Yetişkin İnsan Beyin Dokusundan İnsan Mikroglia elde
Summary
Bu protokol, canlı, yetişkin, insan beyin dokusundan birincil mikroglia izole etkili, uygun maliyetli ve sağlam bir yöntemdir. İzole birincil insan mikroglia homeostaz ve hastalık hücresel süreçleri incelemek için bir araç olarak hizmet verebilir.
Abstract
Mikroglia merkezi sinir sisteminin yerleşik doğuştan gelen bağışıklık hücreleridir (CNS). Microglia gelişim sırasında kritik bir rol oynar, homeostaz bakımında, ve enfeksiyon veya yaralanma sırasında. Birçok bağımsız araştırma grupları otoimmün hastalıklarda, otoinflamatuar sendromlarda ve kanserlerde mikroglianın oynadığı merkezi rolü vurgulamıştır. Bazı nörolojik hastalıklarda mikroglia aktivasyonu doğrudan patojenik süreçlere katılabilir. Primer mikroglia beyinde bağışıklık yanıtları anlamak için güçlü bir araçtır, hücre-hücre etkileşimleri ve hastalıkta disregulated mikroglia fenotipler. Primer mikroglia in vivo mikroglial özelliklerini ölümsüzleştirilmiş mikroglial hücre hatlarını daha iyi taklit. İnsan yetişkin mikroglia insan fetal ve kemirgen mikroglia ile karşılaştırıldığında farklı özellikleri sergiler. Bu protokol yetişkin insan beyninden birincil mikroglia izolasyon için etkili bir yöntem sağlar. Bu mikroglia çalışma dahil olmak üzere Mikroglia ve CNS diğer yerleşik hücresel popülasyonlar arasındaki hücre hücre etkileşimleri içine kritik anlayışlar sağlayabilir, oligodendrocytes, nöronlar ve astrositler. Ayrıca, farklı insan beyninden mikroglia kişiselleştirilmiş tıp ve terapötik uygulamalar sayısız için benzersiz bağışıklık yanıtları karakterizasyonu için kültürlü olabilir.
Introduction
Merkezi sinir sistemi (CNS) nöronlar ve glial hücrelerden oluşan karmaşık bir ağ inşa edilmiştir1. Glial hücreler arasında, CNS doğuştan gelen bağışıklık hücreleri olarak mikroglia fonksiyonu2,3. Microglia sağlıklı CNS4homeostaz korumak için sorumludur. Mikroglia da nörogelişim önemli bir rol oynamaktadır, sinaps budama tarafından2. Mikroglia dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli nörolojik hastalıkların patofizyolojisi merkezidir; Alzheimer hastalığı5, Parkinson hastalığı6, inme7, multipl skleroz8, travmatik beyin hasarı9, nöropatik ağrı10, omurilik yaralanması11 ve gliomas gibi beyin tümörleri12.
CNS homeostaz ve hastalıklar ile ilgili çalışmalar maliyet etkin ve zaman etkin insan birincil mikroglia izolasyon protokolleri13bir eksikliği nedeniyle kemirgen microglia kullanır. Kemirgen mikroglia Iba-1, PU.1, DAP12 ve M-CSF reseptörü gibi genlerin ekspresyonunda birincil insan mikroglia benzer ve normal yanı sıra hastalıklı beyin13anlamada etkili olmuştur. İlginçtir, TLR4, MHC II, Siglec-11 ve Siglec-3 gibi birçok bağışıklık ilişkili genlerin ekspresyonu insan ve kemirgen microglia13arasında değişir. Çeşitli genlerin ekspresyonu da zamansal ekspresyon ve her iki türde nörodejeneratif hastalıklarda değişir14,15. Bu önemli farklılıklar insan mikroglia homeostaz ve hastalık mikroglia fonksiyonu çalışma için gerekli bir model olun. Birincil insan mikroglia da potansiyel ilaç adaylarının preklinik tarama için etkili bir araç olabilir16. Yukarıda belirtilen nedenler birincil insan mikroglia izolasyonu için maliyet etkin protokoller için artan ihtiyaç altını çizmektedir.
Tümör rezeksiyonları veya diğer cerrahi rezeksiyonlar için oluşturulan cerrahi pencere sonucunda toplanan erişkin insan beyin dokusundan birincil insan mikrogliasının izolasyonu için bir protokol geliştirdik. Buradaki yöntem mevcut yöntemlerden oldukça farklıdır. Doku toplama alanından laboratuvarda izolasyon protokolüne başlamak için yaklaşık 75 dakikalık bir geçiş süresinden sonra mikrogliayı izole etmeyi ve kültürü kültürü eleyebildik. Biz izole mikroglia büyümesini teşvik etmek için L929 fibroblast hücrelerinin supernatant kullandık. Bu yöntem özellikle sadece birincil mikroglia nın kültürü ve gelişimine odaklanır. Ortaya çıkan kültür yaklaşık% 80 microglia olduğunu. Diğer protokoller yoğunluk gradyan santrifüj, akış sitometri ve manyetik boncuklar tarafından mikroglia zenginleştirilmiş bir kültür sağlarken, protokol kültür birincil insan microglia17,18,,19,20hızlı, basit, sağlam ve maliyet etkin bir yoldur. Kadavralardan sabit beyin dokuları yerine cerrahi olarak çıkarılan canlı beyin dokusunu kullanabilme yeteneği mevcut prosedürlerin aksine bu yöntemin ek bir avantajını kanıtlıyor18,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroglia normal beyinde homeostaz sağlamak ve çeşitli nörolojik hastalıkların patofizyolojisi merkezi rol oynamak4. Mikroglia nörogelişim ve sinaps oluşumuiçinmerkezi 2 . Mikroglial çalışmalar, çeşitli nörolojik hastalıkların gelişimi ve ilerlemesini anlamada önemli bir değer kanıtlamıştır4. Kemirgen mikroglia birincil mikroglial çalışmalar için tercih yaygın modeli olsa bile, kemirgen microglia önemli yönleriyle biri…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SJ’nin laboratuvarı IITJ’nin kurumsal hibeleri ile kurulmuş olup, Biyoteknoloji Bakanlığı (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) ve Hindistan Elektronik ve Bilgi Teknolojileri Bakanlığı (No.4(16)/2019-ITEA) tarafından finanse edilmektedir. İnsan beyin dokusu bölümleri Kurumsal Etik Komitesi izni sonra All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur elde edildi. Biz Mayank Rathor, Tasarım ve Sanat Derneği IIT Jodhpur B.Tech Öğrenci üyesi, videografi desteği için teşekkür ederiz.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
Riferimenti
- Allen, N. J., Barres, B. A. Glia – more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
- Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).
- Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions. Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer’s disease: A microglial conundrum. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).
- Tremblay, M. -. E., Cookson, M. R., Civiero, L. Glial phagocytic clearance in Parkinson’s disease. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).
- Qin, C., et al. Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke. Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).
- Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology. Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).
- Loane, D. J., Kumar, A. Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated. Experimental Neurology. 275 (03), 316-327 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
- Bellver-Landete, V., et al. Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury. Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Smith, A. M., Dragunow, M. The human side of microglia. Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer’s Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
- Rustenhoven, J., et al. PU.1 regulates Alzheimer’s disease-associated genes in primary human microglia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55 (4), 412-424 (2007).
- Mizee, M. R., et al. Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).
- Rustenhoven, J., et al. Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies. Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
- Jha, S., et al. The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18. The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Plant, S. R., et al. Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein. The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).
- Arnett, H. A., et al. The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model. The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).
- Arnett, H. A., et al. TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).
- Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).
