Summary
Die strahlungsinduzierte DNA-Schadensreaktion, die durch Neutronen-Mischstrahl aktiviert wird, das in der Bor-Neutronen-Capture-Therapie (BNCT) verwendet wird, ist nicht vollständig etabliert. Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren zum Nachweis von strahlungsinduzierten Brennpunkten (RIF) von Reparaturproteinen durch Immunfluoreszenzfärbung in menschlichen Darmkrebszelllinien nach Bestrahlung mit dem Neutronenmischstrahl.
Abstract
Der Zweck des Manuskripts ist es, ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Durchführung von Immunfluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der strahlungsinduzierten DNA-Schadensreaktion durch Neutronen-Gamma-Mischstrahl in der Bor-Neutronen-Capture-Therapie (BNCT) zu untersuchen. Insbesondere wird die vorgeschlagene Methode für den Nachweis der Aktivierung von Reparaturproteinen angewendet, die als Brennpunkte unter Verwendung von Antikörpern visualisiert werden können, die für DNA-Doppelstrangbrüche (DNA-DSBs) spezifisch sind. DNA-Reparaturherde wurden durch Immunfluoreszenz in Dickdarmkrebszellen (HCT-116) nach Bestrahlung mit dem Neutronen-Mischstrahl untersucht. DNA-DSBs sind die genotoxischesten Läsionen und werden in Säugetierzellen durch zwei Hauptwege repariert: nicht-homologe Endverbindungsweg (NHEJ) und homologe Rekombinationsreparatur (HRR). Die Frequenzen von brennpunkten, immunochemisch gefärbten, für häufig verwendete Marker in der Radiobiologie wie z.B. H2AX, 53BP1 sind mit der DNA-DSB-Nummer assoziiert und gelten als effiziente und empfindliche Marker zur Überwachung der Induktion und Reparatur von DNA-DSBs. Es wurde festgestellt, dass H2AX-Brennpunkte Reparaturproteine anziehen, was zu einer höheren Konzentration von Reparaturfaktoren in der Nähe eines DSB führt. Um DNA-Schäden auf zellulärer Ebene zu überwachen, wurde eine Immunfluoreszenzanalyse für das Vorhandensein von DNA-PKcs repräsentativen Reparaturprotein-Foci aus dem NHEJ-Signal und Rad52 aus dem HRR-Signal weg geplant. Wir haben ein zuverlässiges Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll für den Nachweis der strahlungsinduzierten DNA-Schadensreaktion mit Antikörpern entwickelt und eingeführt, die speziell für Reparaturfaktoren aus NHEJ- und HRR-Signalwegen und beobachteten strahlungsinduzierten Brennpunkten (RIF) bestimmt sind. Die vorgeschlagene Methode kann zur Untersuchung von Reparaturproteinen verwendet werden, die bei Neutronen-gemischter Strahlstrahlung stark aktiviert sind, wodurch die Dominanz des Reparaturwegs angezeigt wird.
Introduction
Die strahlungsinduzierte DNA-Schadensreaktion, die durch Neutronenmischstrahl aktiviert wird, der in der Bor-Neutronen-Capture-Therapie (BNCT) verwendet wird, wurde nicht vollständig bestimmt. Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren zum Nachweis von strahlungsinduzierten Brennpunkten (RIF) von Reparaturproteinen durch Immunfluoreszenzfärbung z.B. in der menschlichen Darmkrebszelllinie nach Bestrahlung mit dem Neutronenmischstrahl.
Ionisierende Strahlung (IR) induziert eine Vielzahl von verschiedenen Arten von DNA-Schäden (DNA-DSBs, DNA-SSBs, DNA-Base-Schäden), aus denen DNA-Doppelstrangbrüche die genotoxischesten DNA-Läsionen sind1. Unreparierte Brüche können zum Zelltod führen, während falsch reparierte Brüche die Wahrscheinlichkeit einer Chromosomenumlagerung, Mutagenese und des Verlusts entscheidender genetischer Informationen erhöhen. Die Schadensreaktionswege, die auf DSBs reagieren, umfassen Wege der DNA-Reparatur wie nicht-homologe Endverbindung (NHEJ), ein Mechanismus, der Ku 70/80, DNA-PKcs, Xrcc4 und DNA Ligase IV als Schlüsselfaktoren2,3,4,5,6erfordert. Bei Säugetieren ist der zweite Haupt-DNA-Reparaturweg der homologe Rekombinationsreparaturweg (HRR), der Schlüsselkomponenten erfordert - die Rad52 Epistasis-Genfamilie – Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 und Rad587. Rad51 und Rad54 sind wichtige menschliche Rekombinationsfaktoren, die an Reparaturmechanismen im Zusammenhang mit dem Replikationsstress und DNA-Brüchen in Eukaryoten beteiligt sind. Interessanterweise wurde beobachtet, dass die Downregulation des HRR-Signalwegs den NHEJ-Signal weg verbessert, der fehleranfällig ist und auf die HR-Signalwegrelevanz für die Genomstabilität8zeigt.
Der erste Schritt der DSBs-Bildung ist die Phosphorylierung des Histons von Ser-139 bei Ser-139 durch Ataxia telangiectasia mutierte Kinase (ATM) aus der PI3-Kinase-Familie7,8. Interessanterweise kann die H2AX-Phosphorylierung einfach durch Immunfluoreszenztechnik als Brennpunkte visualisiert werden, indem Antikörper verwendet werden, die speziell für phosphorylierte H2AX6sind. Es besteht eine 1:1-Beziehung zwischen der Anzahl der DSBs und den H2AX-Brennpunkten, daher wird der DSB-Marker, der -H2AX, ausgiebig durch die Charakterisierung von Foci-Bildung, Größe und Menge6,,7,,8,9,10,11untersucht. Die Bildung von H2AX-Brennpunkten führt zur Rekrutierung und Akkumulation von DNA-Schadensreaktionsproteinen (DDR)-Proteinen und chromatinmodifizierenden Faktoren, wie 53BP1 (p53-bindendes Protein 1), MDC1 (Mediator des DNA-Schadens-Checkpoints), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1 und vielen anderen Reparaturfaktoren, die so strahlungsinduzierte Foci (RIF) bilden. Alle diese Proteine kolokalisieren mit dem H2AX durch direkte oder indirekte Bindung1,11,12.
Es ist wichtig, DNA-Schäden zu erkennen und mit einem richtigen empfindlichen Test zu reparieren, daher wird mehr Aufmerksamkeit auf die Entwicklung hochpräziser Techniken geachtet13. Im Zusammenhang mit DNA-Schäden und Reparaturstudien ist die Methodik entscheidend für den sensiblen Nachweis von Genom-DNA-Schäden, die Beschreibung der Schadenskategorie und die Quantifizierung von DNA-Schäden und Reparaturmechanismen13. Um einzelne Zellen mit beschädigter DNA zu erkennen, wird Kometenassay häufig in radiobiologischen Studien verwendet14. Andere verfügbare zytogenetische Methoden erkennen chromosomale Aberrationen, einschließlich Dizentrik, Translokationen, azentrische Fragmente, Ringe und chromatidartige Aberrationen und mikronukleus chromosomale Schäden (Mn). Die am häufigsten verwendete Methode in der Radiobiologie, insbesondere in der biologischen Dosimetrie, ist der dizentrische Chromosomentest aufgrund seiner hohen Spezifität für Strahlung15. Beispielsweise kann PCR, eine klassische molekulare Methode, die Art der nachgewiesenen DNA-Schäden nicht erkennen. In diesem Fall übergeben die immunmetrischen Methoden den Sensitivitätsgrad, da die Reaktionen zwischen dem Antigen und dem Antikörper spezifisch sind. Immunfluoreszenz-Bildgebung liefert visuelle Beweise für das Auftreten verschiedener Proteine in unterschiedlichen Brennpunkten als Reaktion auf DNA-schädliche Wirkstoffe wie ionisierende Strahlung16. Die Aktivierungsniveaus von Schäden und Reparaturproteinen mRNA-Spiegel sind jedoch leicht durch Echtzeit-PCR nachweisbar, die eine richtige quantitative Methode für weitere molekulare Studien im Kontext der DNA-Schadensreaktion17ist.
Unter Berücksichtigung der Berücksichtigung der Reparaturfaktoren18, um die DNA-Schäden und die Reparatur auf zellulärer Ebene zu überwachen, haben wir ein zuverlässiges Immunfluoreszenz-Färbeverfahren entwickelt, das auf der Analyse der repräsentativen Reparaturproteinheris aus dem NHEJ-Signalweg (DNA-PKcs) und Rad52 aus dem HRR-Signalweg basiert.
Hier schlagen wir die Verwendung von Immundetektion für diese Proteine als effizientes und empfindliches Verfahren zur Überwachung der DNA-DSB-Induktion und -Reparatur vor. Bisher liegen keine Daten über DNA-DSBs vor, die auf Brennpunkten von Reparaturproteinen auf zellulärer Ebene nach der Neutronen-Mischstrahlbestrahlung für BNCT basieren, mit Ausnahme von H2AX- und 53BP1-Markern19. Wir schlagen die Anpassung der HCT-116 Darmkrebszelllinie, da sie selbst reich an DSBs-Brennpunkten ist, als Standard-Zelllinie für die DNA-Schadensanalyse vor, da RIFs leicht nachweisbar sind. Diese haftende Zelllinie ist einfach zu pflegen und für Bestrahlungsverfahren angemessen. Das vorgeschlagene Verfahren basiert auf einer Vielzahl früherer Studien im Zusammenhang mit dem allgemeinen Immunfluoreszenzverfahren der Färbung von H2AX. Es enthält jedoch alle Details bezüglich der Auswahl geeigneter Antikörper mit getesteten Verdünnungen für jedes repräsentative Protein, das zu jedem Reparaturweg gehört. Darüber hinaus beschreibt es die Verwendung eines einzigartigen Neutronen-Mischstrahls, der in der BNCT-Therapie eingesetzt wird. Wir empfehlen jedoch, die Studien mit beiden Methoden zu erweitern, zunächst immunfluoreszenzfärbung und dann, mit kostenhoher molekularer Analyse, wie zuvordurchgeführt 4,17.
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Protocol
1. Vorbereitung der Zellkultur und Versuchsaufbau
- Bewahren Sie menschliche Dickdarmkrebszellen, HCT-116, wie vom Lieferanten empfohlen, in Monolayern in 75 cm2 Kulturkolben, die 10 ml formulierte McCoy es 5a Medium Modified enthalten, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum und 1% antimykotischer Antimykotiklösung.
- Wachsen Sie Zellen in einer befeuchteten 5%CO2-Umgebung bei 37 °C bis 70% der Konfluenz mit mittlerer Erneuerung alle 2 bis 3 Tage.
- Um BNCT-Strahl (z. B. Neutronenstrahl plus 10BPA) und BNCT-Effekt der Tötung von Krebszellen als schwere Partikel zu gewinnen und den größten Teil ihrer Energie in den borhaltigen Krebszellen zu deponieren, Am Tag vor der Bestrahlung boronenabgabemittel dem Zellkulturmedium hinzufügen – z.B. 10BPA, 4-Borono-L-Phenylalanin (10 g 10B/ml, 0,925 mM end) 12–16 h (maximale Aufnahme von Bor) vor der Bestrahlung, wie zuvor für Dickdarmkrebszellen und Schilddrüsenkrebszellen20,21untersucht.
HINWEIS: Wenn Sie eine andere Zelllinie verwenden, für die im Fall der BNCT-Studie keine Daten vorliegen, testen Sie die Boraufnahme für jede Zelllinie, um eine optimale Borkonzentration zu erhalten. Messen Sie die 10BPA-Zellaufnahme durch induktiv gekoppelte Plasma-optische Emissionsspektroskopie (ICP-OES), wie sie von der Dagrosa-Gruppe21durchgeführt wird. - Nach 12-16 h Borabgabe das Medium ansaugen und die Zellen mit 10 ml 1x PBS waschen. Versuchen Sie dann, die Zellen zu versuchen, indem Sie den Zellen 2 ml Trypsin-EDTA-Lösung hinzufügen und 5 min bei 37 °C inkubieren, um die Zellablösung zu verbessern. Wenn Zellen beginnen, sich zu lösen, beenden Sie die Trypsin-Aktion, indem Sie 10 ml vollständiges Medium hinzufügen.
- Saugen Sie die Zellsuspension in der 15 ml-Röhre und zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler, indem Sie 10 l von 0,4% Trypan blau zu 10 l Zellen hinzufügen, mischen und 10 l auf einem Zählschlitten aliquotieren. Verdünnen Sie die Zellsuspension auf eine Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml des Mediums. Aliquot 1 ml der Zellsuspension pro Kryotube.
- Bereiten Sie thermolumineszierende Dosimeter (TLDs) zur Messung von Gammastrahlendosen und Goldfolien auf Neutronenfluencies vor und befestigen Sie TLDs vor der Bestrahlung an den Kryoröhren oder Zellkulturkolben.
- Bestrahlen Sie die 1 x 106 Zellen/ml mit dem Neutronen-Mischstrahl bei empfohlenem minimalen thermischen Neutronenfluss von 5,9 x 1011 (n/cm-2 min. . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
HINWEIS: Richten Sie die Zeit der Bestrahlung ein, bevor Sie den empfohlenen Neutronenfluss erhalten. - Nach beeishandelter Art 1 ml bestrahlter Zellen (1 x 106 Zellen/ml) auf 22 x 22 mm Abdeckungen in 35 mm Petrischalen oder 6 Brunnenplatten, Ergänzung mit 2 ml benötigtem Medium. Inkubieren Sie Zellen für maximal 3 h bei 37 °C in einer befeuchteten 5%CO2-Umgebung, um sie an den Abdeckungen anbringen zu lassen. Beobachten Sie die Anhaftung von Zellen von Zeit zu Zeit unter einem invertierten Mikroskop mit 20x Objektiv.
HINWEIS: Für HCT-116 Zellen mindestdichte dichte ist 600.000 Zellen zu Samen. Für eine schnelle weitere Färbung verwenden Kammerschlitten, reduzieren Sie die Zelldichte entsprechend.
2. Fixierung von Zellen
- Nach beebung und Inkubation von Zellen, entfernen Sie das Medium aus den angeschlossenen Zellen und Waschzellen einmal mit 2,5 ml PBS.
- Fix Zellen mit 1 ml 70% Ethanol für 10 min bei RT.
HINWEIS: Alternativ verwenden Sie 1%-3,7% Paraformaldehyd (PFA) zur Fixierung, wie zuvor empfohlen19. Das Protokoll wird hier angehalten. Feste Zellen in Ethanol bei -20 °C für nicht mehr als ein paar Wochen für weitere Analysen und Immunfluoreszenzfärbung in einem Gefrierschrank lagern.
3. Permeabilisierung von Zellen
- Nach der Fixierung Ethanol aus der Petrischale entfernen und mit 2,5 ml 1x PBS waschen.
HINWEIS: Lassen Sie die Zellen zwischen den Spülschritten nicht trocknen. - Fügen Sie vorsichtig 1 ml 0,2% von Triton X-100/PBS hinzu, um die Coverlips mit Zellen in Petrischalen abzudecken.
- 5 min bei RT inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit 2,5 ml 1x PBS.
HINWEIS: Erhöhen Sie den Prozentsatz von Triton X-100 in PBS bei Bedarf um bis zu 0,5 % (mehr Brennpunkte nachweisbar, abhängig von der getesteten Zelllinie). Führen Sie zusätzliche Wähen mit PBST (PBS mit 0,5% Tween) durch, um eine unspezifische Bindung zu vermeiden. - Blockpermeabilisierungsschritt mit 1 ml 2% BSA (Bovine Serum Fraction V albumin) in PBS verdünnt und mindestens 30 min oder 1 h mit 1% BSA inkubieren.
HINWEIS: Dieser Schritt kann weggelassen werden und ist abhängig von der Art des verwendeten Antikörpers. Alternativ können Sie 5% FBS verwenden, wie in Ref4empfohlen.
4. Immunfluoreszenzfärbung
- Fügen Sie die richtige Menge an primärer Antikörper (Anti-ɣ-H2AX, Anti-DNA-PKcs, und Anti-Rad52) in PBS mit BSA (2% Bovine Serum Fraction V Albumin) wie empfohlen verdünnt (siehe Tabelle 1 mit empfohlenen Verdünnungen) (100 l wird pro Probe benötigt).
| Primärer Antikörper | Funktion | Empfohlene Verdünnung | Lagerung [°C] |
| Anti-ɣ-H2AX | Nachweis von DNA-DSBs | 1:1000 (PBS-BSA) | 4 |
| Anti-DNA-PKcs | Nachweis von RIFs von DNA-PKcs-Protein enden nHEJ | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Anti-Rad52 | Nachweis von RIFs von Rad52-Protein entohren | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Sekundärer Antikörper | Im Dunkel | ||
| Anti-Maus IgG FITC | ɣ-H2AX-Schwerpunkt | 1:400 (PBS-BSA) | 4 |
| Ziege Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | für NHEJ- und HRR-Reparaturproteine | 1:500 (PBS-BSA) | -20 |
Tabelle 1: Empfohlene Verdünnungen und Hinweise für die Verwendung von Antikörpern, die in Abschnitt 4 verwendet werden.
- Bedecken Sie die Petrischale, um die Feuchtigkeit in einer Kunststoffbox mit feuchtigkeitsbefeuchteten Lignin mit destilliertem Wasser zu halten und brüten Sie 30 min bei 37 °C im Inkubator.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Inkubation kann bei 4 °C für die Nacht durchgeführt werden. - Nach der Inkubation führen Sie 3 Wäbungen mit 2,5 ml PBS durch.
HINWEIS: Lassen Sie das Dia während der Spülschritte nicht trocknen. - Fügen Sie die richtige Menge an sekundärem Antikörper hinzu (Anti-Maus-IgG-FITC, Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 488) in PBS mit BSA verdünnt (siehe Tabelle 1) (100 l pro Probe erforderlich). Dafür arbeiten die folgenden Schritte im Dunkeln.
- Bedecken Sie die Petrischale erneut, um die Feuchtigkeit in einer Kunststoffbox mit feuchtigkeitsbefeuchteten Lignin zu halten und brüten Sie mindestens 30 min bei 37 °C im Inkubator.
- Nach der Inkubation führen Sie 3 Wäbungen mit 2,5 ml PBS durch.
- Fügen Sie 100 l DAPI in PBS verdünnt zu einer Endkonzentration von 1 g/ml hinzu, um die Kerne gegenzustainen.
- Inkubieren Sie in Kürze, für maximal 2 min bei RT.
- Nach der Inkubation führen Sie 3 Wäbungen mit 2,5 ml PBS durch.
- Entfernen Sie die PBS und legen Sie vorsichtig einen Deckelschlupf auf die Oberseite des Montagemediums, um die Bildung von Luftblasen und Dichtungkanten des Deckels mit Nagellack zu vermeiden. Warten Sie, bis der Lack trocknet und bemalen Sie den Deckel.
- Warten Sie auf die Aushärtung des Montagemediums (bis zu 3 h) vor der Bildanalyse unter Fluoreszenzmikroskopie.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Glasrutschen in einer Kunststoffbox bei 4 °C im Dunkeln lagern.
5. Bildaufnahme und -analyse
- Erfassen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop unter 100x Objektiv mit Tauchöl.
- Analysieren Sie die Brennpunkte in den Kernen mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit folgenden Filtern ausgestattet ist für: Alexa Fluor 488: Anregung/Emission (nm): 496/519, Emissionsfarbe grün; DAPI: Anregungs-Emission (nm): 358 x 461, Emissionsfarbe blau.
HINWEIS: Die Analyse von DSBs entlang von Einzelpartikelspuren kann eine fortgeschrittene Mikroskopie erfordern, wie die konfokale Laserscanmikroskopie mit höherer Auflösung.
- Analysieren Sie die Brennpunkte in den Kernen mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit folgenden Filtern ausgestattet ist für: Alexa Fluor 488: Anregung/Emission (nm): 496/519, Emissionsfarbe grün; DAPI: Anregungs-Emission (nm): 358 x 461, Emissionsfarbe blau.
- Speichern Sie aufgenommene Bilder und verarbeiten Sie mit entsprechender Bildverarbeitungssoftware z.B. ImageJ oder Image Pro3,20.
HINWEIS: Es wird empfohlen, einzelne Makros und Plugins zu verwenden, die für die automatische Analyse oder Entwicklung/den Kauf individueller bioinforschierter Software entwickelt wurden. - Wenn Sie die Image-Pro-Software für die Brennweite verwenden, verarbeiten Sie Bilder in TIFF-Dateien: Wählen Sie Die Schaltfläche Anzahl/Größe aus, klicken Sie dann auf Typen [Wählen Sie die Art der Messung (z. B. Durchmesser oder Fläche)], klicken Sie auf Bereiche [Messbereich festlegen], klicken Sie bei Bedarf auf Objekte aufteilen. Um die Helligkeit anzupassen, klicken Sie auf Hell [Treshold anpassen]. Klicken Sie dann auf Zählen [rote Schaltfläche].
- Um Daten zu exportieren, klicken Sie auf Datentabelle | Statistiken | Exportieren nach Excel. Zeichnen Sie in der Tabellenkalkulationssoftware Diagramme mit der erforderlichen statistischen Analyse.
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Representative Results
Zunächst führten wir eine Analyse eines Standardmarkers zum Nachweis von DNA-DSBs durch, h2AX-Brennpunkte in Darmkrebszellen, nicht abgestrahlt und mit dem Neutronen-Mischstrahl bestrahlt. Die H2AX-Brennpunkte erscheinen als unterschiedliche fluoreszierende Punkte und zeigen die Bildung von DNA-DSBs (da jeder fluoreszierende Punkt von H2AX einen einzelnen DSB darstellt) (siehe Abbildung 1).
Abbildung 1: Repräsentative Bilder von Mustern von H2AX-Brennpunkten in Darmkrebszellen der Zelllinie HCT-116 (ohne Strahlung) und nach Neutronen-Gemischtstrahlbestrahlung. Die Bestrahlung des Neutronenstrahls erfolgte in einer Dosis von 2,6 Gy in Zellen, die am Vortag mit BPA (N+BPA) behandelt wurden. (A) Das linke Bedienfeld stellt die DAPI-Färbung von Kernen dar. Das rechte Panel, grüne Brennpunkte (Alexa 488), entspricht der Immundetektion von '-H2AX. Der gelbe Pfeil zeigt die Spur des ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, (B) Repräsentative Diagramme, die die beobachtete Zunahme der Größe radioinduzierter Brennpunkte veranschaulichen. Der Mittelwert des Durchmessers von '-H2AX-Brennpunkten wurde automatisch von der Image-Pro-Software ausgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Interessanterweise beobachteten wir in bestrahlten Zellen mit dem Neutronen-Mischstrahl (N+BPA) in einer Dosis von etwa 2,6 Gy (1,33 Gy (B) + 1,26 Gy (N)) höhere Durchmesserniveaus von H2AX-Brennpunkten(Abbildung 1B). Darüber hinaus wurde eine einzelne Spur des hohen LET-Teilchens (aufgrund der BNCT-Kernreaktion) über die Zellkerne (gelber Pfeil)(Abbildung 1A) nachgewiesen. Verschiedene Arten von Strahlung können unterschiedliche Effekte verursachen: Je höher die LET-Strahlung, desto komplexer die DNA-DSBs, desto größer die H2AX-Brennpunkte und die höheren Flächenniveaus von Reparaturproteinen, die als strahlungsinduzierte Brennpunkte sichtbar sind18.
Daher haben wir die Konzentrationen repräsentativer Reparaturproteine von DNA-PKcs (aus Dem NHEJ-Reparaturweg) und Rad52 (vom HR-Signalweg) durch Immunfluoreszenzmikroskopie unter den gleichen Bedingungen getestet, die im Falle des BNCT-Strahls zuvor nicht durchgeführt wurde. Wir konnten den hohen Mittelwert des Brennweites von DNA-PKcs bei DNA-Brüchen nach einem Neutronen-Mixed im Vergleich zu Kontrollzellen (keine Strahlung) erkennen (siehe Abbildung 2).
Abbildung 2: Repräsentative Bilder von Mustern von DNA-PKcs und Rad52-Reparaturherden in Darmkrebszellen der Zelllinie HCT-116 (ohne Strahlung) und nach Neutronen-gemischter Strahlbestrahlung. Die Bestrahlung des Neutronenstrahls erfolgte in einer Dosis von 2,6 Gy in Zellen, die am Vortag mit BPA (N+BPA) behandelt wurden. (A) Das linke Bedienfeld stellt die DAPI-Färbung von Kernen dar. Das mittlere Panel stellt den Nachweis von strahlungsinduzierten Brennpunkten dar. Das rechte Fenster ist das zusammengeführte Bild. (B) Repräsentative Diagramme, die die beobachtete Zunahme der Größe radioinduzierter Brennpunkte veranschaulichen. Der Mittelwert von Rad52 und DNA-PKcs-Brennweite wurde automatisch mit der Bildanalyse-Software durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
In diesem Fall haben wir gruppierte DNA-DSBs in bestrahlten HCT-116-Zellen durch den Neutronen-Mischstrahl beobachtet, da DNA-PKcs spezifisch für komplexere Brennpunkte sind. In bestrahlten Zellen wurden diese Brennpunkte durch Neutronen-Mischstrahl nur innerhalb des Zellkerns als komplexer, größer und mit höherer Intensität gruppiert (Abbildung 2A,B). Im Fall von Rad52 war der Effekt nicht so stark wie bei DNA-PKcs, was auf die Dominanz des NHEJ-Signalwegs bei dieser Art von Strahlung hindeutet. Darüber hinaus werden auf der Grundlage der Literaturdaten komplexe DSBs langsam repariert und DNA-PKcs nur an länger lebende komplexe DSBs rekrutiert, was darauf hindeutet, dass der Neutronen-Mischstrahl zur Bildung komplexer DSBs und zur Reparatur durch DNA-PKcs führt, jedoch ist mehr Forschung auf molekularer Ebene erforderlich, um diese zuvor erhaltenen Ergebnisse zu bestätigen22.
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Discussion
Die Frequenzen von Brennpunkten, immunochemisch gefärbt für H2AX und 53BP1 werden häufig in der Radiobiologie verwendet und sind mit der DNA-DSB-Nummer assoziiert und gelten als effiziente und empfindliche Marker zur Überwachung der Induktion und Reparatur von DNA-DSBs19. Das Co-Färbungsverfahren von H2AX und 53BP1 ist ein Standardverfahren zum Nachweis von DNA-DSBs. Die Bildung von H2AX-Schwerpunkten ist mit der Rekrutierung von 53BP1, einem Regulator der DNA-Schadensreaktion23, verbunden. Allerdings können unterschiedliche Zelllinien in den Hintergrundebenen von .-H2AX /53BP1 foci 11variieren. Es hat sich gezeigt, dass die H2AX-Brennpunkte Reparaturfaktorenanziehen 18, wodurch eine höhere Konzentration von Reparaturproteinen in der Nähe einer DSB-Stelle angesammelt wird. Je komplexer DNA-DSBs, desto größer die H2AX-Schwerpunkte und desto höher die Konzentrationen von Reparaturproteinen. Es aktiviert eine Kaskade von Reparaturwegen, wenn sich Reparaturfaktoren in einer höheren Konzentration an einem DSB-Standort ansammeln, sind sie mit spezifischen Antikörpern leicht nachweisbar und das vorgeschlagene Protokoll ermöglicht es, sie leicht zu visualisieren. Hier zeigen wir eine Methodik zur Untersuchung der biologischen Wirkungen auf zellulärer Ebene für die BNCT-Therapie die Auswirkungen des Neutronen-Mischstrahls auf die DNA-Reparatur mittels Immunfluoreszenztechnik in menschlichen Dickdarmkrebszellen. Die Autoren entwickelten und führten Schritt für Schritt ein zuverlässiges Protokoll mit spezifischen Antikörpern zum Nachweis von DNA-Reparaturwegen auf der Grundlage von immunfluoreszierenden Färbungen mit einem Antikörper ein, der speziell für Reparaturfaktoren aus NHEJ- und HRR-Signalweg und beobachteten strahlungsinduzierten Brennpunkten (RIF) bestimmt ist. Darüber hinaus schlagen die Autoren die Verwendung der HCT-116 Darmkrebszelllinie als Standard-Zelllinie für die DNA-Schadensanalyse und als Kontrollzelllinie für den Test von DNA-Reparatur-Antikörpern vor, da diese Zelllinie selbst reich an DSBs-Schwerpunkten ist. DNA-DSBs sind leicht nachweisbar, und verschiedene Zelllinien, insbesondere Krebszellen wie die Gebärmutterhalszelllinie, stellen unterschiedliche Hintergrundebenen von H2AX-Brennpunkten und Intensität24dar.
Es gibt zwei wichtige kritische Schritte im Protokoll, Fixierung von Zellen, und Immunstaining-Verfahren. Die Autoren empfehlen die Fixierung von Zellen in 70% Ethanol, da es Zellen für eine lange Zeit konserviert, und es wird nicht mehr als ein paar Wochen im Gefrierschrank inkubiert. Dieser Schritt ist auch wichtig, da dies ein Pausenpunkt sein kann, nachdem ein Bestrahlungsverfahren z. B. in einer anderen Institution/Gebäude/einem anderen Tag durchgeführt wurde. Ein weiterer kritischer Schritt ist die richtige Konzentration des Antikörpers. Die Autoren haben in der Tabelle die getesteten Konzentrationen von primär- und sekundären Antikörpern beigefügt.
Das vorgestellte Verfahren bietet ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, jedoch könnten einige Parameter die Ergebnisse der Experimente verändern, wie die richtige Wahl der verwendeten Antikörper, verschiedene Reagenzien, die für die Fixierungs- und Permeabilisierungsschritte verwendet werden, Die Zeit der Inkubationen, den kritischen Prozentsatz der Reagenzien, Waschschritte, die Arbeit im Dunkeln und das richtige Fluoreszenzmikroskop. Die Autoren erklären in den Notizen, wie man zuverlässige und wiederholbare Ergebnisse erzielt.
Eine geringfügige Einschränkung dieser Technik ist der Zugang zur Strahlungsquelle wie Neutronenquelle, jedoch kann das Protokoll als allgemeines Protokoll für den Nachweis von DNA-Reparaturwegen verwendet werden, die nach verschiedenen Strahlungsarten erhalten wurden, und kann als universelles Protokoll für verschiedene Strahlungsarten behandelt werden, z. B. durch Vergleich von Aktivierung von Signalwegen mit niedrigem LET und hoher LET-Strahlung.
Wir bieten eine universelle, gebrauchsfertige Methodik, die auf zellulärer Ebene verwendet werden kann, um biologische Effekte im Rahmen der BNCT-Therapie zu analysieren. In BNCT wird nicht-radioaktives Bor-10 (z.B. nach Behandlung mit 4-Borono-L-Phenylalanin, BPA – Bor-Trägermittel) mit energiearmen thermischen Neutronen bestrahlt und als Folge der Kernreaktion alpha-partikel und Lithium-7-Kerne mit hohem LET produziert25,26. Daher kann unser Protokoll für die Analyse biologischer Effekte auf zellulärer Ebene auch für die Strahlung nützlich sein, die durch andere hohe LET-Strahlen wie Protonen, die in der Protonenstrahltherapie verwendet werden, dargestelltwird,und Kohlenstoffionen, die in der Hadronentherapie verwendet werden28. Wir haben beobachtet, dass detailliertere Forschung auf dem Gebiet der High-LET-Strahlung und gemischte Strahlen erforderlich ist, und Wissen über den DNA-Reparaturprozess ist erforderlich, um effektive Anti-Krebs-Therapien zu entwickeln, daher haben wir ein Protokoll entwickelt, das die Erforschung strahlungsinduzierter DNA-Schadensreaktionen ermöglicht, die durch den Neutronen-Mischstrahl aktiviert werden. Darüber hinaus könnte die Immunfluoreszenzmethode zum Nachweis der Reaktion auf DNA-Schäden und dna-Reparatur eine mögliche Methode zur Bewertung und Detektion von Tumoren sein.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Neutronenmischstrahl aus Neutronen-Gamma-Strahlung wurde aus dem Forschungsreaktor Maria im Nationalen Zentrum für Kernforschung in Polen abgerufen. K.M.O. wurde vom National Science Centre, Polen (Miniatura 2) Stipendium Nr. #2018/02/X/NZ5/02849 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
References
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