Minimera Hypoxi i Hippocampus skivor från vuxna och åldrande möss

Summary

Detta är ett protokoll för akut skiva beredning från vuxna och åldrande mus hippocampi som drar nytta av transkardialaperfusion och skiva skärning med iskall NMDG-aCSF att minska hypoxisk skada på vävnaden. De resulterande skivorna håller sig friska under många timmar, och är lämpliga för långsiktiga patch-clamp och fält-inspelningar.

Abstract

Akut hippocampus skivor har gjort det möjligt generationer av neuroforskare att utforska synaptiska, neuronala, och krets egenskaper i detalj och med hög trohet. Utforskning av LTP och LTD mekanismer, enda neuron dendritic beräkning och erfarenhet-beroende förändringar i kretsar, skulle inte ha varit möjligt utan denna klassiska beredning. Men med några få undantag, de flesta grundläggande forskning med akut hippocampus skivor har utförts med hjälp av skivor från gnagare i relativt unga åldrar, ~ P20-P40, även om synaptiska och inneboende retbarhet mekanismer har en lång utvecklingsstjärt som når förbi P60. Den viktigaste överklagandet av att använda unga hippocampus skivor är bevarande av neuronal hälsa med hjälp av högre tolerans mot hypoxisk skada. Det finns dock ett behov av att förstå neuronal funktion på mer mogna stadier av utveckling, ytterligare accentueras av utvecklingen av olika djurmodeller av neurodegenerativa sjukdomar som kräver en åldrande hjärnan förberedelse. Här beskriver vi en ändring av en akut hippocampus skiva beredning som på ett tillförlitligt sätt levererar friska skivor från vuxna och åldrande mus hippocampi. Protokollets kritiska steg är transkardial perfusion och skärning med iskall natriumfri NMDG-aSCF. Tillsammans dämpar dessa steg den hypoxiinducerade droppen i ATP vid halshuggning, samt cytotoxiskt ödem som orsakas av passiva natriumfluss. Vi visar hur man skär tvärgående skivor av hippocampus plus cortex med hjälp av en vibrerande mikrotom. Akut hippocampus skivor som erhållits på detta sätt är tillförlitligt friska under många timmar av inspelning, och är lämpliga för både fält-inspelningar och riktade patch-clamp inspelningar, inklusive inriktning av fluorescerande märkt nervceller.

Introduction

Tillkomsten av däggdjur akut hjärnan skiva preparat underlättas experiment på cellulär och synaptisk nivå som tidigare var möjligt endast i ryggradslösa preparat som Aplysia¹. Utveckling av akut hippocampus skivor var av särskild betydelse, eftersom det är en struktur som ansvarar för arbetsminne och sammanhang bildning, och har en specialiserad tri-synaptiska kretsar som är mottagliga för lätt fysiologisk manipulation. Emellertid, de allra flesta akut hjärnan skivor är fortfarande beredda från relativt unga möss och råttor, eftersom det är lättare att bevara friska nervceller och kretsar, och skivorna förblir livskraftiga under längre^{tidsperioder 2,3,4}. Här inför vi ändringar i standard skivning protokoll som resulterar i ökad lönsamhet för akut hippocampus skivor från vuxna och åldrande möss.

Det stora hindret för den långsiktiga ex vivo livskraften hos däggdjurshjärnparenkym är den initiala hypoxiska skada som inträffar snabbt när blodflödet till hjärnan slutar efter halshuggning. Förlust av syre resulterar i snabb metabolisk konsumtion av större energiresurser i hjärnan med förlusten av fosfo-kreatin (P-kreatin) är den snabbaste, följt av glukos, adenosintrifosfat (ATP), och glykogen⁴. Bevarande av ATP är av särskild betydelse för den långsiktiga hälsan hos hjärnan skivor, som ATP behövs för att upprätthålla membranet potential via Na-K ATPase, och följaktligen den neurala aktiviteten^5,6. ATP-nivån i den vuxna gnagare hjärnan är ~ 2,5 mM, och det droppar precipitously inom 20 s av halshuggning för att nå en basal steady state (~ 0,5 mM) på cirka 1 min post-halshuggning^4,7,8. Hos unga djur tar det längre tid att observera samma droppe i ATP (~2 min); med fenobarbital anestesi det bromsas ytterligare till 4 min⁴. Dessa överväganden visar att förhindra förlust av ATP och andra energiresurser är en nödvändig strategi för att förhindra hypoxisk skada på hjärnan och i sin tur att upprätthålla hälsan hos hjärnan skivor över längre tidsperioder, särskilt hos vuxna djur.

Låga temperaturer saktar ner ämnesomsättningen. Följaktligen har det visats att blygsam hypotermi skyddar hjärnans energireserver: hos unga djur, sänka kroppstemperaturen med sex grader, från 37 °C till 31 °C, bevarar ATP-nivåer till cirka 80% av normala nivåer över 4 h av kontrollerad hypoxi⁹. P-kreatinhalterna bevaras på liknande sätt, liksom den totala fosforyleringspotentialen⁹. Detta tyder på att sänka kroppstemperaturen före halshuggning kan vara nervskyddande, som nästan normala nivåer av ATP skulle kunna upprätthållas genom skiva styckning och skiva återhämtning perioder.

Till den grad att en ATP-droppe inte helt kan förhindras vid halshuggning förväntas en delvis försämrad funktion av Na-K ATPase, följt av depolarisering via passiv natriumtillströmning. Eftersom den passiva natriumtillströmningen följs av vatteninträde i celler, orsakar det cytotoxiska ödem och så småningom pyknosis. Hos vuxna råttor har det varit en framgångsrik strategi att ersätta Na+ joner med sackaros i skärande lösningar som är en framgångsrik strategi för att lindra bördan av cytotoxiskt^{ödem 10,11}. På senare tid har metylerade organiska katjoner som minskar natrium kanal permeabilitet¹² visat sig erbjuda effektivare skydd än sackaros, särskilt i skivor från vuxna möss, med N-metyl-D-glucamine (NMDG) är mest allmänt tillämpliga i olika åldrar och regioner hjärnan^13,14,15,16.

Många hjärnskärningsprotokoll innebär att man bara använder kalla temperaturer under det skärande steget, ibland i kombination med Na⁺ jonersättningsstrategi^16,17. Hos unga djur, dessa protokoll verkar erbjuda tillräcklig neuroprotektion eftersom hjärnorna kan utvinnas snabbt efter halshuggning eftersom skallen är fortfarande tunn och lätt att ta bort³. Denna strategi producerar dock inte friska skivor från vuxna djur. Med tiden har ett antal laboratorier som studerar vuxna gnagare infört transkard perfusion med en iskall lösning för att minska djurets kroppstemperatur, och därför hypoxisk skada på hjärnan, före halshuggning. Detta förfarande tillämpades framgångsrikt för att producera cerebellar skivor¹⁸, midbrain skivor¹⁹, neokortikala skivor^11,20, perirhinal cortex²¹, råtta hippocampus^10,22,23, luktbulb²⁴, ventral striatum²⁵, visuell cortex²⁶.

Trots de fördelar som erbjuds av transkardial perfusion och Na⁺ jonersättning i att förbereda skivor från råtta och i vissa regioner i hjärnan hos möss, är mus hippocampus fortfarande en av de mest utmanande områden för att skydda från hypoxi^13,20. Hittills innebär en av de vanligaste metoderna för att skära hippocampus från åldrande möss och musmodeller av neurodegeneration den klassiska snabb skivning av den isolerade hippocampi²⁷. I det protokoll som beskrivs här, minimerar vi förlusten av ATP i den vuxna hjärnan genom att införa hypotermi före halshuggning genom transcardially perfusing djuret med iskall Na⁺– fri NMDG-baserade konstgjorda ryggmärgsvätskan (NMDG-aCSF). Skivor skärs sedan i iskall Na⁺-fri NMDG-aCSF. Med detta förbättrade protokoll får vi akut hippocampus skivor från vuxna och åldrande möss som är friska för upp till 10 h efter skivning och är lämpliga för långsiktiga fält-inspelningar och patch-clamp studier.

Protocol

Protokollet utförs i enlighet med Handledning för vård och användning av laboratoriedjur vid National Institutes of Health och godkänts av Stanford University Institutions Institutions Care and Use Committee. Metoder är också i enlighet med den politik som förs av Society for Neuroscience om användning av djur och människor i neurovetenskap forskning. OBS: Alla möss bibehölls i en patogenfri miljö. Här användes möss av vildtyp på blandad C57Bl/ 6 x SV/ 129J genetisk bakgrund, …

Representative Results

Vi tillämpade ovanstående protokoll för att generera hippocampus skivor från CamKIIa-Cre +; WT-möss på en blandad genetisk bakgrund C57Bl/ 6 x SV/ 129J, vid P > 120. Stort antal pyramidceller i CA1-fältet (Figur 2A) och subiculum (Bild 2B) förekommer i låg kontrast när de observeras under infraröd differentialkontrastmikroskopi (IR-DIC), ett kännetecken för friska celler i en skiva beredning. Med denna beredning, en hög hastighet av giga-ohm tätni…

Discussion

Det protokoll som beskrivs här visar att hippocampus skivor som erhållits från vuxna och åldrande möss kan förbli friska och livskraftiga i många timmar efter styckning. De skivor som bereds med hjälp av detta protokoll är lämpliga för patch-clamp-inspelningar, samt långvariga fältinspelningar i CA1-regionerna.

Det finns två kritiska steg i det här protokollet. Första steget är transkardialperfusionssteget med en iskall lösning. Snabb clearance av blod signaleras genom snabb …

Materials

“60 degree” tool	made in-house
#10 scalpel blade	Bard-Parker (Aspen Surgical)	371110
1M CaCl2	Fluka Analytical	21114
95%O2/5%CO2	Praxiar or another local supplier
Acepromazine maleate (AceproJect)	Henry Schein	5700850
Agar	Fisher	BP1423-500
Beakers, measuring cylinders, reagent bottles
Brushes size 00-2	Ted Pella		Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.
CCD camera	Olympus	XM10
Choline bicarbonate	Pfalz & Bauer	C21240
Cyanoacrilate glue	Krazy glue		Singles
Decapitation scissors	FST	14130-17
Feather blades	Feather	FA-10
Filter paper #2	Whatman		Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.
Forceps	A. Dumont & Fils	Inox 3c
Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) – porosity 3	Robuglas.com	18103 or 18113	Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HCl	Fisher	A144SI-212
Ice buckets
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Ketamine HCl (KetaVed)	VEDCO	NDC 50989-996-06
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662
Leica Tissue slicer VT1000S			The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2
Magnetic stirrers and stir bars
Mg2SO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	230391
MgCl2	Sigma-Aldrich	M9272
MilliQ water machine	Millipore		Source for 18 Mohm water
Na-ascorbate	Sigma-Aldrich	A4035
Na-pyruvate	Sigma-Aldrich	P8574
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NaHCO3	EMD	SX0320-1
Needle 27G1/2
NMDG	Sigma-Aldrich	M2004
Paper tape
Peristaltic pump	Cole-Parmer	#7553-70
Peristaltic pump head	Cole-Parmer	Masterflex #7518-00
Personna blades		Personna double edge	Amazon
pH meter
Recovery chamber	in-house made
Scalpel blade handle size 3	Bard-Parker (Aspen Surgical)	371030
Scissors angled blade	FST	14081-09
Single edge industrial razor blade #9	VWR	55411
Spatulas
Transfer pipettes	Samco Scientific	225
Upright microscope	Olympus BX51WI
Xylazine HCl (XylaMed)	VetOne	510650