Summary
Här beskrev vi ett protokoll för att kvantitativt studera montering och struktur av axon initiala segment (AIS) av hippocampal nervceller som saknar förmonterade AIS på grund av avsaknaden av en jätte ankyrin-G.
Abstract
Neuronal axon initiala segment (AIS) är platser för inledande av åtgärder potentialer och har studerats utförligt för deras molekylära struktur, montering och aktivitet-beroende plasticitet. Giant ankyrin-G, huvudarrangören av AIS, associerar direkt med membranspäckad spänning gated natrium (VSVG) och kaliumkanaler (KCNQ2/3), samt 186 kDa neurofascin, en L1CAM cell vidhäftningsmolekyl. Giant ankyrin-G binder också till och rekryterar cytoplasmiska AIS-molekyler inklusive beta-4-spektrin och mikrotubulebindande proteiner, EB1/EB3 och Ndel1. Jätte ankyrin-G är tillräckligt för att rädda AIS-formationen i ankyrin-G bristfälliga nervceller. Ankyrin-G innehåller också en mindre 190 kDa isoform belägen vid dendritiska ryggraden istället för AIS, som inte kan rikta sig till AIS eller rädda AIS i ankyrin-G-bristfälliga nervceller. Här beskrev vi ett protokoll med odlade hippocampal nervceller från ANK3-E22/23-flox möss, som, när transfected med Cre-BFP uppvisar förlust av all isoform av ankyrin-G och försämra bildandet av AIS. Tillsammans ett modifierat Banker glia/neuron co-culture system utvecklade vi en metod för att transfect ankyrin-G null nervceller med en 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, vilket är tillräckligt för att rädda bildandet av AIS. Vi använder vidare en kvantifieringsmetod, utvecklad av Salzer och kollegor för att hantera variationer i AIS avstånd från de neuronala cellkroppar som förekommer i hippocampala neuronkulturer. Detta protokoll tillåter kvantitativa studier av de novo montering och dynamiskt beteende av AIS.
Introduction
Axon initiala segmentet ligger vid proximala axon i de flesta ryggradsdjur nervceller. Funktionellt är AIS där åtgärdspotentialer initieras på grund av hög densitet av spännings-gated natriumkanaler i denna region. AIS av vissa excitatoriska nervceller är också riktade av hämmande interneuroner genom att bilda GABAergic synapser1,2,3. Därför är AIS en kritisk plats för att integrera cellsignalering och modulera nervcellers excitabilitet. AIS är normalt 20-60 μm lång och ligger inom 20 μm från cellkroppen. Längden och positionen för AIS varierar i nervceller över hjärnregioner, liksom i olika utvecklingsstadier av samma neuron4,5. Ackumulerade bevis föreslog att sammansättningen och positionen av AIS är dynamiska för att svara på förändringen av neuronal aktivitet4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G är mästararrangör av AIS. 480 kDa ankyrin-G är ett membran associerat adapterprotein som direkt binder till spänningsgrindade natriumkanaler samt andra stora AIS-proteiner inklusive beta4-spektrin, KCNQ2/3-kanaler som modulerar natriumkanalaktivitet8,9och 186 kDa neurofascin, en L1CAM som leder GABAergic synapser till AIS2,10. 480 kDa ankyrin-G delar kanoniska ankyrindomäner som finns i de korta 190 kDa ankyrin-G-isoformen (ANK upprepar, spektrinbindningsdomän, regulatorisk domän), men utmärks av en jätte exon som endast finns i ryggradsdjur och uttrycks specifikt i nervceller (Figur 1A)11,12. Den 480 kDa ankyrin-G neuron specifika domänen (NSD) krävs för AIS-formation12. 190 kDa ankyrin-G främjar inte AIS montering eller mål AIS i ankyrin-G-null nervceller12. 190 kDa ankyrin-G är dock koncentrerat till AIS som innehåller 480 kDa ankyrin-G12. Denna förmåga hos 190 kDa ankyrin-G att rikta in sig på förmonterade AIS av wildtype nervceller har varit en källa till förvirring i litteraturen och har bromsat uppskattningen av de kritiska specialiserade funktionerna i 480 kDa ankyrin-G i AIS montering. Därför är det viktigt att studera AIS montering i ankyrin-G-null nervceller som saknar en förmonterad AIS.
Här presenterar vi en metod för att studera AIS montering och struktur med hjälp av odlade hippocampal neuroner från ANK3-E22/23-flox möss som eliminerar alla isoformer av ankyrin-G13 (Figur 1B). Genom att transfectera nervceller med en Cre-BFP-konstruktion innan AIS monteras genererade vi ankyrin-G-bristfälliga nervceller som helt saknade en AIS (Figur 1B, Figur 2). Monteringen av AIS är helt räddad efter samtransfection av 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid med en Cre-BFP plasmid. Den här metoden är ett sätt att studera AIS-sammansättningen i en icke-förmonterad AIS-miljö. Vi modifierade också glia-neuron co-culture system från Gary Banker utan att använda antibiotika, tidigare utformad för embryonala dag 18 nervceller, för tillämpning på postnatala mus nervcellerochanpassade en AIS kvantifieringsmetod för att genomsnittliga AIS mätningar från flera nervceller att normalisera variationen av AIS14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Denna kulturmetod för hippocampala nervceller från postnatala 0-dagars ANK3-E22/23f/f möss är anpassad från Gary Bankers glia / neuron co-culture system. Därför är det viktigt att utföra alla steg efter dissekering i en ren huva med steriliserade verktyg. Det här protokollet tar upp till 1 månad. Arbetsflödet visas i bild 3. Protokollet följer Duke Universitys djurriktlinjer.
1. Förberedelse av täckglas och neuronala pläteringsrätter
- Minst en vecka före kulturdagen, lastskydd på täckställ och blötlägg den i salpetersyra (70% W / W) över natten (kan förlängas i dagar).
- Tvätta salpetersyrabehandlade täcken med destillerat vatten på en låghastighetsskakapparat i en glasburk 2 gånger, 1 timme vardera.
- Inkubera täcken i mättad KOH upplöst i 100% etanol över natten. Tillsätt KOH i etanol tills den inte längre är upplöst.
- Upprepa tvättsteget med destillerat vatten. Skölj täcken med 100% etanol en gång i 10 minuter.
- Överför täcken från racket till en glasbägare. Täck bägaren med aluminiumfolie. Grädda täcken i en 225 °C ugn över natten för att sterilisera täckglasen. (Täcklips kan förvaras i bägaren i veckor).
- Placera täcken i en Petri-skål och applicera sedan 3-4 vaxpängar på täckglaset för att fungera som fötter. Använd en Pasteur-pipett för att doppa i kokt vax i en glasflaska. Rör sedan snabbt på täckglaset för att skapa en prick. En 60 mm Petri skål rymmer 4 täcken. En 10 mm Petri skål rymmer ~10 täcken.
- 2 dagar före kulturdagen, täck täckskydd (sidan med vaxpingarna) med filtersteriliserat 1 mg/ml poly-L-lysin i 0,1 M borsyra (pH 8,5) i minst 6 timmar och skölj med vatten 2 gånger, 1 timme varje gång. Täcken finns kvar i samma Petri-rätt.
- Tillsätt pläteringsmedium (MEM kompletterat med glukos 0,6% (wt/vol) och 10% (vol/vol) hästserum) till plattorna långsamt utan störande täcken. Lägg tallrikar i inkubatorn till kulturdagen för att så nervceller.
2. Förbereda glia cellmatare rätter (2 veckor före kulturdagen)
- Dissekera cortex från en postnatal 1-dagars gammal mösshjärna och skala av hjärnhinnorna.
- Hacka cortexvävnaden så fint som möjligt med en ren sax i en ren Petri-skål i en ren bänk.
- Överför den hackade vävnaden till 12 ml HBSS och tillsätt 1,5 ml 2,5% trypsin och 1% (wt/vol) DNase. Inkubera i ett 37 °C vattenbad i 15 min, sväng var 5: e minut. Väl smält vävnad blir klibbig och bildar ett stort kluster. Triturera 10-15 gånger med en 10 ml pipett för att bryta ner vävnaden och få bättre matsmältning.
- Triturera den välsmälta vävnaden 10-15 gånger med en 5 ml pipett tills de flesta bitar försvinner och mediet blir grumligt. Passera genom en cellsil för att ta bort återstående bitar och tillsätt 15 ml gliamedium (minimalt essentiellt medium (MEM) kompletterat med glukos (0,6% wt / vol), 10% (vol / vol) hästserum och Penicillin-Streptomycin (1x) för att stoppa matsmältningen.
- Centrifugera cellerna vid 120 x g i 5 minuter och aspirera supernaten. Återanvänd cellpelleten med färskt gliamedium och frö i cellkulturrätter (ca 105 celler/cm2).
- Ersätt medium med färskt gliamedium nästa dag för att ta bort obundna celler.
- Mata glia-rätterna var 3-4 dagar med färskt gliamedium. Slå kolven 5-10 gånger med en hand för att lossa löst fastsatta celler innan du byter medium.
- Efter 10 dagars kultur bör gliaceller nästan konfluent. Lossa gliaceller med 0,25% trypsin-EDTA och frö ca 105 celler i en ny 60 mm cellkulturrätt. Återstående celler kan frysas för framtida användning.
- 3 dagar före kulturdagen, ändra glia medium till neuronal kultur medium (Neurobasal-A Medium med 1x GlutaMAX-I och 1x B27 tillägg).
3. Kultur hippocampal nervceller
OBS: Alla steg utförs vid rumstemperatur.
- Dissekera 6-8 hippocampi från postnatala 1-dagars gamla valpar från ANK3-E22/23f/f möss med HBSS medium i en Petri-maträtt i rummet tempererat. Hacka hippocampi med dissekeringssax till mindre bitar. Överför hippocampi från Petri-skålen till ett 15 ml-rör.
- Tvätta hippocampi 2x med 5 ml HBSS i röret. Lämna hippocampi i 4,5 ml 1x HBSS efter tvätt.
- Tillsätt 0,5 ml 2,5% trypsin i 4,5 ml HBSS och inkubera i ett 37 °C vattenbad i 15 minuter. Vänd röret var 5:e minut. Välsmält hippocampi bör bli klibbig och bilda ett kluster. Om det behövs, förläng matsmältningen i 5 minuter till.
- Tvätta hippocampi med HBSS 3 gånger i 5 minuter vardera. Använd inte ett vakuum för att ta bort HBSS. Det är mycket lätt att ta bort hippocampi.
- Tillsätt 2 ml HBSS efter tvätten och pipetten hippocampi upp och ner med en Pasteur-pipett 15 gånger.
- Triturera vävnaden med en brandpolerad Pasteur-pipett (diametern på den öppna är smal med hälften) 10 gånger. Gå inte längre än 10 gånger även om det fortfarande finns bitar kvar. Överstjumpning dödar nervceller.
- Vila röret i 5 minuter tills alla bitar är inställda på botten. Använd försiktigt en 1 ml pipettspets för att överföra supernatanten som innehåller de dissocierade nervcellerna till pläteringsfat (105 celler/60 mm skål). Tillsätt det direkt till det förinkuberade pläteringsmediet och skaka plattan försiktigt.
- Upprepa steg 3.6-3.7 med de återstående bitarna tills de flesta bitar har försvunnit.
- 2-4 timmar efter sådd, kontrollera pläteringsfaten med ett lätt mikroskop. Majoriteten av nervcellerna borde ha fäst sig vid täckglaset. Bifogade celler är runda och ljusa. Vänd täcken med hjälp av en fin spets tång till glia cellmatare rätter med förkonditionerad neuronal kultur medium med vax prickar sida vänd nedåt.
- Neuroner kan växa i glia cellmatarrätterna i upp till 1 månad. Mata nervceller var 7: e dag med 1 ml färskt neuronalt odlingsmedium.
- Valfritt steg: 1 vecka efter sådd, tillsätt cytosin arabinoside (1-β-D-arabinofuranosylcytosin) till en slutlig koncentration av 5 μM för att bromsa glia spridning.
4. Störning av AIS genom knockout av Ankyrin-G i tidigare skede av neuronutveckling
- På 3 div (dag in vitro),vänd täcken med vax prickar sida vänd upp till en glia cellmatare skål med konditionerad neuronal kultur medium.
- Blanda 0,25 μg Cre-BFP DNA med 0,5 μg ankyrin-G-GFP(WT/mutant) DNA i ett 1,7 ml-rör för att transfektera 4 täcklips (~ 2:1-förhållande mellan DNA-kopieringsnummer). Tillsätt 100 μL odlingsmedium (t.ex. Opti-MEM), blanda och vila på ett rack. Om endast Cre-BFP transfekteras används GFP-plasmidstommen för att matcha den totala mängden DNA.
- Blanda 3 μL transfection reagens (t.ex. Lipofectamine 2000) (~ 3 gånger DNA) med 100 μL odlingsmedium i ett nytt 1,7 ml-rör. Inkubera i 5 minuter på RT.
- Blanda 100 μL DNA-lösning från steg 4.2 med 100 μL transfection reagens från steg 4.3. Vila i 5-10 minuter på ett rack.
- Tillsätt 50 μL DNA-blandning från steg 4.4 ovanpå varje täckglas genom att sätta in spetsen strax under mediet utan att vidröra täckena. Pipett långsamt för att undvika spridning av DNA-blandning.
- För långsamt tillbaka skålen till inkubatorn och inkubera i 30-45 minuter.
- Vänd täckglasena tillbaka till hemvändaren med vaxplättar vänd nedåt och sätt tillbaka plattan till inkubatorn.
5. Kvantifiering av axon initialt segment
- Fixa nervceller på 7-10 div och fläck med AIS markör enligt standard immunocytokemi protokollet för proteinet av intressant.
- Samla fluorescerande bilder med önskad mikroskopi.
- Ta Z-seriens sektioner för att samla in signalen från hela AIS. Håll samma Z-djup för alla bilder.
- Justera laserintensiteten för att nå det bästa dynamiska pixelintensitetsområdet.
- Kontrollera att alla AIS-bilder är tagna på samma mikroskopinställning.
- Kontrollera alltid signalen från Cre-BFP.
- Kvantifiering av AIS
- Öppna bilden med Fiji (https://fiji.sc).
- Generera maximal projektion av bilder i Z-serien.
- Subtrahera den tomma omslagsbildens bakgrundssignal från bilden.
- Dra en linje längs AIS. Linjens bredd bör helt täcka AIS. Starta linjen innan AIS-signalen höjs ovanför bakgrunden och stoppas när den faller till bakgrunden.
- Mät medel pixelintensiteten ensam linjen och exportera till ett kalkylblad (~10-15 AIS behövs).
- Generera den genomsnittliga intensitetskurvan för AIS med matlab-skriptet anpassat från Berger et al.15.
- För varje experiment, inkludera Cre only och Cre plus wildtype 480 kDa ankyrin-G transfected nervceller som negativa och positiva kontroller för att se till att knockout av AIS är effektivitet och räddningen är framgångsrik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En komplett uppsättning experiment bör omfatta Cre-BFP endast transfection som negativ kontroll, Cre-BFP plus 480 kDa ankyrin-G co-transfection som positiv kontroll och ett icke-transfecterat tillstånd som teknikkontroll. I endast Cre-BFP-kontroll saknar transfekterade nervceller ackumulering av AIS-markörer, inklusive ankyrin-G (ankG), beta4-spektrin (β4), neurofascin (Nf) och spänningsgrindade natriumkanaler (VSVG) (Figur 4A)16. Cre och 480 kDa ankyrin-G co-transfected nervceller har däremot helt monterat AIS som avslöjas av nuvarande AIS markörer (Figur 4B). Det är viktigt att bekräfta kulturens kvalitet genom att jämföra med de icke-transfekterade rätterna. Ohälsosamma nervceller tenderar att visa onormal AIS-struktur, som avbruten eller utomkvedshavande AIS (Figur 4C).
Sedan visade vi ett exempel på utvärdering av hur en ankyrin-G human neurodevelopmental disorder mutation (ankG-K2864N) påverkar AIS montering (Figur 5). 3 div ANK3-E22/23f/f nervceller var transfected med Cre-BFP och wildtype 480 kDa ankyrin-G (ankG-WT) eller 480 kDa ankyrin-G baring mänskliga mutation (ankG-K2864). Nervceller fixades på div7 och färgades för ankyrin-G. Bilder samlades in från 10-15 transfected nervceller och 10-15 kontroll nervceller på samma täcklips och bearbetas med maximal intensitet projektion. Sedan drar vi en linje på AIS som visas och mäter medelintensiteten över linjen. Efter att ha i genomsnitt AIS-intensiteten plottar vi AIS-intensiteten från soma till distala axon. AIS berikat protein visade normalt en snabb ökning av signal från proximala axon och en långsam minskning av signalen till distala axon. AIS monteras av ankyrin-G med mänskliga mutant visade en ökning och minskning av signal. Men när den är i linje med den icke-transfecterade AIS är mutantkurvan bredare, och toppen av kurvan är lägre vilket tyder på en strukturförändring av AIS. Den vilda typen ankyrin-G monterad AIS nära i linje med den icke-transfecterade.
Bild 1: Genomisk redigering av ANK3-E22/23-flox. A) Schematisk representation av proteindomäner för 3 ankyrin-G-isoformer. Platsen för exon 22 och 23 kodade regioner i kanonisk domän pekas av strecklinjen. B) Positionen för LoxP-platser i ANK3-E22/23-flox möss indikeras med triangel. I nutiden av Cre recombinase, exon 22 och 23 raderas och orsakar förlust uttrycket av alla 3 isoforms av ankyrin-G. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Förlust av AIS i ANK3-E22/23-flox nervceller i nuvarande Cre rekombinas. Ett diagram visar tidsramen för ankyrin-G-uttryck och AIS-sammansättning i vilda nervceller jämfört med i ANK3-E22/23f/f-nervceller med Cre-transfection vid 3 div. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Protokollflöde. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 4: En fullständig räddning av AIS med 480kDa AnkG i ANK3-E22/23-flox nervceller transfected med Cre. 3 div-nervceller av ANK3-E22/23f/f möss transfecterades med Cre-BFP (A) eller med en Cre-BFP och vild typ 480 kDa ankyrin-G-GFP (B). Nervceller fixades vid 7 div och färgades för ankyrin-G (ankG), β4-spektrin (β4), neurofascin (Nf) och spänning gated natrium kanaler (VSVG). Vit pil huvud pekar på AIS av en transfected neuron. Skalstången är 20 μm. Denna siffra har anpassats från Yang et al16. (C) Två ohälsosamma nervceller transfected med tdTM och 480 kDa ankyrin-G-GFP visades. Bildandet av aggregat (inringade i vitt och förstorat) är ett tecken på ohälsosamma nervceller. Överst: 480 kDa ankyrin-G dyker upp i icke-AIS-regionen (spetsad med vita pilhuvuden. Botten: Neuron bildade 3 AIS och utomkvedshavandenulering av ankyrin-G på soma. Skalstången är 20 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Kvantifiering av strukturomvandlingen av AIS. div3 nervceller av ANK3-E22/23f/f möss transfected med Cre-BFP och vilda typ 480 kDa ankyrin-G eller 480 kDa ankyrin-G-K2864N. Vid 7 div, nervceller var fasta och fläckade för ankyrin-G. Representativa bilder visar ankyrin-G-signalen på AIS. Den gröna linjen och den gula linjen anger var linjen för AIS-intensitetsmätning ritades. Vit strecklinje cirklade cellkroppen i den transfekterade neuron. Skalstången är 20 μm. Genomsnittlig AIS-intensitet för båda förhållandena ritas ensamt avstånd och justeras med icke-transfekterade celler (n=10). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Monteringen av AIS organiseras av 480 kDa ankyrin-G. Ankyrin-G har dock kortare isoformer som kan rikta sig till AIS av vilda nervceller, vilket kan leda till svårigheter att tolka struktur-funktion analyser av AIS montering. Här presenterar vi en metod med hjälp av nervceller från ANK3-E22/23-flox möss som möjliggör studier av de novo montering av AIS. Genom att transfectera med Cre-BFP vid 3 div eliminerar vi alla endogena isoformer av ankyrin-G. Vi kan också samtransfektera 480 kDa ankyrin-G för att rädda bildandet av AIS. Detta möjliggör studier av AIS-formation i ett rent system. Genom att ytterligare anta Bankkultursystemet som förbättrar livskraften utan komplikationer av gliacells övertillväxt, skulle vi kunna nå en hög transfection effektivitet, vilket ger oss tillräckligt med nervceller för kvantitativ mätning av AIS dimensioner.
Det finns flera kritiska steg i det här protokollet. Det första kritiska steget är att överväga det bästa tidsfönstret för att göra transfection, vilket måste vara tillräckligt tidigt för att förhindra montering av AIS och tillräckligt sent för att nå högsta transfection effektivitet. Vi försökte 0 div elektroporering transfection, som gav cirka 10% transfection effektivitet med Cre-BFP endast, men vi kunde aldrig transfect 480 kDa Ankyrin-G vid 0 div. Vi misstänker att det beror på den stora storleken på plasmiden (ca 20 kb). Primära odlade hippocampal nervceller har ett smalt fönster för transfection, som är mellan 3-5 dagar. Ackumuleringen av ankyrin-G vid AIS börjar från 3 div. När vi transfect Cre-BFP vid 3 div, ingen AIS bildas sågs i transfected nervceller (Figur 4A). Vi kan få 10-20 nervceller transfekterade med 480 kDa ankyrin-G från en 18 mm täcklip. För räddningsexperimentet med transfekt måste också allt DNA genereras under samma promotor och förhållandet mellan Cre-BFP och 480 kDa ankyrin-G-GFP måste matchas. I detta experiment använde vi kyckling beta-aktin promotor.
Ett annat kritiskt steg är modifieringen av bankkulturen. Bankkulturen utvecklades för odling av embryonala råttneuroner. För att bättre stödja den känsligare mus postnatala hippocampal neuron, inkluderar vi ett steg att hugga hippocampi i mindre bitar för att förbättra trypsinization effektivitet. Att lägga till KOH-behandling efter salpetersyrabehandlingen minskade ytterligare toxiciteten från glaslocken, vilket hjälper nervceller att fästa och växa bättre.
En återstående utmaning är hur man kontrollerar uttrycksnivån för ankyrin-G. En doseringsskärm hjälpte till att bestämma den optimala mängden plasmid som används för transfection. Framöver är det bättre att använda en neuronspecifik promotor för att kontrollera uttrycksnivån. Den aktuella dataanalysen mäter inte AIS position. Denna funktion bör inkluderas i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar dr Gary Banker för förslaget om neuronal kulturprotokoll. Detta arbete stöds av Howard Hughes Medical Institute, ett anslag från NIH, och en George Barth Geller utrustad professur (V.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
References
- Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
- Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).
- Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM. Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).
- Hofflin, F., et al. Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).
- Schluter, A., et al. Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development. Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).
- Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment. Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability. Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).
- Pan, Z., et al. A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).
- Cooper, E. C. Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).
- Zhou, D., et al. AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing. The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).
- Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier. Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).
- Jenkins, P. M., et al. Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).
- Jenkins, P. M., et al. E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin. Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).
- Kaech, S., Banker, G.
- Berger, S. L., et al. Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment. Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).
- Yang, R., et al. Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).
