Detta är ett protokoll för akut skiva beredning från vuxna och åldrande mus hippocampi som drar nytta av transkardialaperfusion och skiva skärning med iskall NMDG-aCSF att minska hypoxisk skada på vävnaden. De resulterande skivorna håller sig friska under många timmar, och är lämpliga för långsiktiga patch-clamp och fält-inspelningar.
Akut hippocampus skivor har gjort det möjligt generationer av neuroforskare att utforska synaptiska, neuronala, och krets egenskaper i detalj och med hög trohet. Utforskning av LTP och LTD mekanismer, enda neuron dendritic beräkning och erfarenhet-beroende förändringar i kretsar, skulle inte ha varit möjligt utan denna klassiska beredning. Men med några få undantag, de flesta grundläggande forskning med akut hippocampus skivor har utförts med hjälp av skivor från gnagare i relativt unga åldrar, ~ P20-P40, även om synaptiska och inneboende retbarhet mekanismer har en lång utvecklingsstjärt som når förbi P60. Den viktigaste överklagandet av att använda unga hippocampus skivor är bevarande av neuronal hälsa med hjälp av högre tolerans mot hypoxisk skada. Det finns dock ett behov av att förstå neuronal funktion på mer mogna stadier av utveckling, ytterligare accentueras av utvecklingen av olika djurmodeller av neurodegenerativa sjukdomar som kräver en åldrande hjärnan förberedelse. Här beskriver vi en ändring av en akut hippocampus skiva beredning som på ett tillförlitligt sätt levererar friska skivor från vuxna och åldrande mus hippocampi. Protokollets kritiska steg är transkardial perfusion och skärning med iskall natriumfri NMDG-aSCF. Tillsammans dämpar dessa steg den hypoxiinducerade droppen i ATP vid halshuggning, samt cytotoxiskt ödem som orsakas av passiva natriumfluss. Vi visar hur man skär tvärgående skivor av hippocampus plus cortex med hjälp av en vibrerande mikrotom. Akut hippocampus skivor som erhållits på detta sätt är tillförlitligt friska under många timmar av inspelning, och är lämpliga för både fält-inspelningar och riktade patch-clamp inspelningar, inklusive inriktning av fluorescerande märkt nervceller.
Tillkomsten av däggdjur akut hjärnan skiva preparat underlättas experiment på cellulär och synaptisk nivå som tidigare var möjligt endast i ryggradslösa preparat som Aplysia1. Utveckling av akut hippocampus skivor var av särskild betydelse, eftersom det är en struktur som ansvarar för arbetsminne och sammanhang bildning, och har en specialiserad tri-synaptiska kretsar som är mottagliga för lätt fysiologisk manipulation. Emellertid, de allra flesta akut hjärnan skivor är fortfarande beredda från relativt unga möss och råttor, eftersom det är lättare att bevara friska nervceller och kretsar, och skivorna förblir livskraftiga under längretidsperioder 2,3,4. Här inför vi ändringar i standard skivning protokoll som resulterar i ökad lönsamhet för akut hippocampus skivor från vuxna och åldrande möss.
Det stora hindret för den långsiktiga ex vivo livskraften hos däggdjurshjärnparenkym är den initiala hypoxiska skada som inträffar snabbt när blodflödet till hjärnan slutar efter halshuggning. Förlust av syre resulterar i snabb metabolisk konsumtion av större energiresurser i hjärnan med förlusten av fosfo-kreatin (P-kreatin) är den snabbaste, följt av glukos, adenosintrifosfat (ATP), och glykogen4. Bevarande av ATP är av särskild betydelse för den långsiktiga hälsan hos hjärnan skivor, som ATP behövs för att upprätthålla membranet potential via Na-K ATPase, och följaktligen den neurala aktiviteten5,6. ATP-nivån i den vuxna gnagare hjärnan är ~ 2,5 mM, och det droppar precipitously inom 20 s av halshuggning för att nå en basal steady state (~ 0,5 mM) på cirka 1 min post-halshuggning4,7,8. Hos unga djur tar det längre tid att observera samma droppe i ATP (~2 min); med fenobarbital anestesi det bromsas ytterligare till 4 min4. Dessa överväganden visar att förhindra förlust av ATP och andra energiresurser är en nödvändig strategi för att förhindra hypoxisk skada på hjärnan och i sin tur att upprätthålla hälsan hos hjärnan skivor över längre tidsperioder, särskilt hos vuxna djur.
Låga temperaturer saktar ner ämnesomsättningen. Följaktligen har det visats att blygsam hypotermi skyddar hjärnans energireserver: hos unga djur, sänka kroppstemperaturen med sex grader, från 37 °C till 31 °C, bevarar ATP-nivåer till cirka 80% av normala nivåer över 4 h av kontrollerad hypoxi9. P-kreatinhalterna bevaras på liknande sätt, liksom den totala fosforyleringspotentialen9. Detta tyder på att sänka kroppstemperaturen före halshuggning kan vara nervskyddande, som nästan normala nivåer av ATP skulle kunna upprätthållas genom skiva styckning och skiva återhämtning perioder.
Till den grad att en ATP-droppe inte helt kan förhindras vid halshuggning förväntas en delvis försämrad funktion av Na-K ATPase, följt av depolarisering via passiv natriumtillströmning. Eftersom den passiva natriumtillströmningen följs av vatteninträde i celler, orsakar det cytotoxiska ödem och så småningom pyknosis. Hos vuxna råttor har det varit en framgångsrik strategi att ersätta Na+ joner med sackaros i skärande lösningar som är en framgångsrik strategi för att lindra bördan av cytotoxisktödem 10,11. På senare tid har metylerade organiska katjoner som minskar natrium kanal permeabilitet12 visat sig erbjuda effektivare skydd än sackaros, särskilt i skivor från vuxna möss, med N-metyl-D-glucamine (NMDG) är mest allmänt tillämpliga i olika åldrar och regioner hjärnan13,14,15,16.
Många hjärnskärningsprotokoll innebär att man bara använder kalla temperaturer under det skärande steget, ibland i kombination med Na+ jonersättningsstrategi16,17. Hos unga djur, dessa protokoll verkar erbjuda tillräcklig neuroprotektion eftersom hjärnorna kan utvinnas snabbt efter halshuggning eftersom skallen är fortfarande tunn och lätt att ta bort3. Denna strategi producerar dock inte friska skivor från vuxna djur. Med tiden har ett antal laboratorier som studerar vuxna gnagare infört transkard perfusion med en iskall lösning för att minska djurets kroppstemperatur, och därför hypoxisk skada på hjärnan, före halshuggning. Detta förfarande tillämpades framgångsrikt för att producera cerebellar skivor18, midbrain skivor19, neokortikala skivor11,20, perirhinal cortex21, råtta hippocampus10,22,23, luktbulb24, ventral striatum25, visuell cortex26.
Trots de fördelar som erbjuds av transkardial perfusion och Na+ jonersättning i att förbereda skivor från råtta och i vissa regioner i hjärnan hos möss, är mus hippocampus fortfarande en av de mest utmanande områden för att skydda från hypoxi13,20. Hittills innebär en av de vanligaste metoderna för att skära hippocampus från åldrande möss och musmodeller av neurodegeneration den klassiska snabb skivning av den isolerade hippocampi27. I det protokoll som beskrivs här, minimerar vi förlusten av ATP i den vuxna hjärnan genom att införa hypotermi före halshuggning genom transcardially perfusing djuret med iskall Na+– fri NMDG-baserade konstgjorda ryggmärgsvätskan (NMDG-aCSF). Skivor skärs sedan i iskall Na+-fri NMDG-aCSF. Med detta förbättrade protokoll får vi akut hippocampus skivor från vuxna och åldrande möss som är friska för upp till 10 h efter skivning och är lämpliga för långsiktiga fält-inspelningar och patch-clamp studier.
Det protokoll som beskrivs här visar att hippocampus skivor som erhållits från vuxna och åldrande möss kan förbli friska och livskraftiga i många timmar efter styckning. De skivor som bereds med hjälp av detta protokoll är lämpliga för patch-clamp-inspelningar, samt långvariga fältinspelningar i CA1-regionerna.
Det finns två kritiska steg i det här protokollet. Första steget är transkardialperfusionssteget med en iskall lösning. Snabb clearance av blod signaleras genom snabb …
The authors have nothing to disclose.
Jag tackar Dr Carla J. Shatz för råd och stöd, och Dr Barbara K. Brott och Michelle K. Drews för kritiskt läsa manuskriptet. Arbetet stöds av NIH EY02858 och Mathers Charitable Foundation beviljar CJS.
“60 degree” tool | made in-house | ||
#10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
Agar | Fisher | BP1423-500 | |
Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
CCD camera | Olympus | XM10 | |
Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
Feather blades | Feather | FA-10 | |
Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) – porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
HCl | Fisher | A144SI-212 | |
Ice buckets | |||
KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
Magnetic stirrers and stir bars | |||
Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
Needle 27G1/2 | |||
NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
Paper tape | |||
Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
pH meter | |||
Recovery chamber | in-house made | ||
Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
Spatulas | |||
Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |