Summary
Strålingsindusert DNA-skaderespons aktivert av nøytron blandet stråle som brukes i bor nøytronfangstbehandling (BNCT) er ikke fullt etablert. Denne protokollen gir en trinnvis prosedyre for å oppdage strålingsindusert foci (RIF) av reparasjonsproteiner ved immunofluorescensfarging i humane tykktarmskreftcellelinjer etter bestråling med nøytronblandet stråle.
Abstract
Formålet med manuskriptet er å gi en trinnvis protokoll for å utføre immunofluorescensmikroskopi for å studere strålingsindusert DNA-skaderespons indusert av nøytron-gamma blandet stråle som brukes i borron nøytronfangstterapi (BNCT). Spesielt brukes den foreslåtte metodikken for påvisning av reparasjonsproteiner aktivering som kan visualiseres som foci ved hjelp av antistoffer som er spesifikke for DNA dobbelttrådpauser (DNA-DSB). DNA reparasjon foci ble vurdert av immunofluorescens i tykktarmskreftceller (HCT-116) etter bestråling med nøytron-blandet stråle. DNA-DSB er de mest gentoksiske lesjonene og repareres i pattedyrceller ved to hovedveier: ikke-homologende end-joining pathway (NHEJ) og homolog rekombinasjon reparasjon (HRR). Frekvensene av foci, immunkjemisk farget, for vanlig brukte markører i radiobiologi som γ-H2AX, 53BP1 er forbundet med DNA-DSB-nummer og anses som effektive og følsomme markører for overvåking av induksjon og reparasjon av DNA-DSB. Det ble fastslått at γ-H2AX foci tiltrekke reparasjon proteiner, noe som fører til en høyere konsentrasjon av reparasjonsfaktorer i nærheten av en DSB. For å overvåke DNA-skader på cellenivå, ble immunofluorescensanalyse for tilstedeværelse av DNA-PKcs representant reparasjon protein foci fra NHEJ banen og Rad52 fra HRR banen planlagt. Vi har utviklet og introdusert en pålitelig immunofluorescensfargingsprotokoll for påvisning av strålingsindusert DNA-skaderespons med antistoffer som er spesifikke for reparasjonsfaktorer fra NHEJ- og HRR-veier og observert strålingsindusert foci (RIF). Den foreslåtte metodikken kan brukes til å undersøke reparasjonsprotein som er sterkt aktivert i tilfelle nøytron-blandet strålestråling, og indikerer dermed dominansen av reparasjonsveien.
Introduction
Strålingsindusert DNA-skaderespons aktivert av nøytron blandet stråle som brukes i bor nøytronfangstbehandling (BNCT) er ikke fullstendig bestemt. Denne protokollen gir en trinnvis prosedyre for å utføre påvisning av strålingsindusert foci (RIF) av reparasjonsproteiner ved immunofluorescensfarging, f.eks.
Ioniserende stråling (IR) induserer en rekke forskjellige typer DNA-skader (DNA-DSBs, DNA-SSBs, DNA base skade) hvorav DNA dobbel-strand pauser er de mest gentoksiske DNA lesjoner1. Ureparerte pauser kan forårsake celledød, mens feilparerte pauser øker sannsynligheten for kromosom omorganisering, mutagenese og tap av avgjørende genetisk informasjon. Skaderesponsbanene som reagerer på DSBs inkluderer veier av DNA-reparasjon som ikke-homolog sluttkobling (NHEJ), en mekanisme som krever Ku 70/80, DNA-PKcs, Xrcc4 og DNA ligase IV som viktige faktorer2,,3,4,5,6. Hos pattedyr er den andre viktigste DNA-reparasjonsveien homolog rekombinasjonsreparasjon (HRR) som krever viktige komponenter - Genfamilien Rad52 epistase– Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 og Rad587. Rad51 og Rad54 er viktige menneskelige rekombinasjonsfaktorer involvert i reparasjonsmekanismer knyttet til replikeringsstress og DNA-brudd i eukaryoter. Interessant, ble det observert at nedregulering av HRR banen forbedrer NHEJ banen som er feilutsatt peker på HR pathway relevans for genom stabilitet8.
Det første trinnet i DSBs dannelse er fosforylering av γ-H2AX histone på Ser-139 av Ataxia telangiectasia mutert kinase (ATM) fra PI3 kinase familie7,8. Interessant, H2AX fosforylering kan visualiseres lett ved immunofluorescens teknikk som foci (γ-H2AX foci) ved hjelp av antistoffer som er spesifikke for fosforylerte H2AX6. Det er en 1:1 forhold mellom antall DSBs og γ-H2AX foci, derfor DSB markør, γ-H2AX, studeres mye gjennom karakterisering av foci dannelse, størrelse, og kvantitet6,,7,8,9,10,11. Dannelse av γ-H2AX foci fører til rekruttering og akkumulering av DNA skade respons (DDR) proteiner og kromatin-modifiserende faktorer, slik som 53BP1 (p53 bindende protein 1), MDC1 (mediator av DNA skade sjekkpunkt), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1, og mange andre reparere faktorer dermed danner stråling-indusert foci (RIF). Alle disse proteinene samtidig lokaliseres med γ-H2AX gjennom direkte eller indirekte binding1,,11,,12.
Det er viktig å oppdage DNA-skade og reparasjon med en skikkelig sensitiv test, derfor er det mer oppmerksomhet til utviklingen av svært presiseteknikker 13. I forbindelse med DNA-skader og reparasjonsstudier er metodikken avgjørende for sensitiv påvisning av genom-DNA-skade, beskrivelse av skadekategori og kvantifisering av DNA-skade- og reparasjonsmekanismer13. For å oppdage enkeltceller med skadet DNA, brukes kometanalysen ofte i radiobiologiske studier14. Andre tilgjengelige cytogenetiske metoder gjenkjenner kromosomavarasjoner, inkludert disentriske, translokasjoner, asentriske fragmenter, ringer og kromatatiske typeavlastninger og mikronukleuskromosomskade (Mn). Den mest brukte metoden i radiobiologi, spesielt i biologisk dosimetry, er den disentriske kromosomanalysen på grunn av sin høye spesifisitet for stråling15. For eksempel kan PCR, en klassisk molekylær metode, ikke gjenkjenne typen oppdaget DNA-skade. I dette tilfellet passerer de immunometriske metodene følsomhetsnivået fordi reaksjonene er spesifikke mellom antigenet og antistoffet. Immunofluorescensavbildning gir visuelle bevis for utseendet av forskjellige proteiner i distinkte foci som svar på DNA-skadelige midler som ioniserende stråling16. Aktiveringsnivåene for skade og reparasjon av proteiner mRNA-nivåer kan imidlertid lett oppdages av PCR i sanntid, som er en riktig kvantitativ metode for videre molekylære studier i forbindelse med DNA-skaderespons17.
Tatt i betraktning at γ-H2AX foci tiltrekke reparasjonsfaktorer18, for å overvåke DNA skade og reparasjon på cellenivå, har vi utviklet en pålitelig immunofluorescens farging prosedyre, basert på analyse av den representative reparasjon protein foci fra NHEJ banen (DNA-PKcs) og Rad52 fra HRR-banen.
Her foreslår vi bruk av immunodetisering for disse proteinene som effektiv og sensitiv prosedyre for overvåking av DNA-DSB induksjon og reparasjon. Frem til nå har det ikke vært tilgjengelige data om DNA-DSB basert på foci av reparasjonsproteiner på cellenivå etter nøytron blandet strålebestråling for BNCT, unntatt γ-H2AX og 53BP1 markører19. Vi foreslår tilpasning av HCT-116 tykktarmskreft cellelinje, som det er rikt seg på DSBs foci, som en standard cellelinje for DNA skade analyse, fordi RIFs er lett påviselig. Denne tilhengercellelinjen er enkel å vedlikeholde og riktig for bestrålingsprosedyrer. Den foreslåtte prosedyren er basert på en stor mengde tidligere studier knyttet til den generelle immunfluorescensprosedyren for γ-H2AX-farging. Det inneholder imidlertid alle detaljer om valg av passende antistoffer med testede fortynninger for hvert representativt protein som tilhører hver reparasjonsvei. Videre beskriver den utnyttelsen av en unik nøytron-blandet stråle som brukes i BNCT-terapi. Vi anbefaler imidlertid å utvide studiene med begge metodene, immunfluorescensfarging først og da, med høykost molekylær analyse som utført tidligere4,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av cellekultur og eksperimentelt oppsett
- Opprettholde humane kolonkreftceller, HCT-116 som anbefalt av leverandøren, i monolag i 75 cm2 kulturflasker som inneholder 10 ml formulert McCoys 5a Medium Modified, supplert med 10% foster storfe serum og 1% antibiotika antimykotisk løsning.
- Vokse celler i et fuktet 5% CO2 miljø ved 37 °C til 70% av samløpet med middels fornyelse hver 2 til 3 dager.
- For å få BNCT-stråle (f.eks. nøytronstråle pluss 10BPA) og BNCT-effekt av å drepe kreftceller som tunge partikler og å deponere det meste av energien i de borholdige kreftcellene, dagen før bestråling, tilsett borleveringsmiddel til cellekulturmediet – for eksempel 10BPA, 4-Borono-L-fenylalanin (10 μg 10B/ml, 0,925 mM endelig) 12–16 h (maksimalt opptak av bor) før bestråling, som tidligere studert for kreftceller i tykktarmen og skjoldbruskkreftceller20,21.
MERK: Hvis du bruker en annen cellelinje, som det ikke finnes data for i tilfelle av BNCT-studien, tester du boropptaket for hver cellelinje for å oppnå optimal borkonsentrasjon. Mål 10BPA-celleopptaket ved induktivt koblet plasma optisk utslippsspektroskopi (ICP-OES) som utført av Dagrosa gruppe21. - Etter 12-16 t av bor levering, aspirere mediet og vaske cellene med 10 ml 1x PBS. Deretter trypsinisere cellene ved å legge til 2 ml Trypsin-EDTA løsning til cellene og inkubere i 5 min ved 37 °C for å forbedre celleavløsning. Når cellene begynner å løsne, stopp trypsin-handlingen ved å legge til 10 ml komplett medium.
- Aspirer celleoppsusingen i 15 ml-røret og telle cellene ved hjelp av en automatisert celleteller ved å legge til 10 μL av 0,4% trypan blå til 10 μL celler, bland og aliquoting 10 μL på en tellesklie. Fortynn cellesuspensjonen til en konsentrasjon på 1 x 106 celler/ml av mediet. Aliquot 1 ml cellesuspensjon per kryotube.
- Forbered termuminescerende dosimeters (TLDs) for måling av gamma-ray doser og gull folier for nøytron fluencies og fest TLDs til kryorør eller cellekultur kolbe før bestråling.
- Bestråle 1 x 106 celler/ml med nøytronblandet stråle ved anbefalt minimal termisk nøytronfluks på 5,9 x 1011 (n/cm-2 min−1)4 i kulturflasker eller kryorør avhengig av anleggets evner.
MERK: Sett opp tidspunktet for bestråling før du får anbefalt nøytronfluks. - Etter bestråling, frø 1 ml bestrålte celler (1 x 106 celler / ml) på 22 x 22 mm dekkslepper i 35 mm Petri retter eller 6 brønnplater, supplement med 2 ml av nødvendig medium. Inkuber celler i maksimalt 3 timer ved 37 °C i et fuktet 5 % CO2-miljø for å la dem feste seg til dekkslipsene. Vær oppmerksom på vedlegg av celler fra tid til annen under et omvendt mikroskop med 20x mål.
MERK: For HCT-116 celler minimum tetthet er 600.000 celler til frø. For rask videre fargingsprosedyre bruk kammerlysbilder, reduser celletettheten tilsvarende.
2. Fiksering av celler
- Etter bestråling og inkubasjon av celler, fjern mediet fra de vedlagte cellene og vask cellene en gang med 2,5 ml PBS.
- Fiks celler med 1 ml 70% etanol i 10 min ved RT.
MERK: Alternativt kan du bruke 1%-3,7 % paraformaldehyd (PFA) til fiksering som anbefalt tidligere19. Protokollen er satt på pause her. Oppbevar faste celler i etanol i en fryser ved -20 °C i ikke mer enn noen få uker for videre analyse og immunofluorescensfarging.
3. Permeabilisering av celler
- Etter fiksering fjern etanol fra petriskålen og vask med 2,5 ml 1x PBS.
MERK: Ikke la cellene tørke mellom skylletrinnene. - Tilsett forsiktig 1 ml 0,2% av Triton X-100/PBS for å dekke dekkplene med celler i Petri-retter.
- Inkuber i 5 min ved RT.
- Vask cellene 3x med 2,5 ml 1x PBS.
MERK: Øk prosentandelen av Triton X-100 i PBS opptil 0,5 % om nødvendig (mer foci påvisbar, avhengig av den testede cellelinjen). Utfør ekstra vasker med PBST (PBS med 0,5 % Tween) for å unngå uspesifikk binding. - Blokkpermeabiliseringstrinn med 1 ml 2 % BSA (Bovine Serum Fraction V albumin) fortynnet i PBS og inkuber i minst 30 min eller 1 t med 1 % BSA.
MERK: Dette trinnet kan utelates og er avhengig av hvilken type antistoff som brukes. Alternativt kan du bruke 5 % FBS som anbefalt i ref4.
4. Immunofluorescens farging
- Tilsett riktig mengde primær antistoff (Anti-ŵ-H2AX, Anti-DNA-PKcs og Anti-Rad52) fortynnet i PBS med BSA (2% Bovine Serum Fraction V albumin) som anbefalt (se tabell 1 med anbefalte fortynninger) (100 μL er nødvendig per prøve).
| Primær antistoff | Funksjonen | Anbefalt fortynning | lagring [°C] |
| Anti-ŵ-H2AX | påvisning av DNA-DSBs | 13.1000 (PBS-BSA) | 4 |
| Anti-DNA-Pkcs | påvisning av RIFs av DNA-PKcs protein som tilhører NHEJ | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Anti-Rad52 | påvisning av RIFs av Rad52 protein som tilhører HRR | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Sekundært antistoff | i mørket | ||
| anti-mus IgG FITC | ŵ-H2AX foci | 1:400 (PBS-BSA) | 4 |
| Geit Anti-Kanin IgG H&L (Alexa Fluor 488) | for NHEJ og HRR reparasjon proteiner foci | 1:500 (PBS-BSA) | -20 |
Tabell 1: Anbefalte fortynninger og merknader for bruk av antistoffer som brukes i avsnitt 4.
- Dekk petriskålen for å opprettholde fuktigheten i en plastboks med fuktig lignin ved hjelp av destillert vann og inkuber i 30 min ved 37 °C i inkubatoren.
MERK: Protokollen kan settes på pause her. Inkubasjon kan utføres ved 4 °C for over natten. - Etter inkubasjon utføres 3 vasker med 2,5 ml PBS.
MERK: Ikke la skyvet tørke under skylletrinn. - Tilsett riktig mengde sekundært antistoff (antimus IgG FITC, Geit Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 488) fortynnet i PBS med BSA (se tabell 1) (100 μL er nødvendig per prøve). For dette fungerer følgende trinn i mørket.
- Dekk petriskålen igjen for å opprettholde fuktigheten i en plastboks med fuktig lignin og inkuber i 30 min minimum ved 37 °C i inkubatoren.
- Etter inkubasjon utføres 3 vasker med 2,5 ml PBS.
- Tilsett 100 μL DAPI fortynnet i PBS til en endelig konsentrasjon på 1 μg/ml for å motvirke kjernene.
- Inkuber kort tid, i maksimalt 2 min ved RT.
- Etter inkubasjon utføres 3 vasker med 2,5 ml PBS.
- Fjern PBS og legg forsiktig en coverslip på toppen av monteringsmediet, unngå dannelsen av luftbobler og forsegle kantene på dekkslippen med neglelakk. Vent til lakken tørker og male dekkslip rundt.
- Vent til herding av monteringsmediet (opptil 3 h) før bildeanalyse under fluorescensmikroskopi.
MERK: Protokollen kan settes på pause her. Oppbevar glasslysbildene i en plastboks ved 4 °C i mørket.
5. Bildeanskaffelse og analyse
- Skaff deg bilder med et fluorescensmikroskop under 100x mål med nedsenkingsolje.
- Analyser foci i kjernene med et fluorescensmikroskop utstyrt med følgende filtre for: Alexa Fluor 488: eksitasjon/utslipp (nm): 496/519, utslippsfarge grønn; DAPI: eksitasjon/utslipp (nm): 358/461, utslippsfarge blå.
MERK: Analyse av DSB-er langs enkeltpartikkelspor kan kreve avansert mikroskopi som konfokal laserskanningsmikroskopi med høyere oppløsning.
- Analyser foci i kjernene med et fluorescensmikroskop utstyrt med følgende filtre for: Alexa Fluor 488: eksitasjon/utslipp (nm): 496/519, utslippsfarge grønn; DAPI: eksitasjon/utslipp (nm): 358/461, utslippsfarge blå.
- Lagre anskaffede bilder og prosess med riktig bildebehandlingsprogramvare, for eksempel ImageJ eller Image Pro3,20.
MERK: Bruk av individuelle makroer og programtillegg utviklet for automatisk analyse eller utvikling/kjøp av individuell bioinformatikk programvare anbefales. - Hvis du bruker Image-Pro-programvare for focianalyse, behandler du bilder i TIFF-filer: velg Count/Size Button, og klikk deretter på Typer [velg måletype (f.eks. diameter eller område)], klikk Områder [sett måleområde], klikk Del objekter om nødvendig. Hvis du vil justere lysstyrken, klikker du lys [adjust treshold]. Klikk deretter på Antall [rød knapp].
- Hvis du vil eksportere data, klikker du Datatabell | Statistikk | Eksporter til Excel. I regnearkprogramvaren tegner du grafer med den nødvendige statistiske analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For det første utførte vi en analyse av en standard markør for påvisning av DNA-DSB, γH2AX foci i tykktarmskreftceller, ikke-utstrålt og bestrålt med nøytron-blandet stråle. γ-H2AX foci vises som distinkte fluorescerende prikker og viser dannelsen av DNA-DSBs (som hver γ-H2AX fluorescerende punkt representerer en enkelt DSB) (se figur 1).
Figur 1: Representative bilder av mønstre av γ-H2AX foci i tykktarmskreftceller i cellelinjen HCT-116 (uten stråling) og etter nøytron-blandet strålebestråling. Nøytron-blandet strålebestråling ble utført med en dose på 2,6 Gy i celler behandlet dagen før med BPA (N+BPA). (A) Det venstre panelet representerer DAPI-farging av kjerner. Det høyre panelet, grønt foci (Alexa 488), tilsvarer immunodetering av γ-H2AX. Den gule pilen indikerer spor av α-partikkel som krysser kjernen (skalalinje = 10 μm). (B) Representative diagrammer som illustrerer den observerte økningen i størrelsen på radioinduserte foci. Gjennomsnittet av γ-H2AX foci diameter ble utført automatisk av Image-Pro programvare. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Interessant, i bestrålte celler med nøytron-blandet stråle (N + BPA) i en dose på ca 2,6 Gy (1,33 Gy (γ) + 1,26 Gy (N)), observerte vi høyere diameter nivåer av γ-H2AX foci (Figur 1B). Videre ble det oppdaget et enkelt spor av høy LET α-partikkel (på grunn av BNCT kjernefysisk reaksjon) som krysset kjernene i cellen (gul pil) (Figur 1A). Ulike typer stråling kan forårsake forskjellige effekter: jo høyere LET-stråling, jo mer komplekse DNA-DSB-er, jo større γ-H2AX foci og høyere områdenivåer av reparasjonsproteiner synlig som strålingsindusert foci18.
Derfor testet vi nivåer av representative reparasjonsproteiner av DNA-PKcs (fra NHEJ reparasjonsvei) og Rad52 (fra HR-banen) ved immunofluorescensmikroskopi under samme forhold, som ikke ble utført før i tilfelle av BNCT bjelke. Vi var i stand til å oppdage den høye gjennomsnittlige verdien av foci diameter av DNA-PKcs ved DNA pauser etter en nøytron-blandet i forhold til kontrollceller (ingen stråling) (se figur 2).
Figur 2: Representative bilder av mønstre av DNA-PKcs og Rad52 reparasjon foci i tykktarmskreft celler i cellelinjen HCT-116 (uten stråling) og etter nøytron-blandet strålebestråling. Nøytron-blandet strålebestråling ble utført med en dose på 2,6 Gy i celler behandlet dagen før med BPA (N+BPA). (A) Det venstre panelet representerer DAPI-farging av kjerner. Det midterste panelet representerer påvisning av strålingsindusert foci. Det høyre panelet er det sammenslåtte bildet. (B) Representative diagrammer som illustrerer den observerte økningen i størrelsen på radioinduserte foci. Gjennomsnittet av Rad52 og DNA-PKcs foci diameter ble utført automatisk ved hjelp av bildeanalyseprogramvaren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
I dette tilfellet har vi observert grupperte DNA-DSBer i bestrålte HCT-116 celler av nøytron-blandet stråle som DNA-PKcs er spesifikk for mer komplekse foci. I bestrålte celler, ved nøytronblandet stråle, ble disse fociene bare observert i cellekjernen som mer kompleks, større og gruppert med høyere intensitet (figur 2A, B). I tilfelle av Rad52 var effekten ikke så sterk som for DNA-PKcs som indikerer dominansen av NHEJ-banen i denne typen stråling. Videre, basert på litteraturdata, komplekse DSBer er sakte reparert og DNA-PKcs er bare rekruttert til lengre levd komplekse DSB som indikerer at nøytron-blandet stråle fører til dannelsen av komplekse DSB og reparasjon gjennom DNA-PKcs, men mer forskning er nødvendig på molekylært nivå for å bekrefte disse tidligere oppnådde resultatene22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Frekvensene av foci, immunkjemisk farget for γ-H2AX og 53BP1 brukes ofte i radiobiologi og er forbundet med DNA-DSB-nummer og anses som effektive og følsomme markører for overvåking av induksjon og reparasjon av DNA-DSBs19. Co-farging prosedyren av γ-H2AX og 53BP1 er en standard prosedyre for påvisning av DNA-DSBs. Dannelse av γ-H2AX foci er forbundet med rekruttering av 53BP1, en regulator av DNA skade respons23. Ulike cellelinjer kan imidlertid variere i bakgrunnsnivåene til γ-H2AX /53BP1 foci 11. Det har vist seg at γ-H2AX foci tiltrekker seg reparasjonsfaktorer18, akkumulerer en høyere konsentrasjon av reparasjonsproteiner nær et DSB-område. Jo mer komplekse DNA-DSB, jo større γ-H2AX foci og jo høyere nivåene av reparasjon proteiner. Det aktiverer en kaskade av reparasjonsveier, hvis reparasjonsfaktorer akkumuleres i en høyere konsentrasjon i et DSB-område, er de lett å oppdage ved hjelp av spesifikke antistoffer, og den foreslåtte protokollen gjør at de enkelt kan visualiseres. Her viser vi en metodikk for å studere de biologiske effektene på cellenivå for BNCT-behandling virkningen av nøytron-blandet stråle på DNA-reparasjon ved hjelp av immunofluorescensteknikk i humane tykktarmskreftceller. Forfatterne utviklet og introduserte trinnvis pålitelig protokoll med spesifikke antistoffer for å oppdage DNA-reparasjonsveier basert på immunfluorescerende farging med et antistoff spesifikt for reparasjonsfaktorer fra NHEJ og HRR-banen og observert strålingsindusert foci (RIF). Videre foreslår forfatterne bruk av HCT-116 tykktarmskreftcellelinje som en standard cellelinje for DNA-skadeanalyse og som en kontrollcellelinje for testen av DNA-reparasjonsantistoffer fordi denne cellelinjen i seg selv er rik på DSBs foci. DNA-DSB er lett påviselig, og ulike cellelinjer, spesielt kreftceller som livmorhalscellelinjen representerer forskjellige bakgrunnsnivåer av H2AX foci, ogintensitet 24.
Det er to store kritiske trinn i protokollen, fiksering av celler og immunostaining prosedyre. Forfatterne anbefaler fiksering av celler i 70% etanol som det bevarer celler i lang tid, og det inkuberes i fryseren ikke mer enn noen få uker. Dette trinnet er også kritisk fordi dette kan være pausepunkt etter at bestrålingsprosedyren utføres f.eks. i en annen institusjon/bygning/en annen dag. Et annet kritisk skritt er riktig konsentrasjon av antistoffet. Forfatterne har festet i tabellen de testede konsentrasjonene av primære og sekundære antistoffer.
Den presenterte prosedyren gir en trinnvis protokoll for å oppnå pålitelige resultater, men noen parametere kan endre resultatene av eksperimentene, som riktig valg av antistoffer som brukes, forskjellige reagenser som brukes til fikserings- og permeabiliseringstrinn, tidspunkt for inkubasjoner, kritisk prosentandel av reagenser, vasketrinn, arbeid i mørket og riktig fluorescerende mikroskop. Forfatterne forklarer hvordan man får pålitelige og repeterbare resultater i notatene.
En mindre begrensning av denne teknikken er å ha tilgang til kilden til stråling som nøytronkilde, men protokollen kan brukes som en generell protokoll for påvisning av DNA-reparasjonsveier oppnådd etter ulike typer stråling og kan behandles som universell protokoll for ulike typer stråling, for eksempel sammenligning av lav-LET og høy-LET stråling reparasjonsveier aktivering.
Vi tilbyr en universell, klar til bruk metodikk som kan brukes på cellenivå for å analysere biologiske effekter i sammenheng med BNCT terapi. I BNCT, ikke-radioaktiv bor-10 (f.eks etter behandling med 4-Borono-L-fenylalanin, BPA – bor levering agent) er bestrålt med lav energi termisk nøytroner og som et resultat av kjernefysisk reaksjon alfa partikler og litium-7 kjerner med høy LET produseres25,26. Derfor kan vår protokoll være nyttig for analyse av biologiske effekter på cellenivå også for strålingen representert ved andre fjern-LET-bjelker som protoner som brukes i protonstrålebehandling27,og karbonioner som brukes i hadronterapi28. Vi har observert at mer detaljert forskning er nødvendig innen høy-LET stråling og blandede bjelker, og kunnskap om DNA reparasjonsprosessen er nødvendig for å utvikle effektive anti-kreft terapier, derfor har vi utviklet en protokoll som tillater forskning stråling-indusert DNA skade respons aktivert av nøytron-blandet stråle. Videre kan immunofluorescensmetoden for påvisning av DNA-skaderespons og DNA-reparasjon være en potensiell metode for vurdering og påvisning av svulster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Nøytron-blandet stråle bestående av nøytron/gammastråling ble åpnet fra Maria-forskningsreaktoren i National Centre for Nuclear Research i Polen. K.M.O. ble støttet av National Science Centre, Polen (Miniatura 2) stipend #2018 nr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
References
- Carter, R. J., et al. Complex DNA Damage Induced by High Linear Energy Transfer Alpha-Particles and Protons Triggers a Specific Cellular DNA Damage Response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 100 (3), 776-784 (2018).
- Kondo, N., et al. DNA damage induced by boron neutron capture therapy is partially repaired by DNA ligase IV. Radiation Environmental Biophysics. 55 (1), 89-94 (2016).
- Sakai, W., Sugasawa, K. DNA Damage Recognition and Repair in Mammalian Global Genome Nucleotide Excision Repair. DNA Replication, Recombination, and Repair: Molecular Mechanisms and Pathology. , Springer. Tokyo. 155-174 (2016).
- Rodriguez, C., et al. In vitro studies of DNA damage and repair mechanisms induced by BNCT in a poorly differentiated thyroid carcinoma cell line. Radiation Environmental Biophysics. 57 (2), 143-152 (2018).
- Sollazzo, A., et al. Live Dynamics of 53BP1 Foci Following Simultaneous Induction of Clustered and Dispersed DNA Damage in U2OS Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), (2018).
- Jeggo, P., Löbrich, M.
- Sigurdsson, S., Van Komen, S., Petukhova, G., Sung, P. Homologous DNA pairing by human recombination factors Rad51 and Rad54. The Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42790-42794 (2002).
- Choi, E. H., Yoon, S., Hahn, Y., Kim, K. P. Cellular Dynamics of Rad51 and Rad54 in Response to Postreplicative Stress and DNA Damage in HeLa Cells. Molecules and Cells. 40 (2), 143-150 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Nakamura, T. M., Du, L. L., Redon, C., Russell, P. Histone H2A phosphorylation controls Crb2 recruitment at DNA breaks, maintains checkpoint arrest, and influences DNA repair in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 24 (14), 6215-6230 (2004).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Sage, E., Shikazono, N. Radiation-induced clustered DNA lesions: Repair and mutagenesis. Free Radical Biology and Medicine. 107, 125-135 (2017).
- Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: immunoassays in DNA damage and instability detection. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (23), 4689-4704 (2019).
- Møller, P., et al. Potassium bromate as positive assay control for the Fpg-modified comet assay. Mutagenesis. , geaa011 (2020).
- Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. Micronucleus Assay: The State of Art, and Future Directions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1534 (2020).
- Bennett, B. T., Bewersdorf, J., Knight, K. L. Immunofluorescence imaging of DNA damage response proteins: optimizing protocols for super-resolution microscopy. Methods. 48 (1), 63-71 (2009).
- Cheng, L., et al. Simultaneous induction of dispersed and clustered DNA lesions compromises DNA damage response in human peripheral blood lymphocytes. PLoS One. 13 (10), 0204068 (2018).
- Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
- Okumura, K., et al. Relative biological effects of neutron mixed-beam irradiation for boron neutron capture therapy on cell survival and DNA double-strand breaks in cultured mammalian cells. Journal of Radiation Research. 54 (1), 70-75 (2013).
- Dagrosa, M. A., et al. First evaluation of the biologic effectiveness factors of boron neutron capture therapy (BNCT) in a human colon carcinoma cell line. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 79 (1), 262-268 (2011).
- Dagrosa, A., et al. Studies for the application of boron neutron capture therapy to the treatment of differentiated thyroid cancer. Applied Radiation and Isotopes. 69 (12), 1752-1755 (2011).
- Reynolds, P., et al. The dynamics of Ku70/80 and DNA-PKcs at DSBs induced by ionizing radiation is dependent on the complexity of damage. Nucleic Acids Research. 40 (21), 10821-10831 (2012).
- Rasche, L., et al. Analysis of Lymphocytic DNA Damage in Early Multiple Sclerosis by Automated Gamma-H2AX and 53BP1 Foci Detection: A Case Control Study. PLoS One. 11 (1), 0147968 (2016).
- Banáth, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Research. 64 (19), 7144-7149 (2004).
- Barth, R. F., et al. Current status of boron neutron capture therapy of high grade gliomas and recurrent head and neck cancer. Radiatiation Oncology. 7, 146 (2012).
- Mirzaei, H. R., et al. Boron neutron capture therapy: Moving toward targeted cancer therapy. Journal of Cancer Research and Therapeutics. 12 (2), 520-525 (2016).
- Vitti, E. T., Parsons, J. L. The Radiobiological Effects of Proton Beam Therapy: Impact on DNA Damage and Repair. Cancers. 11 (7), Basel. 946 (2019).
- Mohamad, O., et al. Carbon Ion Radiotherapy: A Review of Clinical Experiences and Preclinical Research, with an Emphasis on DNA Damage/Repair. Cancers. 9 (6), Basel. 66 (2017).
