Minimering af hypoxi i Hippocampal Skiver fra voksne og aldrende mus
Summary
Dette er en protokol for akut skive forberedelse fra voksne og aldrende mus hippocampi, der udnytter transcardial perfusion og skive skæring med iskold NMDG-aCSF at reducere hypoxiske skader på vævet. De resulterende skiver forbliver sunde over mange timer, og er velegnede til langsigtede patch-clamp og felt-optagelser.
Abstract
Akutte hippocampale skiver har gjort det muligt for generationer af neuroforskere at udforske synaptiske, neuronale, og kredsløb egenskaber i detaljer og med high fidelity. Udforskning af LTP og LTD mekanismer, enkelt neuron dendritisk beregning, og erfaring-afhængige ændringer i kredsløb, ville ikke have været muligt uden denne klassiske forberedelse. Men med nogle få undtagelser, de fleste grundforskning ved hjælp af akut hippocampal skiver er blevet udført ved hjælp af skiver fra gnavere i relativt unge aldre, ~ P20-P40, selv om synaptiske og iboende ophidselse mekanismer har en lang udviklingsmæssige hale, der når forbi P60. Den vigtigste appel ved at bruge unge hippocampal skiver er bevarelse af neuronal sundhed hjulpet af højere tolerance over for hypoxiske skader. Men, der er behov for at forstå neuronal funktion på mere modne stadier af udviklingen, yderligere forstærket af udviklingen af forskellige dyremodeller af neurodegenerative sygdomme, der kræver en aldrende hjerne forberedelse. Her beskriver vi en ændring af en akut hippocampal skive forberedelse, der pålideligt leverer sunde skiver fra voksne og aldrende mus hippocampi. Protokollens kritiske trin er transkardieperfusion og skæring med iskold natriumfri NMDG-aSCF. Tilsammen dæmper disse trin hypoxi-induceret fald i ATP ved halshugning samt cytotoksisk ødem forårsaget af passive natriumflukser. Vi demonstrerer, hvordan man skærer tværgående skiver af hippocampus plus cortex ved hjælp af en vibrerende mikrotom. Akutte hippocampale skiver opnået på denne måde er pålideligt sunde over mange timers optagelse, og er passende for både felt-optagelser og målrettede patch-clamp optagelser, herunder målretning af fluorescerende mærket neuroner.
Introduction
Fremkomsten af pattedyr akut hjerne skive præparater lettet eksperimenter på celle- og synaptisk niveau, der tidligere var kun muligt i hvirvelløse præparater som Aplysia1. Udvikling af akutte hippocampale skiver var af særlig betydning, da det er en struktur, der er ansvarlig for arbejdshukommelse og kontekstdannelse, og har en specialiseret tri-synaptisk kredsløb, der er modtagelig for let fysiologisk manipulation. Men langt størstedelen af akutte hjerne skiver er stadig fremstillet af relativt unge mus og rotter, da det er lettere at bevare sunde neuroner og kredsløb, og skiverne forbliver levedygtige i længere tid2,3,4. Her introducerer vi ændringer af standard udskæringsprotokoller, der resulterer i øget levedygtighed af akutte hippocampale skiver fra voksne og aldrende mus.
Den største hindring for den langsigtede ex vivo levedygtighed pattedyr hjerne parenkym er den oprindelige hypoxiske skader, der opstår hurtigt, når blodtilførslen til hjernen stopper efter halshugning. Tab af ilt resulterer i hurtigt metabolisk forbrug af store energiressourcer i hjernen med tab af fosfor-kreatin (P-kreatin) er den hurtigste, efterfulgt af glukose, adenosin tripfosfat (ATP), og glykogen4. Bevarelse af ATP er af særlig betydning for den langsigtede sundhed hjerne skiver, som ATP er nødvendig for at opretholde membranpotentialet via Na-K ATPase, og dermed neurale aktivitet5,6. ATP-niveauet i den voksne gnaver hjerne er ~ 2,5 mM, og det falder brat inden for 20 s af halshugning at nå en basal steady state (~ 0,5 mM) på omkring 1 min post-halshugning4,7,8. Hos unge dyr tager det længere tid at observere det samme fald i ATP (~2 min); med fænobarbital anæstesi det er yderligere bremset til 4 min4. Disse overvejelser viser, at forebyggelse af tab af ATP og andre energiressourcer er en nødvendig strategi for at forebygge hypoxiske skader på hjernen og til gengæld for at opretholde sundheden for hjerneskiver over længere perioder, især hos voksne dyr.
Lave temperaturer bremse stofskiftet. Det er derfor blevet påvist, at beskedne hypotermi beskytter hjernens energireserver: hos unge dyr, der sænker kropstemperaturen med seks grader, fra 37 °C til 31 °C, bevarer ATP-niveauet til ca. 80 % af de normale niveauer over 4 timer kontrolleret hypoxi9. P-kreatin niveauer er ligeledes bevaret, samt den samlede fosforylering potentiale9. Dette tyder på, at sænke kropstemperaturen før halshugning kunne være neuroprotektive, som næsten normale niveauer af ATP kunne opretholdes gennem skiven skæring og skive restitutionsperioder.
I det omfang et ATP-fald ikke kan forhindres fuldstændigt ved halshugning, forventes en delvist forringet funktion af Na-K ATPase, efterfulgt af depolarisering via passiv natriumtilstrømning. Da den passive natriumtilstrømning efterfølges af vand indtræden i celler, forårsager det cytotoksisk ødem og i sidste ende pyknose. Hos voksne rotter har udskiftning af na+ ioner med saccharose i skæreopløsninger været en vellykket strategi for at lette byrden ved cytotoksisk ødem10,11. For nylig, methylerede organiske kationer, der reducerer natrium kanal permeabilitet12 har vist sig at tilbyde mere effektiv beskyttelse end saccharose, især i skiver fra voksne mus, med N-methyl-D-glucamin (NMDG) er mest anvendelig på tværs af forskellige aldre og hjerne regioner13,14,15,16.
Talrige hjerne-udskæring protokoller indebærer brug af kolde temperaturer kun under skive-skæring trin, undertiden i kombination med Na+ ion udskiftning strategi16,17. Hos unge dyr, disse protokoller synes at tilbyde tilstrækkelig neuroprotection da hjernen kan udvindes hurtigt efter halshugning, fordi kraniet er stadig tynd og let at fjerne3. Men denne strategi producerer ikke sunde skiver fra voksne dyr. Over tid har en række laboratorier, der studerer voksne gnavere, indført transkardiisk perfusion med en iskold opløsning for at nedsætte dyrets kropstemperatur og dermed hypoxiske skader på hjernen før halshugning. Denne procedure blev anvendt med succes til at producere cerebellar skiver18, midbrain skiver19, neocortical skiver11,,20,perirhinal cortex21, rotte hippocampus10,22,,23, olfaktoriskepære 24, ventral striatum25, visuel cortex26.
På trods af de fordele, som transcardial perfusion og Na+ ion udskiftning i udarbejdelsen skiver fra rotte og i nogle hjerneregioner i mus, mus hippocampus er fortsat en af de mest udfordrende områder for at beskytte mod hypoxi13,20. Til dato, en af de mest almindelige tilgange til udskæring hippocampus fra aldrende mus og mus modeller af neurodegeneration indebærer den klassiske hurtige udskæring af den isolerede hippocampi27. I den protokol, der er beskrevet her, minimerer vi tabet af ATP i den voksne hjerne ved at indføre hypotermi før halshugning ved transkardiisk perfusing dyret med iskold Na+– gratis NMDG-baserede kunstige cerebrospinalvæske (NMDG-aCSF). Skiver skæres derefter i iskold Na+-fri NMDG-aCSF. Med denne forbedrede protokol opnår vi akutte hippocampale skiver fra voksne og aldrende mus, der er sunde i op til 10 timer efter udskæring og er passende til langsigtede felt-optagelser og patch-clamp undersøgelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den protokol, der er beskrevet her, viser, at hippocampale skiver fra voksne og aldrende mus kan forblive sunde og levedygtige i mange timer efter opskæring. De udsnit, der er udarbejdet ved hjælp af denne protokol, er velegnede til patch-clamp-optagelser samt langvarige feltoptagelser i CA1-områderne.
Der er to kritiske trin i denne protokol. Første skridt er transkardieperfusionstrinnet med en iskold opløsning. Hurtig clearance af blod signaleres ved hurtig ændring af leverfarve. Ekstr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jeg takker Dr. Carla J. Shatz for råd og støtte, og Dr. Barbara K. Brott og Michelle K. Drews for kritisk at læse manuskriptet. Arbejdet er støttet af NIH EY02858 og Mathers Charitable Foundation tilskud til CJS.
Materials
| “60 degree” tool | made in-house | ||
| #10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
| 1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
| 95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
| Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
| Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
| CCD camera | Olympus | XM10 | |
| Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
| Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
| Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
| Feather blades | Feather | FA-10 | |
| Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
| Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
| Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) – porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | |
| Ice buckets | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
| Magnetic stirrers and stir bars | |||
| Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
| Needle 27G1/2 | |||
| NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Paper tape | |||
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
| Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
| Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
| pH meter | |||
| Recovery chamber | in-house made | ||
| Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
| Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
| Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
| Spatulas | |||
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
| Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
| Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |
References
- Glanzman, D. L. The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants. Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).
- Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
- Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).
- Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain. Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus. Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus. Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).
- Free Mandel, P. H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals. Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).
- Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).
- Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats. Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).
- Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons. Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex. Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).
- Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).
- Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. . Patch-Clamp Methods and Protocols. 1183, 221-242 (2014).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), 1-10 (2015).
- Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids. Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).
- Djurisic, M., et al. PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).
- Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
- Blot, A., Barbour, B. Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau. Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).
- Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli. Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visual Experiments. (132), e53825 (2018).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).
- Frick, A., Magee, J., Johnston, D. LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites. Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).
- Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell. PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).
- Brooks, J. M., O’Donnell, P. Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).
- Goel, A., Lee, H. K. Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex. Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).
- Izumi, Y., Zorumski, C. F. Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices. Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).
- Hajos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).
- . Hippocampus Rat Available from: https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat (1999)
- Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons. Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
