscettibili ai cambiamenti nell’ambiente, il che lo rende fondamentale per il controllo per condizioni come la temperatura e l’umidità, dato che i cuscinetti possono iniziare a ridursi o espandersi se le condizioni non sono corrette. Infine, mentre questo metodo non imita l’ambiente ospite, fornisce indizi su come le diverse specie batteriche rispondono sulle superfici, che possono essere seguite in saggi progettati per imitare le condizioni ambientali/host.
Questo metodo differisce dagli studi precedenti che tracciano il movimento di una singola cellula, in che le cellule sono inoculate tra un cosale e un cuscinetto di agarose, limitando le cellule alla superficie. Ciò consente il tracciamento delle cellule nel tempo in un singolo piano; tuttavia, limita i cicli di coinvolgimento della superficie transitoria osservati quando le cellule sono sommerse nel liquido26. Un ulteriore vantaggio dell’imaging batteri sotto un cuscinetto di agarose è che imita macroscopici saggi di inoculazione sotto-superficie a base di piastra classicamente utilizzati per esaminare P. aeruginosa twitching motility25. In questo saggio, le cellule batteriche sono inoculate tra il fondo di un piatto di Petri e l’agar, mantenendo le cellule in un unico piano mentre si muovono attraverso il fondo del piatto verso l’esterno dal punto di inoculazione, proprio come questo protocollo di microscopia.
Il protocollo di microscopia time-lapse per la visualizzazione delle interazioni interspecie qui presentato consiste di 1) preparare il campione batterico e il tampone di agarose, 2) selezionando le impostazioni del microscopio per l’acquisizione dell’imaging e 3) l’analisi post-imaging. La visualizzazione dettagliata del movimento e del tracciamento delle cellule può essere eseguita mediante l’acquisizione di immagini a brevi intervalli di tempo in base al contrasto di fase. La microscopia a fluorescenza può essere utilizzata anche per determinare la vitalità cellulare o l’espressione genica nel tempo. Qui, mostriamo un esempio di adattamento per la microscopia a fluorescenza attraverso l’aggiunta di coloranti di vitalità ai cuscinetti di agarose.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi qui presentati descrivono un protocollo per l’imaging a cellule vive delle interazioni delle specie batteriche a livello di singola cellula con modifiche per altre applicazioni, tra cui il monitoraggio delle cellule e il monitoraggio della vitalità cellulare. Questo metodo apre nuove strade per studiare i comportamenti unicelle dei microrganismi in cocoltura con altre specie nel tempo. In particolare, il protocollo dimostra l’utilità di questo metodo di cocultura nell’osservare i comportamenti della superficie…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal finanziamento del Cystic Fibrosis Foundation Postdoc-to-Faculty Transition Award LIMOLI18F5 (DHL), Cystic Fibrosis Foundation Junior Faculty Recruitment Award LIMOLI19R3 (DHL) e NIH T32 Training Grant 5T32HL007638-34 (ASP). Ringraziamo Jeffrey Meisner, Minsu Kim ed Ethan Garner per aver condiviso protocolli e consigli iniziali per l’imaging e la realizzazione di pastiglie.
Materials
| Agarose pads | |||
| 35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | One for agarose pad molds, one for experiment |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666A | |
| Low-Melt Agarose | Nu-Sieve GTG/Lonza | 50081 | For making agarose pads |
| Round-Bottom Spatulas | VWR | 82027-492 | |
| Round-Tapered Spatulas | VWR | 82027-530 | |
| Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive | Sigma-Aldrich | S6685-25EA | For agarose pad molds |
| Sterile Petri Plates, 85 mm | Kord-Valmark /sold by RPI | 2900 | |
| Tweezers | VWR | 89259-944 | |
| M8T Minimal Media | |||
| D (+) Glucose | RPI | G32045 | |
| KH2PO4 | RPI | P250500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| NaCl | RPI | S23025 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| Microscope | |||
| Andor Sona 4.2B-11 | Andor | 77026135 | Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount. |
| Filter Cube GFP | Nikon | 96372 | Filter cube |
| Filter Cube TxRed | Nikon | 96375 | Filter cube |
| H201-NIKON-TI-S-ER | Okolab | 77057447 | Stagetop incubator |
| Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking | Nikon | 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 | Software for data analysis |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Model Ti2-E | Microscope |
| CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA) | Nikon | MRD00205 | Objective |
| CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA) | Nikon | MRD31905 | Objective |
| ThermoBox with built-in fan heaters | Tokai Hit | TI2TB-E-BK | Enclosure |
| Bacterial Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) | PMID: 7604262 | Non-mucoid prototroph | |
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) | PMID: 9361441 | ||
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 | PMID: 26041805 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) | PMID: 23404398 | USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids | |
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) | PMID: 20829608 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC △agrBDCA | PMID: 31713513 | ||
| Viability Stain | |||
| Propidium Iodide | Invitrogen | L7012 | LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit |
Riferimenti
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