Summary
これは、経心面灌流と氷冷NMDG-aCSFによるスライス切断を利用して組織への低酸素損傷を軽減する、成体および老化マウス海馬からの急性スライス調製のためのプロトコルである。結果のスライスは、長時間にわたって健康を維持し、長期的なパッチクランプやフィールド記録に適しています。
Abstract
急性海馬スライスは、神経科学者の世代がシナプス、神経細胞、および回路特性を詳細かつ高忠実に探求することを可能にしました。LTPとLTDのメカニズムの探査、単一ニューロン樹状計算、回路の経験依存的変化は、この古典的な準備なしには不可能でした。しかし、いくつかの例外を除いて、シナプスおよび本質的な興奮性メカニズムがP60を過ぎて到達する長い発達尾を有するにもかかわらず、急性海馬スライスを使用してほとんどの基礎研究は、比較的若い年齢のげっ歯類からのスライスを使用して行われてきた〜P20-P40。若い海馬スライスを使用する主な魅力は、低酸素損傷に対する耐性の高い助けとなる神経細胞の健康の維持です。しかし、発達のより成熟した段階での神経機能を理解する必要があり、加齢脳準備を必要とする神経変性疾患の様々な動物モデルの開発によってさらに強調される。ここでは、成人および老化したマウス海馬から健康的なスライスを確実に送達する急性海馬スライス調製物の変更について説明する。プロトコルの重要なステップは、経心面灌流と氷冷ナトリウムフリーNMDG-aSCFによる切断です。これらのステップは、切断時のATPにおける低酸素低下と、受動ナトリウムフラックスによって引き起こされる細胞傷害性浮腫を減衰させる。振動マイクロトームを用いて海馬と皮質の横切りスライスをカットする方法を実演します。この方法で得られた急性海馬スライスは、記録の多くの時間にわたって確実に健康であり、蛍光標識ニューロンのターゲティングを含むフィールドレコーディングとターゲットパッチクランプ記録の両方に適しています。
Introduction
哺乳動物急性脳スライス製剤の出現は、以前はAplysia1のような無脊椎動物製剤でのみ可能であった細胞およびシナプスレベルでの実験を促進した。急性海馬スライスの開発は、ワーキングメモリとコンテキスト形成を担当する構造であり、容易な生理学的操作に適した特殊なトライシナプス回路を有するため、特に重要であった。しかし、急性脳スライスの大部分は、健康なニューロンおよび回路を維持する方が容易であり、スライスは22、3、43,4の長い期間生存可能なままであるため、比較的若いマウスおよびラットからまだ調製される。ここでは、成体および老化マウスからの急性海馬スライスの生存率を高める標準的なスライスプロトコルの変更を紹介する。
哺乳類の脳実質の長期的なex vivo生存率への主要な障害は、切断後に脳への血流が止まると急速に起こる最初の低酸素損傷である。酸素の損失は、ホスホクレアチン(P-クレアチン)の損失が最も急速である脳内の主要なエネルギー資源の速い代謝消費をもたらし、次いでグルコース、アデノシン三リン酸(ATP)、およびグリコーゲン4が続く。ATPの保存は、脳スライスの長期的な健康にとって特に重要であり、NA-K ATPaseを介して膜電位を維持するためにATPが必要であり、その結果、神経活動55、6。6成人げっ歯類脳のATPレベルは〜2.5mMであり、約1分の切断後4,4、7、8,8で基底定常状態(約0.5mM)に達するために切断の20s以内に急激に低下する。若い動物では、ATPの同じ低下を観察するのに時間がかかります(〜2分)。フェノバルビタール麻酔では4分4までさらに遅くなる。これらの考慮事項は、ATPおよび他のエネルギー資源の損失を防ぐことは、脳への低酸素損傷を防ぎ、特に成虫動物においてより長い期間にわたって脳スライスの健康を維持するために必要な戦略であることを示している。
低温は代謝を遅くする。その結果、控えめな低体温は脳エネルギー埋蔵量を保護することが実証されている:若い動物では、体温を6度下げ、37°Cから31°Cに、制御された低酸素の4時間にわたって正常レベルの約80%にATPレベルを維持する9。Pクレアチンレベルも同様に保存され、全体的なリン酸化電位9.これは、切断前の体温を下げることは、スライス切断およびスライス回復期間を通じてATPのほぼ正常レベルを維持することができるので、神経保護であり得ることを示唆している。
切断時にATP低下を完全に防止できない程度に、Na-K ATPaseの部分的に障害のある機能が期待され、続いて受動ナトリウム流入による脱分極化が予想される。受動的なナトリウム流入が続いて細胞への水の侵入が続くにつれて、細胞毒性の浮腫と最終的にピクノーシスを引き起こす。成虫ラットでは、スライス切断液中でNa+イオンをスクロースに置き換えることは、細胞傷害性浮腫10,11,11の負担を軽減する戦略として成功している。最近では、ナトリウムチャネル透過率,12を減少させるメチル化有機カチオンは、特に成体マウスからのスライスにおいて、特に成人マウスからのスライスにおいて、N-メチル-D-グルカミン(NMDG)が13、14、15、16の異なる13,14,15年齢および脳領域にわたって最も広く適用可能である、スクロースよりも効果的な保護を提供することが示されている。16
多くの脳スライスプロトコルは、スライス切断ステップ中にのみ冷たい温度を使用することを含み、時にはNa+イオン置換戦略16、17,17と組み合わせて。若い動物では、頭蓋骨はまだ薄く、取り除きが簡単なので、脳は切断後に迅速に抽出することができるので、これらのプロトコルは十分な神経保護を提供するように見える。しかし、この戦略は、成虫の動物から健康的なスライスを生成しません。時間が経つにつれて、成虫のげっ歯類を研究する多くの研究室は、動物の体温を低下させ、したがって切断前に脳に低酸素損傷を与えるために氷冷溶液で経心輸を導入してきた。この手順は、小脳スライス18、中脳スライス19、新皮質スライス11、20、20海中11皮質21、ラット海馬10、22、23、22,23嗅球10球24、腹側線条体25、視覚皮質26を生成するために正常に適用された。
ラットおよびマウスのいくつかの脳領域でのスライスを調製する術後灌流およびNa+イオン置換によって提供される利点にもかかわらず、マウス海馬は低酸素13、20,20から保護する最も困難な領域の1つである。現在までに、老化したマウスおよび神経変性のマウスモデルから海馬をスライスする最も一般的なアプローチの1つは、孤立した海馬27の古典的な高速スライスを伴う。ここで説明するプロトコルでは、動物に氷冷Na+-無料のNMDGベースの人工脳脊髄液(NMDG-aCSF)を経線的に浸透させることによって、切断前に低体温症を導入することにより、成人脳におけるATPの損失を最小限に抑える。スライスは、氷冷Na+-free NMDG-aCSFでカットされます。この強化されたプロトコルにより、スライス後最大10時間健康で、長期的なフィールドレコーディングやパッチクランプ研究に適した成体および老化マウスから急性海馬スライスを取得します。
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Protocol
このプロトコルは、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイドに従って行われ、スタンフォード大学の施設動物ケアと使用委員会によって承認されています。方法は、神経科学研究における動物と人間の使用に関する神経科学学会の方針にも従っています。
注:すべてのマウスは病原体のない環境で維持された。C57Bl/6 x SV/129J遺伝的背景を組み合わせた野生型マウスが、特に記載されていない限り、ここで使用された。
1. セットアップ
- 1x aCSF(mM)の1 Lを準備する:125 NaCl、26 NaHCO 3、2.3 KCl、1.26 KH2PO4、1.3Mg32SO4·7H2O、2.5 CaCl2、25グルコース(表1)このソリューションは、回復チャンバーとその後の記録に使用します。
注: NaCl、NaHCO 3、KCl、およびKH2PO34を含む10xストックソリューションとしてaCSFを保管してください。1 MストックソリューションとしてMg2SO4·7H2OとCaCl2を保存します。上記のストック溶液から実験日に作業ソリューションを準備し、18 MΩ水で最終容積を調整する前にグルコースを追加します。
注:脳領域やマウス株に応じて、冷やされたaCSFは、成功11、15、2615,26との心筋灌流にも使用することができます。11 - 300 mL の NMDG-aCSF (mM で): 135 NMDG, 1 KCl, 1.2 KH2PO4,1.5 MgCl2,0.5 CaCl2,20 コリン重炭酸塩, 10 グルコース (表 1) 。NMDG-aCSFのこの容積は、心筋灌流および切断の両方のステップのために十分である。
注:NMDG-aCSFを3倍のストックソリューションとして4°Cに保存してください。 実験の日に作業ソリューションを準備します。18 MΩ水で最終容積を調整する前に、コリン重炭酸塩とグルコースを追加します。溶液を95%O2/5%CO2で2泡立て、それを緩衝し、酸素で飽和させる。
注:NMDGストックはアルカリ性が高く、pHを〜7.4に調整するには濃縮塩酸(HCl)が必要です。塩酸の添加は、過剰なHClで〜pH3に溶液を酸性化することが容易であるため、pH8以下に一度遅くすべきである。この調整は、2価のカチの追加前に行う必要があります。このNMDG-aCSFレシピはナトリウムフリーです。以前に公開されたNMDGレシピは、バッファリングに30 mM NaHCO3を使用し、NMDG-aCSF13,20,20に存在する30 mMナトリウムをもたらす。 - 振動マイクロトーム切断トレイと取り付けディスクを-20°Cに設定します。
- 回復室を準備します。
- スライス保持メッシュのすぐ上に回復チャンバーを充填し、室温でベンチに保管し、気泡を入れます。
注:ここで使用されるスライス回収チャンバーは、エドワーズとコナート3によって以前に説明した古典的なチャンバーに非常によく似ています。aCSFは、底部に接着された黒いナイロンメッシュと丸いアクリルフレームを保持するガラスビーカー(400 mL)に保持されています。アクリルフレームは、ビーカーの端に置いてアクリルフックを介してビーカーの真ん中に吊り下げ.ガラスのバブラーは底までずっと挿入される。設計はスライスの両側の酸素化を可能にする。バブリングはまた回復室のaCSFの一定の混合を提供する。黒いメッシュは、オフホワイトのスライスに対して高コントラストを提供し、その後見やすくなります。
- スライス保持メッシュのすぐ上に回復チャンバーを充填し、室温でベンチに保管し、気泡を入れます。
- 心筋灌流および切断液を準備します。
- 氷の結晶が表面とボトルの壁に形成され始めるまで、冷凍庫でNMDG-aCSFの全体の300 mLを冷やします。凍結し過ぎないでください!
- 冷やしたNMDG-aCSFを入れたボトルを氷と泡の上に置きます。このソリューションは 0\u20122 °C の間にする必要があります。
注:Slushy NMDG- aCSFは溶液の大部分を液体として持つことを意味し、存在するスラッシーアイスのごく一部は、灌流および切断を通じて0°C近くに溶液を維持します。切断中に脳から氷の結晶を遠ざけるように注意する必要があります。
- ティッシュ取り付けディスクを準備します。
- ディスクを冷凍庫から取り出し、必要に応じて拭き取ります。
- 以前に用意した寒天板から5%寒天のブロックを切り取り、シアノアクリル酸接着剤の薄い層を使用してディスクの中央に接着します。寒天の部分は、マウスの脳ほどの大きさでなければなりません。氷の上に接着した寒天でディスクを置き、それが使用する準備が整うまでペーパータオルで覆います。
- 5%寒天プレートの場合、マイクロウェーブで18MΩ水の100mLに5gの寒天を溶解し、きれいなシャーレに注ぎます。4 °Cに保ちます。
- カッティングトレイを冷凍庫から取り出し、ミクロトームに入れ、氷で囲んでブレードを積みます。
2. 心筋透析と脳の抽出
- 麻酔カクテルの腹腔内注射による過剰摂取マウス。痛みの反射(つま先ピンチ)をチェックすることによって麻酔の深さをチェックしてください。マウスは、深部麻酔に達した後、反射を示すべきではありません.
げっ歯類麻酔カクテルのレシピ:ケタミンHCl(66 mg/mL)、キシラジンHCl(6.6 mg/mL)、アセプロマジンマレイン酸(0.1mg/mL)、18 MΩ水から最終体積。投与量: 0.4 mg/g体重, 0.04 mg/g体重, 6 x 10-4 mg/g体重ケタミン, キシラジン, アセプロマジン, それぞれ. - 経心面灌流用の蠕動ポンプを設置します。ポンプチューブの片側を、アイスNMDG-aCSFでボトルに挿入します。左心室に挿入される27G針でチューブの反対側を合わせます。
- ポンプ速度を約3.5mL/分に設定します。この速度では、NMDG-aCSFの流出は速いドリップであり、連続的な流れではありません。
注:重力による灌流は、同じ近似流速が達成できる限り、蠕動性ポンプ灌流の代わりに優れています。高い流量での灌流は、脳内の破裂血管をもたらす。過度に速い灌流と血管の圧力の増加の物語の兆候は、動物の鼻から出てくる溶液です。 - 灌 流
- 適切に麻酔をしたマウスを背面におむつに置きます。紙テープを使用して、胸部と腹部が露出するように前足と後ろ足をテープダウンします。
- 胸の上の皮膚の大きなパッチを切り取ります, 胸骨の下から喉に行きます;これは、大きな作業領域を提供する必要があります。胸骨を鉗子でつかみ、そっと持ち上げ、胸腔が露出するまで両側のリブケージを切り抜け始めます。
- 胸腔を露出させるためにダイヤフラムを切り抜ける。リブケージのフラップは、筋肉の薄い部分を介して取り付けられたままにする必要があります。露出した胸腔にフォールバックすることなく、側面に置くことも可能です。心臓がまだ鼓動していることを確認してください。肝臓の大部分が見えるようにしてください。
- 左心室に27G針を挿入します。マウスの左心室は右よりも明るく見えます。暗い赤い色の右心房を見つけます。小さいはさみで右心房を切り抜ける。血液が流れ出し始めるはずです。
- 正しい流速にプリセットされたポンプを起動します。すべてが正しく行われた場合、肝臓は、灌流の開始後すぐに赤から茶色に色を変更し始める必要があります。肝臓の色を監視して、灌流の長さを決定します。肝臓は淡い茶色に変わるはずです。
- ポンプを数分間実行します。直腸温度計を使用する場合、体温は28\u201229°Cに下がり、動物の鼻は触れるに冷たいはずです。
- 脳抽出.
注:このステップでは、切断ハサミ、まっすぐまたは斜めの刃を備えた小さなはさみ、メスと#10ブレード、単一エッジブレード、#3鉗子、片側を90°に曲げたへら、スパチュラ、「60°」ツール(図1A,B)、小さな柔らかいブラシを用意しています。- 大きな切断ハサミでマウスの首を切ります。刃が付いたメス#10使用して、頭蓋骨の上に皮膚を切り開きます。小さな斜められたはさみで、真中線で頭蓋骨を切ります。次に、#3鉗子を使用して、頭蓋骨の左右の半分を詮索し、それでデュラを取り除くように注意してください。脳は今露出する必要があります。
注:硬膜が頭蓋骨から切り離された場合、それは脳の上にとどまり、別々に取り除かなければなりません。残りの硬膜の縁は、脳を深く引き締めてスライスすることができ、関心のある脳領域に損傷を与える可能性があります。 - 小さなへらでそれをすくうことによって脳を取り除く。氷の上の別の小さなビーカーに入れたNMDG-aCSF溶液に脳を落とす。そこには1分間放置してください。
注:低体温症に加えて、氷冷食食症への暴露は、切断に必要な脳を上に作り上げています。切断から脳の抽出までの手順全体は、30 s以下でなければなりません。
- 大きな切断ハサミでマウスの首を切ります。刃が付いたメス#10使用して、頭蓋骨の上に皮膚を切り開きます。小さな斜められたはさみで、真中線で頭蓋骨を切ります。次に、#3鉗子を使用して、頭蓋骨の左右の半分を詮索し、それでデュラを取り除くように注意してください。脳は今露出する必要があります。
3. スライス
- NMDG-aCSFから脳を取り出し、フィルターペーパーの上に置きます。
- 正中線を中心とした「60°」ツールを使用して、前脳のロストラル端から60°くさびを切って取り除きます。切断面は、後述するように、海馬横断スライスの適切な角度を達成するために取り付けに使用されます(図1A,B)。
注:自家製ホルダーを介して一緒に保持された2つの片刃の刃は60°カットを作るための使いやすい用具を作る(図1A)。 - メスで中線の下の半球を分離します。
- 半球を取り付けディスクに次のように接着します。今まで氷の上にあった取り付けディスクを取ります。必要に応じて、もう一度拭き取ります。寒天ブロックの前に各半球を接着し、側面を切り取ります。
- 各半球の腹側が寒天ブロックに触れていることを確認します。寒天ブロックは切断の間に付加的なサポートを提供し、スライスでさえ必要である。各半球の裏側はブレードに面している必要があります。カット側に接着すると、各半球は、その場で裏海馬の横切りスライスをもたらすように、ブレードに対して相対的に向けられます(図1B)。
- 氷冷カルボゲン化されたNMDG-aCSFを含む切断室に半球でディスクを浸します。
- 400 μmのセクションをカットします。切断は10分以内に行う必要があります。異なるミクロトームは、この時間を達成するために異なる設定を必要とします。海馬後ろ海馬領域から合計8\u201210スライスが得られます。
4. 回復
- カットオフチップ付きの使い捨て転送ピペットを使用して、室温でカルボゲン化されたaCSFを含む回復チャンバーにスライスを移す(図1C)。
注:5 mM Na-アスコルビン酸と3 mM Na-ピルビン酸を備えた回収チャンバーaSCFを強化することを強くお勧めします。ピルビン酸は、スライス28におけるATPの生産を促進するために示されるエネルギー基質であり、Na-アスコルビン酸はフリーラジカルクエンチャー29である。 - 記録前に室温(22\u201224°C)で約2時間(最大4時間)インキュベートします。
注:室温でのインキュベーションが長いほど、37°Cでの標準インキュベーションに比べて、より長い期間、より健康的なスライスが生じ、その後室温インキュベーションが続きます。37°Cでの再暖めは、細胞毒性浮腫13を導入することができる。
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Representative Results
上記のプロトコルを適用して、CamKIIa-Cre+から海馬スライスを生成しました。混合遺伝的背景C57Bl/ 6 x SV / 129J上のWTマウス、P > 120で。CA1フィールド(図2A)およびsubiculum(図2B)の多数の錐体細胞は、薄いコントラストで観察すると低コントラストで現れる(IR-DIC)、スライス調製における健康な細胞の特徴である。この準備により、ギガオームシールの高率(>90%)は、表面の下で約 20\u201250 ミクロンの最も健康な細胞を標的にするときに、日常的に達成されます。この成功率のためには、この深さでピラミッド型細胞を適切に可視化するために、60倍の水浸漬目的のようなIR-DICに対して高いNA目標を使用することが重要である(図2A,B)。
単一ニューロンからのパッチクランプ記録は、生後6ヶ月以上のマウスでもこの海馬スライス製剤を使用して容易に達成可能である。 図2C は、CA1ニューロンからのミニチュア興奮性ポストナプティック電流(mEPSC)記録を用いた実験例を示す。3分間の20 μM NMDAの浴用途による化学NMDA-LTDの誘導は、60分ポストNMDA処理を評価した場合にCA1細胞のmEPSC周波数を低下させます。この知見は、NMDA-LTDが古いマウスにおけるCA1におけるシナプスの活性依存性剪定を引き起こすことを示唆している(Djurisic et al.15.mEPSC振幅の変化は検出されなかった。mEPSCの記録の間に、CA1細胞もバイオシチンで満たされた。 図2D は、生体シチンで満たされたCA1錐体ニューロンの無傷樹状樹状樹状樹状および健康な細胞習慣を明らかにする。細胞全体の蛍光色素の強い分布は異なった実験条件の下で樹状脊柱の特性の定期的な評価を可能にする。
フィールド記録を用いて、成体マウスからのスライスにおけるCA3-CA1シナプスの約170%の長期増強(LTP)が容易に観察され、LTPに必要なシグナル伝達カスケードの維持を示唆した(図2E,F)。堅牢なフィールド励起的なポストナプティック電位(fEPSP)信号に必要なネットワーク接続も保持されます(図2E)。成人または加齢マウスからの海馬スライスのシナプス可塑性を評価する能力は、その顕著なシナプス機能不全が人生の後半に発症するにつれて、神経変性疾患のマウスモデルに特に関連する。
我々の結果は、経心的灌流および氷冷NMDGベースの溶液が低酸素損傷を最小限に抑えるために使用される限り、単一細胞と細胞の集団の両方のレベルでシナプス機能の評価を日常的に可能にすることを示している。
図1:成体および加齢マウスからの海馬横断スライスの切断方法と回収(A) 脳の鼻の端から60°のくさびを取り除くのに使用される「60°」ツールで、中線を中心にした。(B) 横切りスライスの切削用半球の位置決め。60°カットの図は、左と右上のパネルに表示されます。右下のパネルに示すように接着剤で表面上の2つの半球の位置を設定すると、ブレードに対して、裏海馬の垂直方向を保証します。この向きは海馬の横切りスライスをもたらす。黄色の構造は、げっ歯類の脳内の海馬の3Dレンダリングです(灰色)。この図は、SynapseWeb30から適応されています。すべてのビューは、脳の後ろ側の.(C)回復室で生後4ヶ月のマウスから切り取られた海馬のスライスを越えて。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:P120\u2012180のマウスからの海馬スライスにおけるパッチクランプおよびシナプス可塑性測定(A) CA1領域のIR-DIC顕微鏡写真の例。(B) 例えば、副分のIR-DIC顕微鏡写真。AとBの両方で、画像は60倍の水浸し目的で切断した後3時間撮影されます。キャリブレーションバーは10μm(C)P120\u2012180マウスのCA1ニューロンのmEPSに対する化学NMDA-LTDの効果です。C上部パネルは、ベースラインおよびNMDA-LTDパルス後に記録されたmEPSのトレース例です。左下パネル: NMDA-LTDは、低いmEPSC周波数をもたらした。右下パネル: NMDA-LTDが検出されなかった後のmEPSC振幅変化。N=ベースラインで17細胞及びn=NMDA-LTD、6マウスに対して15個の細胞。P = 0.004、t検定。この図は、ジュリシックら15.(D) 生物細胞細胞に充填されたCA1の例(E) シャファー側副刺激後のCA1層ラジウムからのfEPSPシグナルの例グレーのトレースはベースライン記録中に得られ、黒いトレースはテタニック刺激の20分後に観察される。各トレースは、平均 30 個の連続トレースです。(F) 100 Hz誘導の4つの列車の後のCA3-CA1シナプスの長期増強の累積平均;n = 約P90で8WTマウスから23スライス。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 人工脳脊髄液(aCSF) | ||||
| 成分 | Mw | 最終コンク(mM) | g/2 リットル (10X) | g/リットル (1X) |
| 塩化 ナトリウム | 58.44 | 125 | 146.1 | - |
| ナフコ3 | 84.01 | 26 | 43.68 | - |
| Kcl | 74.55 | 2.3 | 3.43 | - |
| KH2PO4 | 136.1 | 1.26 | 3.44 | - |
| Mg2SO4*7H2O | 203.3 | 1.3 | - | 1.3 ml の 1M ストック |
| CaCl2*2H2O | 147.02 | 2.5 | - | 1Mストック2.5ml |
| グルコース*H2O | 180.2 | 25 | - | 4.5グラム |
| a) 1M株からMg2SO4 *7H2OおよびCaCl2 *2H2Oを追加 | ||||
| b) aCSF 10X は@RTを維持します。 | ||||
| c) aCSF 1X @4°C 24h | ||||
| NMDG-aCSF | ||||
| 成分 | Mw | 最終コンク(mM) | g/2 リットル (3X) | g/300 ml (1X) |
| NMDG | 195.22 | 135 | 158.13 | - |
| pH=7.4 と HCl | ||||
| Kcl | 74.55 | 1 | 0.4473 | - |
| KH2PO4 | 136.1 | 1.2 | 0.9799 | - |
| MgCl2*6H2O | 203.3 | 1.5 | 1.8297 | - |
| CaCl2*2H2O | 147.02 | 0.5 | 0.4411 | - |
| コリン重炭酸塩 | 80% | 20 | - | 1238 μl |
| グルコース*H2O | 180.2 | 10 | - | 0.54 |
| a) 4°Cで3Xストックソリューションをフィルタして保存 | ||||
表1:メディア製剤。
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Discussion
ここで説明するプロトコルは、成体および老化マウスから得られた海馬スライスが切断後何時間も健康で生存可能であり続けることができることを示している。このプロトコルを使用して作成されたスライスは、パッチクランプの記録だけでなく、CA1リージョンでの長時間のフィールド記録に適しています。
このプロトコルには 2 つの重要な手順があります。最初のステップは、氷冷溶液を用いた心筋灌流ステップである。血液の速いクリアランスは、肝臓の色の急速な変化によってシグナルされます。抽出された脳は、色がオフホワイトである必要があります。脳がピンクのままであれば、全身血液が冷たいNMDG-aCSFに置き換えられず、体温の低下が達成されなかったことを意味する。これは、心臓への針の不適切な配置、または心臓が穿刺されたために引き起こされる可能性があります。不十分に浸透したマウスの脳は、スライスに使用されるべきではありません。第2の重要なステップは、ナトリウムイオンの代用品としてNMDGを使用することです。ラット脳10,31におけるNa+の代替としてスクロースを使用することに成功したプロトコルの既知の以前のバリエーションは、31マウスで十分に健康な海馬スライスを産生しない(Ting et al.13も参照)。ナトリウムイオン代替としてNMDGの使用は、マウス海馬スライスのために重要です.
健康な海馬のスライスは、記載されたプロトコルを使用して確実に得られるが、成虫および老化動物からの海馬製剤は依然として困難である。その難易度も異なるマウスラインと遺伝的背景で変化します。考慮すべき潜在的な修飾は、タウリン、D-セリン、またはN-アセチルシステイン(NAC)のようなNMDG-aCSFおよび回復aCSF溶液への添加剤であり、ニューロンおよびシナプス機能13、29,29を増強し、酸素化を増加させる。 Cl-イオンの置換も、灌流および切断32の間に考慮されるべきである。インターフェース回収室の使用は、酸素の増加を維持するもう一つの方法であり、これは特に長期的な可塑性フィールド記録に関連する。上記回復チャンバ(図1C)は、その目的のために変更可能である(例えば、aSCFによって下から湿らせた培養インサートディッシュは、水没したメッシュを置換することができる)。スチールブレードをサファイアまたはセラミックブレードに置き換えると、海馬周辺の白質の重い髄鞘化によって組織の圧迫が悪化する可能性があります。これは、スライス表面近くのニューロンの品質をさらに向上させる可能性があります。垂直振動を最小限に抑えるように設計されたマイクロトーム(例えば、ライカVT1200Sのゼロ-z)を使用して、もう一つの変更可能なステップです。
他の脳領域は、切断角度の適切な変更で、ここで説明したプロトコルを使用してスライスすることができます。さらに、異なる脳領域が異なる程度に低酸素症に敏感であるように、スライス調製物のストリンジェンシーを調整することができます。NMDG-aSCFを使用するプロトコルは、成人マウス新皮質および線条体スライス調製物13、20,20について報告されている。それは30 mM NaHCO3(すなわちNa+-freeではない)20を含むNMDG-aCSFを使用し、そして場合によっては、心筋灌流は室温13でNMDG-aCSFと共に行う。しかし、海馬のように低酸素症の影響を受けやすい領域では、Na+-free NMDG-aCSFと氷冷心筋灌流を使用すると、重大な違いが生じうる。
このプロトコルは、神経変性疾患をモデル化するトランスジェニックマウスラインの広大な配列に適用可能です。さらに、このプロトコルは、他の哺乳類モデル種からの脳スライスにさらに変更することができます。このプロトコルは、一緒に、老化した動物からの急性海馬スライスのための標準化された準備の基礎として役立ち、したがって、疾患メカニズムの文脈における研究間の比較を容易にする。
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Disclosures
著者は開示するものは何もない。
Acknowledgments
カーラ・J・シャッツ博士の助言と支援、バーバラ・K・ブロット博士、ミシェル・K・ドリューズ博士の原稿を批判的に読んでくださったことに感謝します。この作品はNIH EY02858とマザーズ慈善財団がCJSに助成金を提供しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| “60 degree” tool | made in-house | ||
| #10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
| 1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
| 95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
| Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
| Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
| CCD camera | Olympus | XM10 | |
| Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
| Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
| Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
| Feather blades | Feather | FA-10 | |
| Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
| Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
| Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | |
| Ice buckets | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
| Magnetic stirrers and stir bars | |||
| Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
| Needle 27G1/2 | |||
| NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Paper tape | |||
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
| Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
| Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
| pH meter | |||
| Recovery chamber | in-house made | ||
| Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
| Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
| Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
| Spatulas | |||
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
| Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
| Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |
References
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