Summary
La réponse aux dommages causés par l’ADN par rayonnement activé par le faisceau mixte de neutrons utilisé dans la thérapie de capture de neutrons de bore (BNCT) n’a pas été entièrement établie. Ce protocole fournit une procédure étape par étape pour détecter les foyers induits par rayonnement (RIF) des protéines de réparation par la coloration d’immunofluorescence dans les lignées cellulaires du cancer du côlon humain après irradiation avec le faisceau mélangé à neutrons.
Abstract
Le but du manuscrit est de fournir un protocole étape par étape pour l’exécution de la microscopie d’immunofluorescence pour étudier la réponse de dommages causés par l’ADN induit par le rayonnement induit par neutron-gamma faisceau mixte utilisé dans la thérapie de capture de neutrons de bore (BNCT). Plus précisément, la méthodologie proposée est appliquée pour la détection de l’activation des protéines de réparation qui peuvent être visualisées comme des foyers à l’aide d’anticorps spécifiques aux ruptures à double brin d’ADN (ADN-DSB). Les foyers de réparation d’ADN ont été évalués par immunofluorescence dans les cellules cancéreuses du côlon (HCT-116) après irradiation avec le faisceau neutronique. Les ADN-DSB sont les lésions les plus génotoxiques et sont réparées dans les cellules de mammifères par deux voies principales : la voie de jointure des terminaisons non homologues (NHEJ) et la réparation de recombinaison homologue (HRR). Les fréquences des foyers, tachés immunochimiquement, pour les marqueurs couramment utilisés en radiobiologie comme γ-H2AX, 53BP1 sont associées au numéro DNA-DSB et sont considérées comme des marqueurs efficaces et sensibles pour surveiller l’induction et la réparation des ADN-DSB. Il a été établi que les foyers γ-H2AX attirent les protéines de réparation, ce qui entraîne une concentration plus élevée de facteurs de réparation près d’un DSB. Pour surveiller les dommages causés par l’ADN au niveau cellulaire, l’analyse de l’immunofluorescence pour la présence de foyers protéiques de réparation représentatifs de l’ADN-PKcs provenant de la voie NHEJ et de Rad52 de la voie HRR a été prévue. Nous avons développé et introduit un protocole fiable de coloration d’immunofluorescence pour la détection de la réponse de dommages d’ADN induite par le rayonnement avec des anticorps spécifiques aux facteurs de réparation des voies de NHEJ et de HRR et des foyers induits par rayonnement (RIF). La méthodologie proposée peut être utilisée pour étudier les protéines de réparation qui sont fortement activées dans le cas du rayonnement de faisceau de neutrons-mélangé, indiquant ainsi la dominance de la voie de réparation.
Introduction
La réponse aux dommages causés par rayonnement de dommages d’ADN activé par le faisceau mixte de neutrons employé dans la thérapie de capture de neutron de bore (BNCT) n’a pas été entièrement déterminée. Ce protocole fournit une procédure étape par étape pour effectuer la détection des foyers induits par rayonnement (RIF) des protéines de réparation par la coloration d’immunofluorescence par exemple, dans la lignée cellulaire du côlon humain après irradiation avec le faisceau mélangé à neutrons.
Le rayonnement ionisant (IR) induit une multitude de différents types de dommages à l’ADN (ADN-DSB, ADN-SSBs, dommages de base d’ADN) dont les ruptures de double brin d’ADN sont les lésions d’ADN les plus génotoxiques1. Les ruptures non réparées peuvent causer la mort cellulaire, tandis que les ruptures mal réparées augmentent la probabilité de réarrangement chromosomique, de mutagénèse et de perte d’informations génétiques décisives. Les voies de réponse aux dommages répondant aux DSB comprennent des voies de réparation de l’ADN comme l’assemblage final non homologue (NHEJ), un mécanisme qui nécessite Ku 70/80, ADN–PKcs, Xrcc4, et ligase IV d’ADN comme facteurs clés2,3,4,5,6. Chez les mammifères, la deuxième voie principale de réparation de l’ADN est la voie de réparation de recombinaison homologue (HRR) qui nécessite des composants clés - la famille de gènes d’épistase Rad52 – Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 et Rad587. Rad51 et Rad54 sont des facteurs clés de recombinaison humaine impliqués dans les mécanismes de réparation liés au stress de réplication et aux ruptures d’ADN dans les eucaryotes. Fait intéressant, il a été observé que la downregulation de la voie HRR améliore la voie NHEJ qui est sujette aux erreurs pointant vers la pertinence de la voie RH pour la stabilité du génome8.
La première étape de la formation de DSBs est la phosphorylation de l’histone γ-H2AX à Ser-139 par Ataxia telangiectasia muté kinase (ATM) de la famille PI3 kinase7,8. Fait intéressant, la phosphorylation H2AX peut être visualisée facilement par la technique d’immunofluorescence comme foyers (γ-H2AX foyers) à l’aide d’anticorps spécifiques pour le H2AX6phosphorylé. Il ya une relation 1:1 entre le nombre de DSBs et γ-H2AX foyers, par conséquent, marqueur DSB, γ-H2AX, est étudié en profondeur par la caractérisation de la formation de foyers, la taille, et la quantité6,7,8,9,10,11. La formation de foyers γ-H2AX conduit au recrutement et à l’accumulation de protéines de réponse aux dommages à l’ADN (DDR) et de facteurs modificateurs de la chromatine, tels que 53BP1 (protéine liante p53 1), MDC1 (médiateur du point de contrôle des dommages causés par l’ADN), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1, et bien d’autres facteurs de réparation formant ainsi des foyers induits par les radiations (RIF). Toutes ces protéines co-localisent avec γ-H2AX par liaison directe ou indirecte1,11,12.
Il est important de détecter les dommages à l’ADN et de réparer avec un test sensible approprié, par conséquent, plus d’attention est accordée au développement de techniques très précises13. Dans le contexte des études sur les dommages à l’ADN et les réparations, la méthodologie est cruciale pour la détection sensible des dommages causés par l’ADN du génome, la description de la catégorie des dommages et la quantification des dommages à l’ADN et les mécanismes de réparation13. Pour détecter les cellules individuelles avec l’ADN endommagé, l’essai de comète est couramment utilisé dans les études radiobiologiques14. D’autres méthodes cytogénétiques disponibles reconnaissent les aberrations chromosomiques, y compris les dicentriques, les translocations, les fragments acentriques, les anneaux et les aberrations de type chromatid, et les dommages chromosomiques de micronucléus (Mn). La méthode la plus fréquemment utilisée en radiobiologie, en particulier dans la dosimétrie biologique, est l’essai chromosomique dicentrique en raison de sa grande spécificité pour le rayonnement15. Par exemple, pcr, une méthode moléculaire classique, ne peut pas reconnaître le type de dommages détectés à l’ADN. Dans ce cas, les méthodes immunométriques passent le niveau de sensibilité parce que les réactions sont spécifiques entre l’antigène et l’anticorps. L’imagerie par immunofluorescence fournit des preuves visuelles de l’apparition de différentes protéines dans des foyers distincts en réponse à des agents nuisibles à l’ADN comme le rayonnement ionisant16. Cependant, les niveaux d’activation des dommages et les niveaux d’ARNm des protéines de réparation sont facilement détectables par PCR en temps réel qui est une méthode quantitative appropriée pour d’autres études moléculaires dans le contexte de la réponse de dommages d’ADN17.
Compte tenu du fait que les foyers γ-H2AX attirent les facteurs de réparation18, pour surveiller les dommages à l’ADN et réparer au niveau cellulaire, nous avons développé une procédure fiable de coloration d’immunofluorescence, basée sur l’analyse des foyers de protéine de réparation représentatifs de la voie NHEJ (ADN-PKcs) et Rad52 de la voie HRR.
Ici, nous proposons l’utilisation de l’immunodétection pour ces protéines comme procédure efficace et sensible pour la surveillance de l’induction et de la réparation de l’ADN-DSB. Jusqu’à présent, il n’y avait pas de données disponibles sur les ADN-DSB basées sur des foyers de protéines de réparation au niveau cellulaire après l’irradiation à faisceau mixte de neutrons pour BNCT, à l’exception des marqueurs γ-H2AX et 53BP119. Nous suggérons l’adaptation de la ligne de cellules cancéreuses du côlon HCT-116, car elle est elle-même riche en foyers DSBs, comme une ligne cellulaire standard pour l’analyse des dommages de l’ADN, parce que les RIF sont facilement détectables. Cette lignée cellulaire adhérente est facile à entretenir et appropriée pour les procédures d’irradiation. La procédure proposée est basée sur une énorme quantité d’études antérieures liées à la procédure générale d’immunofluorescence de la coloration γ-H2AX. Cependant, il comprend tous les détails concernant la sélection d’anticorps appropriés avec des dilutions testées pour chaque protéine représentative appartenant à chaque voie de réparation. En outre, il décrit l’utilisation d’un faisceau unique à neutrons mélangé utilisé dans la thérapie BNCT. Cependant, nous recommandons d’étendre les études avec les deux méthodes, l’immunofluorescence coloration d’abord, puis, avec une analyse moléculaire à coût élevé comme effectué précédemment4,17.
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Protocol
1. Préparation de la culture cellulaire et de l’installation expérimentale
- Maintenir les cellules cancéreuses du côlon humaines, HCT-116 comme recommandé par le fournisseur, dans les monocouches dans 75 cm2 flacons de culture contenant 10 ml de McCoy 5a Medium Modifié, complété par 10% de sérum fœtal bovin et 1% antibiotique solution antimycotique.
- Cultiver des cellules dans un environnement humidifié de CO2 à 37 °C jusqu’à 70 % de la confluence avec un renouvellement moyen tous les 2 à 3 jours.
- Pour obtenir le faisceau BNCT (p. ex., faisceau de neutrons plus 10BPA) et l’effet BNCT de tuer les cellules cancéreuses sous forme de particules lourdes et déposer la majeure partie de leur énergie dans les cellules cancéreuses contenant du bore, la veille de l’irradiation, ajouter l’agent de livraison de bore au milieu de culture cellulaire – par exemple, 10BPA, 4-Borono-L-phenylalanine (10 μg 10B/mL, 0,925 mM final) 12–16 h (absorption maximale de bore) avant l’irradiation, comme précédemment étudié pour les cellules cancéreuses du côlon et les cellules cancéreuses thyroïdiennes20,21.
REMARQUE : Si vous utilisez une autre lignée cellulaire, pour laquelle il n’existe pas de données dans le cas de l’étude BNCT, testez l’absorption du bore pour chaque lignée cellulaire afin d’obtenir une concentration optimale de bore. Mesurer l’absorption cellulaire de 10BPA par spectroscopie optique d’émission optique de plasma (ICP-OES) couplée indutivement comme réalisée par le groupe Dagrosa21. - Après 12-16 h de livraison de bore, apirate le milieu et laver les cellules avec 10 mL de 1x PBS. Ensuite, essayez de résoudre les cellules en ajoutant 2 mL de solution Trypsin-EDTA aux cellules et incuber pendant 5 min à 37 °C pour améliorer le détachement cellulaire. Lorsque les cellules commencent à se détacher, arrêtez l’action de trypsin en ajoutant 10 mL de milieu complet.
- Apirate la suspension cellulaire dans le tube de 15 ml et compter les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé en ajoutant 10 μL de 0,4% de bleu trypan à 10 μL de cellules, mélanger, et aliquote 10 μL sur une diapositive de comptage. Diluer la suspension cellulaire à une concentration de 1 x 106 cellules/mL du milieu. Aliquot 1 mL de la suspension cellulaire par cryotube.
- Préparer des dosimètres thermoluminescents (TLD) pour la mesure des doses de rayons gamma et des feuilles d’or pour les fluences neutroniques et attacher des TLD aux cryotubes ou à la fiole de culture cellulaire avant l’irradiation.
- Irradier les 1 x 106 cellules/mL avec le faisceau mélangé à neutrons au flux minimal de neutrons thermiques recommandé de 5,9 x 1011 (n/cm-2 min−1)4 dans les flacons de culture ou les cryotubes selon les capacités de l’installation.
REMARQUE : Définissez l’heure de l’irradiation avant d’obtenir le flux de neutrons recommandé. - Après irradiation, la graine 1 mL de cellules irradiées (1 x 106 cellules/mL) sur 22 couvercles de 22 mm dans des boîtes de Pétri de 35 mm ou 6 assiettes de puits, compléter avec 2 mL de milieu requis. Incuber les cellules pour un maximum de 3 h à 37 °C dans un environnement humidifié de 5 % de CO2 pour les laisser attacher aux couvercles. Observez l’attachement des cellules de temps en temps sous un microscope inversé avec objectif 20x.
REMARQUE : Pour les cellules HCT-116, la densité minimale est de 600 000 cellules à semer. Pour une procédure de coloration rapide, utilisez des lames de chambre, réduisez la densité cellulaire en conséquence.
2. Fixation des cellules
- Après l’irradiation et l’incubation des cellules, retirer le milieu des cellules attachées et laver les cellules une fois avec 2,5 mL de PBS.
- Fixer les cellules avec 1 mL de 70% d’éthanol pendant 10 min à RT.
REMARQUE : Utilisez alternativement 1 %-3,7 % de paraformaldéhyde (PFA) pour la fixation comme recommandé précédemment19. Le protocole est en pause ici. Conserver les cellules fixes dans l’éthanol dans un congélateur à -20 °C pendant au plus quelques semaines pour une analyse plus poussée et une coloration immunofluorescence.
3. Perméabilisation des cellules
- Après fixation retirer l’éthanol de la boîte de Pétri et laver avec 2,5 mL de 1x PBS.
REMARQUE : Ne laissez pas les cellules sécher entre les étapes de rinçage. - Ajouter délicatement 1 mL de 0,2 % de Triton X-100/PBS pour couvrir les couvercles avec des cellules dans les boîtes de Pétri.
- Incuber pendant 5 min à RT.
- Laver les cellules 3x avec 2,5 mL de 1x PBS.
REMARQUE : Augmentez le pourcentage de Triton X-100 dans PBS jusqu’à 0,5 % si nécessaire (plus de foyers détectables, dépendant de la ligne cellulaire testée). Effectuez des lavages supplémentaires avec PBST (PBS avec 0,5% d’interpolation) pour éviter la liaison non spécifique. - Étape de perméabilisation de bloc avec 1 mL de 2% BSA (Albumine de fraction de sérum de bovins V) dilué dans PBS et incuber pendant un minimum de 30 min ou 1 h avec 1% BSA.
REMARQUE : Cette étape peut être omise et dépend du type d’anticorps utilisé. Alternativement, utilisez 5% FBS comme recommandé dans ref4.
4. Coloration d’immunofluorescence
- Ajouter la quantité appropriée d’anticorps primaire (Anti-H2AX, Anti-ADN-PKcs et Anti-Rad52) dilués dans pbs avec BSA (2% De fraction de sérum bovin V albumine) comme recommandé (voir le tableau 1 avec dilutions recommandées) (100 μL est nécessaire par échantillon).
| Anticorps primaire | Fonction | Dilution recommandée | stockage [°C] |
| Anti-H2AX | détection des ADN-DSB | 1:1000 (PBS-BSA) | 4 |
| Anti-ADN-PKcs | détection des RIF de la protéine ADN-PKcs appartenant à la NHEJ | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Anti-Rad52 | détection des RIF de protéine Rad52 appartenant à HRR | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Anticorps secondaire | Dans le noir | ||
| anti-souris IgG FITC | 1-H2AX foyers | 1:400 (PBS-BSA) | 4 |
| Chèvre Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | pour NHEJ et HRR réparer les protéines foci | 1:500 (PBS-BSA) | -20 |
Tableau 1 : Dilutions et notes recommandées pour l’utilisation des anticorps utilisés à la section 4.
- Couvrir la boîte de Pétri pour maintenir l’humidité dans une boîte en plastique avec de la lignine hydratée à l’aide d’eau distillée et incuber pendant 30 min à 37 °C dans l’incubateur.
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. L’incubation peut être effectuée à 4 °C pour la nuit. - Après incubation effectuer 3 lavages avec 2,5 mL de PBS.
REMARQUE : Ne laissez pas sécher la lame pendant les étapes de rinçage. - Ajouter la quantité appropriée d’anticorps secondaires (Anti-souris IgG FITC, Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 488) dilué dans PBS avec BSA (voir le tableau 1) (100 μL est nécessaire par échantillon). Pour cela et les étapes suivantes fonctionnent dans l’obscurité.
- Couvrir à nouveau la boîte De Petri pour maintenir l’humidité dans une boîte en plastique avec de la lignine hydratée et incuber pendant 30 min minimum à 37 °C dans l’incubateur.
- Après incubation effectuer 3 lavages avec 2,5 mL de PBS.
- Ajouter 100 μL de DAPI dilué dans pbs à une concentration finale de 1 μg/mL pour contrer les noyaux.
- Incuber sous peu, pour un maximum de 2 min à RT.
- Après incubation effectuer 3 lavages avec 2,5 mL de PBS.
- Retirez le PBS et placez doucement un couvercle sur le dessus du support de montage, en évitant la formation de bulles d’air et sceller les bords du couvercle avec du vernis à ongles. Attendez que le vernis sèche et peigne le couvercle autour.
- Attendez le durcissement du milieu de montage (jusqu’à 3 h) avant l’analyse de l’image sous microscopie de fluorescence.
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Conserver les lames de verre dans une boîte en plastique à 4 °C dans l’obscurité.
5. Acquisition et analyse d’images
- Acquérir des images avec un microscope à fluorescence sous objectif 100x avec de l’huile d’immersion.
- Analyser les foyers dans les noyaux à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé des filtres suivants pour : Alexa Fluor 488 : excitation/émission (nm) : 496/519, couleur d’émission vert; DAPI : excitation/émission (nm) : 358/461, couleur d’émission bleu.
REMARQUE : L’analyse des DSB le long des pistes à particules uniques peut nécessiter une microscopie avancée comme la microscopie à balayage laser confocal avec une résolution plus élevée.
- Analyser les foyers dans les noyaux à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé des filtres suivants pour : Alexa Fluor 488 : excitation/émission (nm) : 496/519, couleur d’émission vert; DAPI : excitation/émission (nm) : 358/461, couleur d’émission bleu.
- Enregistrez les images acquises et le processus avec un logiciel d’imagerie approprié, par exemple, ImageJ ou Image Pro3,20.
REMARQUE : L’utilisation de macros et de plugins individuels développés pour l’analyse automatique ou le développement/achat de logiciels bioinformatiques individuels est recommandée. - Si vous utilisez le logiciel Image-Pro pour l’analyse des foyers, traitez des images dans des fichiers TIFF : sélectionnez Bouton Compte/Taille, puis cliquez sur Types [choisissez le type de mesure (par exemple, diamètre ou zone)], cliquez sur Plages [plage définie de la mesure], cliquez sur Fractionner les objets si nécessaire. Pour ajuster la luminosité, cliquez sur Lumineux [ajuster treshold]. Cliquez ensuite sur Compter [bouton rouge].
- Pour exporter des données, cliquez sur Tableau de données | Statistiques | Exporter vers Excel. Dans le logiciel de feuille de calcul, dessinez des graphiques avec l’analyse statistique requise.
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Representative Results
Tout d’abord, nous avons effectué une analyse d’un marqueur standard de détection de l’ADN-DSB, γH2AX foyers dans les cellules cancéreuses du côlon, non rayonné, et irradié avec le faisceau mélangé à neutrons. les foyers γ-H2AX apparaissent sous forme de points fluorescents distincts et montrent la formation d’ADN-DSB (car chaque point fluorescent γ-H2AX représente un seul DSB) (voir la figure 1).
Figure 1 : Images représentatives des modèles de foyers γ-H2AX dans les cellules cancéreuses du côlon de la lignée cellulaire HCT-116 (sans rayonnement) et après irradiation de faisceau mixte à neutrons. L’irradiation de faisceau neutronique a été effectuée à une dose de 2,6 Gy dans les cellules traitées la veille avec du BPA (N+BPA). (A) Le panneau gauche représente la coloration DAPI des noyaux. Le panneau droit, les foyers verts (Alexa 488), correspond à l’immunodétéction de γ-H2AX. La flèche jaune indique la trajectoire de la particule α traversant le noyau (barre d’échelle = 10 μm). (B) Diagrammes représentatifs illustrant l’augmentation observée de la taille des foyers induits par radio. La moyenne du diamètre des foyers γ-H2AX a été réalisée automatiquement par le logiciel Image-Pro. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Fait intéressant, dans les cellules irradiées avec le faisceau à neutrons (N+BPA) à une dose d’environ 2,6 Gy (1,33 Gy (γ) + 1,26 Gy (N)), nous avons observé des niveaux de diamètre plus élevés de γ-H2AX foyers (Figure 1B). En outre, une seule piste de particule LET α élevée a été détectée (en raison de la réaction nucléaire BNCT) traversant les noyaux de la cellule (flèche jaune) (Figure 1A). Différents types de rayonnement pourraient causer des effets différents : plus le rayonnement LET est élevé, plus l’ADN-DSB est complexe, plus les foyers γ-H2AX sont élevés et plus les niveaux de surface des protéines de réparation visibles sous forme de foyers induits par les radiations18sont élevés.
Par conséquent, nous avons testé des niveaux de protéines de réparation représentatives de l’ADN-PKcs (de la voie de réparation NHEJ) et Rad52 (de la voie hr) par microscopie d’immunofluorescence dans les mêmes conditions, qui n’a pas été effectuée auparavant dans le cas du faisceau de BNCT. Nous avons pu détecter la valeur moyenne élevée du diamètre des foyers de l’ADN-PKCs lors des ruptures d’ADN après un mélange de neutrons par rapport aux cellules témoins (pas de rayonnement) (voir la figure 2).
Figure 2 : Images représentatives des modèles d’ADN-PKcs et de foyers de réparation de Rad52 dans les cellules cancéreuses du côlon de la lignée cellulaire HCT-116 (sans rayonnement) et après irradiation de faisceau mixte de neutrons. L’irradiation de faisceau neutronique a été effectuée à une dose de 2,6 Gy dans les cellules traitées la veille avec du BPA (N+BPA). (A) Le panneau gauche représente la coloration DAPI des noyaux. Le panneau central représente la détection des foyers induits par les radiations. Le panneau de droite est l’image fusionnée. (B) Diagrammes représentatifs illustrant l’augmentation observée de la taille des foyers induits par radio. La moyenne de Rad52 et d’ADN-PKcs diamètre foci a été effectuée automatiquement à l’aide du logiciel d’analyse d’image. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Dans ce cas, nous avons observé des ADN-DSB regroupés dans des cellules irradiées HCT-116 par le faisceau mélangé à des neutrons car l’ADN-PKcs est spécifique pour les foyers plus complexes. Dans les cellules irradiées, par faisceau mixte de neutrons, ces foyers n’ont été observés qu’à l’intérieur du noyau cellulaire comme étant plus complexes, plus grands et regroupés avec une intensité plus élevée (Figure 2A,B). Dans le cas de Rad52, l’effet n’était pas aussi fort que pour l’ADN-PKcs, ce qui indique la dominance de la voie NHEJ dans ce type de rayonnement. En outre, d’après les données de la littérature, les DSB complexes sont lentement réparés et les ADN-PKcs ne sont recrutés que dans des DSB complexes à plus longue durée de vie, ce qui indique que le faisceau mixte à neutrons mène à la formation de DSB complexes et à la réparation par l’ADN-PKcs, cependant, d’autres recherches sont nécessaires au niveau moléculaire pour confirmer ces résultats précédemment obtenus22.
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Discussion
Les fréquences des foyers, immunochimiquement tachées pour γ-H2AX et 53BP1 sont couramment utilisées en radiobiologie et sont associées au numéro DNA-DSB et sont considérées comme des marqueurs efficaces et sensibles pour la surveillance de l’induction et de la réparation des ADN-DSB19. La procédure de co-coloration de γ-H2AX et 53BP1 est une procédure standard pour la détection de l’ADN-DSB. Formation de γ-H2AX foyers est associée au recrutement de 53BP1, un régulateur de la réponse de dommages à l’ADN23. Toutefois, différentes lignées cellulaires peuvent varier dans les niveaux d’arrière-plan de γ-H2AX /53BP1 foyers 11. Il a été démontré que les foyers γ-H2AX attirent les facteurs de réparation18,accumulant une concentration plus élevée de protéines de réparation à proximité d’un site d’ORD. Plus l’ADN-DSB est complexe, plus les foyers γ-H2AX sont élevés et plus les niveaux de protéines de réparation sont élevés. Il active une cascade de voies de réparation, si les facteurs de réparation s’accumulent dans une concentration plus élevée dans un site d’ORD, ils sont facilement détectables à l’aide d’anticorps spécifiques et le protocole proposé leur permet d’être visualisés facilement. Ici, nous démontrons une méthodologie pour étudier les effets biologiques au niveau cellulaire pour la thérapie BNCT l’impact du faisceau neutronique sur la réparation de l’ADN en utilisant la technique d’immunofluorescence dans les cellules cancéreuses du côlon humain. Les auteurs ont développé et introduit un protocole fiable étape par étape avec des anticorps spécifiques pour détecter les voies de réparation de l’ADN basées sur la coloration immunofluorescente avec un anticorps spécifique pour les facteurs de réparation de la voie NHEJ et HRR et des foyers induits par rayonnement observés (RIF). En outre, les auteurs proposent l’utilisation de la ligne de cellules cancéreuses du côlon HCT-116 comme ligne cellulaire standard pour l’analyse des dommages causés par l’ADN et comme ligne cellulaire de contrôle pour le test des anticorps de réparation de l’ADN parce que cette lignée cellulaire est elle-même riche en foyers DSBs. L’ADN-DSBs sont facilement détectables, et différentes lignées cellulaires, en particulier les cellules cancéreuses comme la lignée cellulaire cervicale représentent différents niveaux de fond de foyers H2AX, et l’intensité24.
Il y a deux étapes critiques majeures dans le protocole, la fixation des cellules, et la procédure d’immunostaining. Les auteurs recommandent la fixation des cellules dans 70% d’éthanol car il préserve les cellules pendant une longue période, et il est incubé dans le congélateur pas plus de quelques semaines. En outre, cette étape est critique, car cela peut être point de pause après la procédure d’irradiation est effectuée par exemple, dans une autre institution / bâtiment / un autre jour. Une autre étape critique est la bonne concentration de l’anticorps. Les auteurs ont joint dans le tableau les concentrations testées d’anticorps primaires et secondaires.
La procédure présentée fournit un protocole étape par étape pour obtenir des résultats fiables, cependant, certains paramètres pourraient changer les résultats des expériences, comme le bon choix des anticorps utilisés, différents réactifs utilisés pour les étapes de fixation et de perméabilisation, le temps des incubations, le pourcentage critique de réactifs, les étapes de lavage, le travail dans l’obscurité, et le microscope fluorescent approprié. Les auteurs expliquent comment obtenir des résultats fiables et répétables dans les notes.
Une limitation mineure de cette technique est d’avoir accès à la source de rayonnement comme la source de neutrons, cependant, le protocole peut être utilisé comme un protocole général pour la détection des voies de réparation de l’ADN obtenus après différents types de rayonnement et peut être traité comme un protocole universel pour divers types de rayonnement, par exemple, la comparaison de faible LET et de haute-LET de réparation des voies de réparation.
Nous fournissons une méthodologie universelle et prête à l’emploi qui peut être utilisée au niveau cellulaire pour analyser les effets biologiques dans le contexte de la thérapie BNCT. Dans BNCT, le bore-10 non radioactif (par exemple, après traitement avec 4-Borono-L-phenylalanine, BPA – agent de livraison de bore) est irradié avec des neutrons thermiques à faible énergie et à la suite de la réaction nucléaire particules alpha et lithium-7 noyaux avec le LET élevé sont produites25,26. Par conséquent, notre protocole peut être utile pour l’analyse des effets biologiques au niveau cellulaire aussi pour le rayonnement représenté par d’autres faisceaux let élevés comme les protons utilisés dans la thérapie par faisceau de protons27, et les ions de carbone utilisés dans la thérapie hadron28. Nous avons observé que des recherches plus détaillées sont nécessaires dans le domaine des rayonnements à haut-LET et des faisceaux mixtes, et la connaissance du processus de réparation de l’ADN est nécessaire pour développer des thérapies efficaces anti-cancer, par conséquent, nous avons développé un protocole qui permet la recherche de la réponse de dommages causés par le rayonnement de l’ADN activé par le faisceau de neutrons mélangés. En outre, la méthode d’immunofluorescence de détection de la réponse de dommages d’ADN et de réparation d’ADN pourrait être une méthode potentielle pour évaluer et détecter des tumeurs.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Le faisceau mixte à neutrons composé de rayonnement neutronique/gamma a été accessible à partir du réacteur de recherche Maria du Centre national de recherche nucléaire en Pologne. K.M.O. a reçu le soutien du Centre national des sciences, Pologne (Miniatura 2) au n° #2018/02/X/NZ5/02849.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
References
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