Summary
Wir präsentieren ein einfaches Protokoll für die Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen aus Vollblut, das von Patienten mit diagnostiziertem Sézary-Syndrom gewonnen wurde, gefolgt von der Auswahl von CD4+ T-Zellen, ihrer Stimulation mit Phorbol12-Myristat13-Acetat und A23187-Ionophor und der Vorbereitung von RNA für die transkriptomische Profilerstellung.
Abstract
Kutane T-Zell-Lymphome (CTCL) stammen aus der Transformation und unkontrollierten Proliferation reifer Skin-Homing-T-Zellen, und Mycosis fungoides (MF) und Sézary-Syndrom (SS) stellen die häufigsten Subtypen dar. Trotz einer Reihe von Studien zur Charakterisierung der Genexpression, genetischer Veränderungen und epigenetischer Anomalien von CTCL bleibt die molekulare Pathogenese von MF / SS unklar. MF bezieht sich auf die häufigere CTCL mit einer Hautdominanz und ist normalerweise auf die Haut beschränkt, während SS eine aggressive leukämische Variante von CTCL mit weit verbreiteter Hautbeteiligung ist und durch neoplastische Verteilung gekennzeichnet ist, die hauptsächlich Blut, Haut und Lymphknoten umfasst. Die Identifizierung von Genexpressions-Biomarkern konzentriert sich auf die klinische Praxis und hat ein enormes Potenzial, die Diagnose und Behandlung von MF/SS zu verbessern. In der Tat haben neuere transkriptomische Studien potenzielle diagnostische Biomarker aus Unterschieden in der Genexpression zwischen normalen und bösartigen T-Zellen identifiziert, die unser Verständnis der SS-Biologie verbessern und potenzielle therapeutische Ziele aufdecken könnten. Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes reproduzierbares Protokoll für die Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen aus frischem Vollblut von Patienten, bei denen SS diagnostiziert wurde, die Auswahl von CD4 + -Gedächtnis-T-Zellen (CD4 + CD45RO + T-Zellen), chemische Stimulation und die Herstellung von RNA, die für die transkriptomische Profilierung geeignet ist, um neue prognostische molekulare Marker zu entdecken, um zusätzliche Einblicke in die Ätiologie der Krankheit zu gewinnen. Die Stimulation mit chemischem Agonisten zur Aktivierung der Kernregulation bietet eine spezifischere Bewertung für Signalwege, die für die dynamische Transkriptionsregulation und Genexpression wichtig sind, und beseitigt verwirrende Defekte, die durch vorgelagerte Signaldefekte entstehen können, die durch TCR-Antigenverlust an der Zellmembran entstehen. Die Daten aus dem Vergleich des Transkriptoms von unstimulierten bis stimulierten SS-T-Zellen entlarven funktionelle regulatorische Genexpressionsdefekte, die aus der Analyse ruhender unstimulierter Zellen nicht ersichtlich sind. Darüber hinaus kann die aus diesem Ansatz skizzierte Methode für die Untersuchung von T-Zell-Genexpressionsdefekten bei anderen T-Zell-Immunerkrankungen angepasst werden.
Introduction
Das kutane T-Zell-Lymphom (CTCL), einschließlich der häufigsten Subtypen Mycosis fungoides (MF) und Sézary-Syndrom (SS), ist eine heterogene Gruppe von Krankheiten, die aus der Transformation und unkontrollierten Proliferation reifer Hauthoming-T-Zellen resultieren 1,2. Die neoplastischen T-Zellen haben einen reifen CD4 + CD45RO +, Gedächtnisphänotyp3, und exprimieren Hauthoming-Adhäsionsmarker, wodurch der Epidermotropismus4 erhöht wird, der sich insbesondere bei frühen Erkrankungen als Hautausschlag manifestiert. Der klinische Verlauf der MF ist oft indolent, wenn er routinemäßig betreut wird, aber eine Untergruppe von Patienten kann zu einer fortgeschritteneren Erkrankung fortschreiten. In diesen MF-Fällen wachsen und verdicken sich Hautläsionen zu großen Tumoren, und neoplastische T-Zellen können sich auf Lymphknoten und viszerale Organe ausbreiten. Im Gegensatz dazu ist SS eine aggressivere, leukämische Variante von CTCL5, die durch einen Dreiklang von Symptomen gekennzeichnet ist: generalisierte Erythrodermie (definiert als >80% der gesamten Körperoberfläche), Lymphadenopathie und Vorhandensein von mehr als 1000/mm 3 zirkulierenden klonalen atypischen T-Zellen mit zerebriformen Kernen, sogenannten Sézary-Zellen 6,7 . Die Prognose für SS-Patienten ist signifikant schlechter als bei MF. SS ist mit einer Inzidenzrate von 0,1/100.000 selten und macht etwa 3% der gesamten CTCL-Fälle 8,9 aus. CTCL tritt typischerweise bei älteren Erwachsenen mit einem Durchschnittsalter von etwa 60 Jahren10 auf. Die Inzidenzrate für CTCL war gestiegen, und obwohl die Ursache unklar ist, hat sich die Rate seit1998 stabilisiert 11,12.
Die molekulare Pathogenese von SS bleibt unklar. Genetische, epigenetische und Genexpressionsstudien haben eine Fülle neuartiger Daten hervorgebracht, es gibt jedoch nach wie vor inkonsistente Ergebnisse, hauptsächlich aufgrund der untersuchten kleinen Patientenkohorten2, sowie der Unterschiede im experimentellen Design und in den Kontrollpopulationen13,14. Eine verbesserte genomische und transkriptomische Charakterisierung kann Aufschluss über Krankheitsmechanismen und bisher unerforschte therapeutische Ziele geben. Daher sind mehr Studien aus einer größeren Patientenpopulation erforderlich, um diese heterogene Malignität besser zu verstehen. Biomarker-Panels, die in einer SS-Kohorte hochempfindlich und spezifisch sind, haben in anderen Kohorten15 weniger einheitlich abgeschnitten, was ein ernsthaftes Hindernis bei der Entwicklung zuverlässiger diagnostischer und prognostischer Biomarker für SS16 darstellt. Ideale diagnostische Biomarker werden in malignen T-Zellen konsistent und stark überexprimiert, während sie in normalen T-Zellen fehlen oder fast fehlen17. Die Entdeckung krankheitsspezifischer Biomarker ist wichtig für die Weiterentwicklung diagnostischer und therapeutischer Protokolle für SS.
Qualitativ hochwertige transkriptomische Daten sowohl für maligne als auch für normale T-Zellen erfordern einen effizienten und zuverlässigen Ansatz zur Probenvorbereitung. Hier werden wir eine detaillierte, aber einfache Strategie zur Gewinnung von RNA-Proben aus T-Zell-Populationen diskutieren, die für SS relevant sind. Wir werden die Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) aus Vollblut, die negative magnetische Selektion von krankheitsrelevanten CD4 + CD45RO + T-Zellpopulationen, die chemische Aktivierung zur Aufdeckung von Unterschieden in funktionellen Reaktionen und die Vorbereitung von RNA für das transkriptomische Profiling diskutieren. Im aktuellen Protokoll wurde eine chemische Aktivierung mit Phorbolmyristatacetat (PMA) und Calciumionophor (A23187)18,19 durchgeführt, da frühere Studien eine defekte T-Zell-Rezeptorsignalisierung in CTCL gezeigt haben und die Stimulation mit PMA/A23187 den T-Zell-Rezeptor20,21 umgeht. Außerdem ermöglicht PMA/A23187 eine direktere proximale Aktivierung von Kernsignalen, die für die Aktivierung von Zytokingenen benötigt werden. Schließlich bietet die Stimulation von T-Zellen eine zusätzliche Ebene des Einblicks in die Regulation der Genexpression, die von ruhenden T-Zellen, in denen dynamische Veränderungen fehlen, nicht gewonnen werden kann.
Protocol
Menschliche Zellen sind potenziell infektiös. Daher werden die Experimente streng in Übereinstimmung mit den erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen und Verfahren durchgeführt, die als Arbeitsschutzverwaltung (OSHA) und persönliche Schutzausrüstung (PSA) diskutiert werden.
1. Isolierung von PBMCs aus Vollblut
- Sammeln Sie alle benötigten Materialien aus Tabelle 1 und bringen Sie sie auf Raumtemperatur (RT). Warm RP10F bis 37 °C. Stellen Sie die Zentrifuge auf RT ein. Führen Sie mit Ausnahme von Zentrifugationen und Zellzählungen alle Schritte mit lebensfähigen Zellen in einer biologischen Sicherheitswerkbank durch.
- Erhalten Sie Blut in fünf 10 ml Röhrchen (gewünschte Menge), die Antikoagulans enthalten. Lagern Sie das Vollblut bei Umgebungstemperatur (18\u201224 °C). Beschriften Sie 50 ml Trennröhrchen mit der menschlichen Forschungsnummer für die zu verarbeitende Blutprobe.
- Übertragen Sie 10\u201215 ml Blut in jedes Trennröhrchen mit der passenden Probandennummer. Verdünnen Sie das Blut mindestens 2-fach mit Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS). Überschreiten Sie nicht 35 ml verdünntes Blut pro Röhrchen.
- Unterlegen Sie vorsichtig und langsam das Blut mit ~ 13 ml Dichtemedium. Beobachten Sie durch das transparente Dichtemedium am Boden des Rohres und stoppen Sie das Pipettieren, wenn die Pipette fast leer ist (um eine Blasenfreisetzung zu verhindern). Entfernen Sie vorsichtig die Pipette, um eine Vermischung der Blut- und Dichtemittelschichten zu vermeiden.
- Übertragen Sie die gefüllten Trennröhrchen vorsichtig in die Zentrifuge, ohne die Schichten zu stören.
- Zentrifuge bei 500 x g für 30 min bei ausgeschalteter Zentrifugenbremse (Verzögerung auf Null eingestellt).
HINWEIS: Wenn die Zentrifuge nur Drehzahl anzeigt, konsultieren Sie die Rotorspezifikationen, um das Drehzahläquivalent für 500 x g zu schätzen. - Entfernen Sie vorsichtig Trennrohre aus der Zentrifuge, ohne die Schichten zu stören. Beobachten Sie das Buffy-Fell, das sich zwischen den Dichtemittel- und Plasmaschichten gebildet hat.
- Pipette von oben, um den größten Teil der oberen Plasmafraktion zu entfernen und zu verwerfen, so dass 10 ml über der Buffy-Schicht verbleiben. Sammle vorsichtig und langsam den Buffy-Mantel. Übertragen Sie die Buffycoats aus zwei Trennrohren in ein neues vormarkiertes und steriles 50-ml-Röhrchen, wie in Abbildung 1 dargestellt.
- Verdünnen Sie die PBMCs mindestens 2-fach mit HBSS, wodurch das Volumen in jeder neuen Röhre auf 50 ml erhöht wird. Denken Sie daran, die Zentrifugenbremse auf voll zu schalten. Pellet-PBMCs durch Zentrifugation bei 400 x g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand so weit wie möglich und tippen Sie auf den Boden des Rohres, um das Pellet zu lösen.
- Um verbleibende rote Blutkörperchen (RBC) zu lysieren, resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 1 \u20122 ml Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) -Lysepuffer pro 10 ml ursprünglichem Blutvolumen. Für genau 5 min inkubieren. Stoppen Sie die Lyse umgehend mit einem gleichen oder einem größeren Volumen von HBSS und stellen Sie das Volumen auf 50 ml ein. Zentrifuge bei 400 x g für 10 min.
- Entfernen Sie den Überstand und tippen Sie auf den Boden des Rohres, um das Zellpellet zu lösen. Poolzellen desselben Spenders. Bringen Sie die Lautstärke mit HBSS auf bis zu 50 ml. Zentrifuge bei 400 x g für 10 min.
- Entfernen Sie den Überstand und tippen Sie auf den Boden des Rohres, um das Zellpellet zu lösen. Resuspendieren Sie Zellen in 10 ml warmem RP10F-Medium und nehmen Sie ein Aliquot für die lebensfähige Zellzählung mit Trypanblau.
- Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen in jeder Probe mit einem Hämozytometer.
2. Reinigung von CD4+CD45RO+ T-Zellen aus PBMCs
HINWEIS: Die Reinigung von CD4 + CD45RO + T-Zellen aus PBMCs erfolgt unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen magnetischen Trennung (siehe Materialtabelle) mit geringfügigen Modifikationen. Es wird bevorzugt, das Kit-Handbuch für die Inkubationszeit zu befolgen, da jedes kommerzielle Kit seine eigenen Anweisungen hat.
- Waschen Sie die gewünschte Menge an PBMCs in 10 ml Auswahlpuffer. Zentrifuge bei 400 x g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand und tippen Sie auf den Boden des Rohres, um das Pellet zu lösen.
- Verdünnen Sie PBMCs auf 5 x 107 Zellen/ml im Auswahlpuffer und übertragen Sie sie auf ein 5 ml Polystyrol-Rundbodenrohr (12 x 75 mm).
- Fügen Sie 50 μL Antikörpercocktail pro 1 ml Probe hinzu und mischen Sie vorsichtig. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Unmittelbar vor dem Gebrauch magnetische Partikel für 30 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit wirbeln. Geben Sie 50 μL magnetische Partikel pro 1 ml Probe in das Röhrchen mit PBMCs und mischen Sie es vorsichtig.
- Bringen Sie die Lautstärke mit Auswahlpuffer auf bis zu 2,5 ml und mischen Sie vorsichtig. Legen Sie das Rohr (ohne Deckel) in den Magneten und inkubieren Sie es bei RT für 2,5 min.
- Nehmen Sie den Magneten auf und drehen Sie in einer kontinuierlichen Bewegung den Magneten und das Rohr um, um die angereicherte Zellsuspension in ein neues steriles Rohr zu gießen.
- Um die Ausbeute zu erhöhen, fügen Sie dem im Magneten verbleibenden Röhrchen 2,5 ml Auswahlpuffer hinzu, ohne die immobilisierten Perlen zu stören. Halten Sie den Magneten für weitere 2,5 Minuten im Magneten und wiederholen Sie Schritt 2.6, um weitere Zellen wiederherzustellen.
- Nehmen Sie ein Aliquot für die lebensfähige Zellzählung mit Trypanblau. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen mit einem Hämozytometer oder Zellzähler.
- Bestätigen Sie die Reinheit durch Durchflusszytometrie (Abbildung 3).
3. Chemische Aktivierung
- Stellen Sie CD4 + CD45RO + T-Zellen mit warmem RP10F-Medium auf 5 x 106 Zellen / ml ein und verteilen Sie die Zellen in Kulturschalen der gewünschten Größe. Ruhezellen in einem befeuchteten 37 °C 5% CO2 Inkubator über Nacht.
- Pellet-Ruhezellen durch Zentrifugation bei 400 x g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand und tippen Sie auf den Boden des Rohres, um das Zellpellet zu lösen.
- Stellen Sie die Zellkonzentration mit warmem RP10F-Medium auf 5 x 106 Zellen /ml ein und verteilen Sie 0,5 \u20121 x 107 Zellen in jedes der drei sterilen Schraubverschlussröhrchen.
HINWEIS: Wenn genügend Zellen verfügbar sind, können doppelte Stimulationen oder zusätzliche Zeitpunkte in das Versuchsdesign einbezogen werden. - Stimulieren Sie Zellen in den Röhrchen 2 und 3 mit PMA und A23187. Fügen Sie PMA zu 25 ng / ml und A23187 zu 500 ng / ml hinzu und mischen Sie vorsichtig. Fügen Sie den Zellen in Röhrchen 1 ein gleiches Volumen Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzu, das als Vehikel (Kontrolle) dienen wird. Wenn Sie beispielsweise 1 μL PMA und 1 μL A23187 verwenden, fügen Sie dem Fahrzeugrohr 2 μL DMSO hinzu. Halten Sie die Endkonzentration von DMSO in allen Röhrchen unter 0,5%.
- Lösen Sie die Kappen an den Röhrchen und bringen Sie die Zellen für 2 h (Tubus 2) und 6 h (Röhrchen 1 und 3) in den 37 °C 5% CO2-Inkubator zurück. Zum angegebenen Zeitpunkt Zentrifugenzellen bei 500 x g für 10 min.
- Vor der Lyse so viel wie möglich vom Überstand verwerfen, ohne das Zellpellet zu stören.
- Lysieren Sie die Zellen umgehend, wie in den Anweisungen des kommerziell erhältlichen RNA-Isolationskits angewiesen (siehe Materialverzeichnis). Fahren Sie mit der RNA-Isolierung fort oder frieren Sie das Lysat bei -80 ° C ein, um es später mit zusätzlichen Proben zu verarbeiten.
HINWEIS: Die Reinheit und Integrität der RNA kann mittels Mikrokapillarelektrophorese überprüft werden. - Optional: Um alle DNA-Spuren vollständig aus der gereinigten RNA-Probe zu entfernen, verwenden Sie das RNA-Reinigungskit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Representative Results
Dieses Protokoll umfasst Verfahren zur Isolierung von PBMCs aus SS-Blut, zur Reinigung von CD4 + CD45RO + -T-Zellen durch negative Selektion, zur Stimulation gereinigter T-Zellen und zur Isolierung der gesamten RNA für die transkriptomische Profilerstellung. Abbildung 1 beschreibt den Prozess der PBMC-Isolierung aus Vollblut. Bitte beachten Sie, dass die Gesamtausbeute an SS-PBMCs mit dem Anfangsblutvolumen und der zirkulierenden Tumorlast jedes Patienten variiert. In unserem Labor betrug die durchschnittliche Ausbeute an SS-PBMCs 4,6 × 10 6 Zellen/ml Vollblut (1,85 × 106 – 3,25 x 10 7 Zellen/ml für7 SS). Die mittlere Lebensfähigkeit isolierter PBMCs betrug 95\u201299%. Abbildung 2 zeigt die hohe Reinheit und Lebensfähigkeit ausgewählter CD4+CD45RO+-Speicher-T-Zellen. Die durchschnittliche Ausbeute von CD4+CD45RO+ T-Zellen aus SS-PBMCs betrug 75% (75,6% – 84%), verglichen mit 15,9% (3% – 30%) von normalen Spendern (ND) PBMCs, die aus Leukoreduktionssystem-Kammern (LRS) gewonnen wurden. Die Lebensfähigkeit und Reinheit von CD4+CD45RO+-T-Zellen, die durch dieses negative Selektionsprotokoll erhalten wurden, war konstant hoch (Abbildung 3).
Wir haben zuvor das obige Aktivierungsprotokoll mit Microarrays kombiniert, um die funktionellen Veränderungen in den Transkriptomen von SS- und ND-T-Zellen zu untersuchen, und haben gezeigt, dass SS-Speicher-T-Zellen und SS-PBMCs Zytokin und andere Immunantwortgene im Vergleich zu ND-T-Zellen und PBMCsschlecht exprimieren 19,22,23. Abbildung 4 zeigt die robuste Aktivierung mehrerer Zytokingene, einschließlich IL4, IL 10, IL13 und IL22 in ND-T-Zellen, jedoch nicht in SS-T-Zellen. Dieser Defekt in der funktionellen Genexpression in SS-T-Zellen wurde inzwischen von anderen Gruppen24 bestätigt. Darüber hinaus werden viele Gene, die normalerweise nicht in ND-T-Zellen exprimiert werden, in SS-T-Zellen sowohl in Ruhe als auch nach der Stimulation hoch exprimiert (Abbildung 4). Dazu gehören die zuvor beschriebenen SS-Biomarkergene DNM3, PLS3, TOX und TWIST125,26,27 sowie ANK1 und SGCE, die zuerst von unserer Gruppe berichtet wurden. Diese positiven Biomarker werden in SS, aber nicht in ND stark exprimiert und vermeiden technische Fallstricke, die mit negativen Biomarkern verbunden sind.
Abbildung 1: PBMC-Isolierung aus Vollblut. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Negative Selektion von CD4+-Speicher-T-Zellen aus isolierten PBMCs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Die Reinheit der CD4+CD45RO+ T-Zellen wurde durch Durchflusszytometrie bestätigt. Lymphozyten wurden durch Lichtstreuung (A) eingezäunt, lebende Lymphozyten schlossen eFluor780-Viabilitätsfarbstoff (B) aus und (C) repräsentiert nicht ausgewählte normale Spender (ND). Negative Selektion führte zu nahezu reinen Populationen von CD45RO+ T-Zellen bei ND (D) und SS-Patienten (E). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Differentielle Genexpression in ruhenden und aktivierten CD4+CD45RO+-Speicher-T-Zellen aus SS und ND. Der Genexpressions-Z-Score wird durch eine Farbskala von Rot (hohe Expression) bis grün (niedrige Expression) dargestellt. Farbige Balken oben auf der Heatmap stellen Zellbehandlungen dar: Mock/Fahrzeug behandelt (rot), 2 h stimuliert (blau) und 6 h stimuliert (gelb). Mehrere SS-Biomarker-Gene sind stark exprimiert und Zytokingene werden in SS-T-Zellen im Vergleich zu ND-T-Zellen schlecht exprimiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Reagenzien | |
| Dichte Medium | Lymphozyten-Trennmedium, Ficoll-Hypaque oder gleichwertiges Dichtemedium mit einer Dichte von = 1,077-1,080 g/ml bei 20°C. |
| HBSS | 1x Hank's ausgewogene Salzlösung, 4,2 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, pH 7,2 |
| RP10F | RPMI 1640 mittel, 10 % hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (FBS), 1x Penicillin-Streptomycin-Lösung, pH 7,2 |
| ACK-Lysepuffer | 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, Keine Anpassung des pH-Werts. Es sollte ~ 7.3 sein. |
| Auswahlpuffer | 1x HBSS, 2% FBS, 2 mM EDTA |
| phorbol12-myristat13-acetat (PMA) | 50 μg/ml in DMSO |
| A23187 Ionophor | 500 μg/ml in DMSO |
Tabelle 1: Reagenzien
Discussion
Es wurden mehrere Möglichkeiten zur Isolierung von PBMCs entwickelt, von denen jede ihre eigenen Vorteile und Einschränkungen hat28. Wir sammeln routinemäßig bis zu 50 ml Blut in fünf 10-ml-Röhrchen, die Antikoagulans enthalten. Das Volumen des Blutes für die PBMC-Isolierung hängt von mehreren Faktoren wie Gesundheit und Alter des Forschungssubjekts und auch von der Expertise des Phlebotomikers ab. Ein kritischer Verfahrensschritt im Protokoll ist die Bildung des Schrittgradienten. Eine schlechte Schichtung kann dazu führen, dass PBMCs an der Grenzfläche teilweise oder vollständig versagen. Wir bevorzugen die hier beschriebene Under-Layering-Methode, da es einfach ist, die untere Schicht zu starten. Um das gesamte Dichtemedium unter dem Blut vollständig abzugeben, ist es wichtig, eine Pipettehilfe ohne Luftlecks zu verwenden. Die Kontamination der PBMC-Fraktion durch unerwünschte Zelltypen kann durch sorgfältige und konsequente Sammlung der Buffy-Schicht minimiert werden, die für jede Isolierung auf die gleiche Weise durchgeführt werden sollte. Wenn PBMCs nicht weiter fraktioniert werden, sollte das Sammeln unterschiedlicher Mengen des Dichtegradienten und der Plasmaschichten zwischen den Isolationen vermieden werden. Die RBC-Lyse wird durchgeführt, um die potenziellen Auswirkungen der Kontamination von RBC- und Retikulozyten-abgeleiteter RNA auf nachgeschaltete Genexpressionsanalysen zu minimieren. Die hypotone Lyse wird durch überschüssigen isotonischen Puffer gehemmt.
Eine weitere Isolierung der T-Zell-Untergruppe ist für molekulare Studien wichtig. Hier beschrieben wir die nachfolgende CD4+CD45RO+ T-Zellselektion durch negative Selektion, um unerwünschte Zelltypen zu entfernen. Die negative Selektion beruht darauf, dass Antikörper spezifische Zelloberflächenmarker für alle unerwünschten Zellen erkennen. Antikörperbeschichtete Zellen werden dann durch magnetische Kügelchen entfernt. Dieses Selektionsprotokoll entfernt unerwünschte Zellen, während unberührte und nicht stimulierte Zielzellen frei schweben können, was für die Untersuchung der Genaktivierung unerlässlich ist. Es muss jedoch darauf geachtet werden, Zellklumpen zu vermeiden, die die Endreinheit ausgewählter CD4+ CD45RO+ T-Zellen verringern. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), die im Selektionspuffer vorhanden ist, minimiert die Zellverklumpung. Die Ausbeute an T-Zellen hängt von Faktoren wie dem Anfangsvolumen des Blutes, den Patientenvariablen wie der Behandlung, die dem Patienten verabreicht wird, und dem Krankheitsstadium zum Zeitpunkt der Probenentnahme ab. Die Behandlung der Patienten kann auch die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen. Darüber hinaus hat die Probenentnahme vor einem Verfahren wie der Photopherese auch positive Auswirkungen auf die Reinheit der CD4 + CD45RO + T-Zellen. Wir haben beobachtet, dass die Probenentnahme nach der Photopheresebehandlung negative Auswirkungen auf die Ausbeute von CD4 + CD45RO + T-Zellen hat.
Neoplastische T-Zell-Klone von SS-Patienten exprimieren am häufigsten Oberflächenmarker, die mit einem ausgereiften CD4-T-Zell-Phänotyp29,30 übereinstimmen. Phänotypische Plastizität wurde jedoch gelegentlich in Bezug auf Oberflächenmarker wie CD4, CD45RO,CD45RA, CD7 und/oder CD26 31 beobachtet. Frühere Studien haben auch die Heterogenität der CD45RO- und CD45RA-Expression bei SS-Patienten29 gezeigt, während die Mehrheit der SS-Fälle immer noch CD45RO+ ist. Roelens et al.31 zeigten auch, dass SS interindividuelle und intraindividuelle Heterogenität mit einer gemischten Population von naiven (TN), zentralen Gedächtnis (TCM), Übergangsgedächtnis (TTM), Effektorgedächtnis (TEM) und terminalem Effektorgedächtnis (TEMRA) -Teilmengen aufweisen kann. Ihre Ergebnisse zeigen jedoch deutlich, dass die Mehrheit der SS-Zellen einen TCM-Phänotyp aufweist. Wir konzentrierten unsere Studie auf den bei SS-Patienten häufigsten CD45RO+-Oberflächenimmunphänotyp und bestätigten den Phänotyp durch Durchflusszytometrie. Bei der Planung von Studien von T-Zell-Untergruppen bei Patienten ist es wichtig, die phänotypische Heterogenität der untersuchten Krankheit zu berücksichtigen, und die Reinigungsstrategie kann daher bei Bedarf angepasst werden, um die gewünschte T-Zell-Population für die Analyse zu erhalten.
Es gibt mehrere Möglichkeiten, T-Zellen und PBMCs zu stimulieren, um die funktionelle Genexpression zu untersuchen. Wir bevorzugen die chemische Aktivierung (PMA + A23187 Ionophor), da wir uns für die Genregulation im Zellkern interessieren. Die chemische Aktivierung ist die beste Option für diesen Zweck, da sie als breiter Aktivator wirkt und im Vergleich zur antigenspezifischen Stimulation einheitlicher ist. PMA ist eine kleine organische Verbindung, die durch die Zellmembran in das Zytoplasma diffundiert und die Proteinkinase C direkt aktiviert. A23187 lässt Kalzium durch Membranen passieren. Diese Verbindungen umgehen Oberflächenrezeptoren und ahmen zusammen die Wirkungen der T-Zell-Rezeptorligatur mit Co-Stimulation nach, die durch CD28 vermittelt wird. Die Chemikalien aktivieren mehrere intrazelluläre Signalwege, was zu einer Aktivierung des Kerntranskriptionsfaktors und einer Hochregulierung von Zytokingenen führt, die für die Transkriptionsaktivierung zugänglich sind. Obwohl die chemische Aktivierung und die CD3CD28-Ligation in normalen Zellen auffallend ähnliche globale Genexpressionsprofile erzeugen32, ist die chemische Aktivierung mit PMA + A23187 eine gute Wahl, da SS-T-Zellen die Expression von Oberflächenrezeptoren einschließlich der TCR-Komponentenverlieren können 33. Chong et al.22 verglichen die Aktivierung von Zytokingenen zwischen PMA/A23187 und Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern in PBMCs von normalen, frühen MF/CTCL- und späten MF/CTCL-Patienten. Sie berichteten, dass PMA/A23187 eine schnellere und intensivere Aktivierung des IL-2-Gens im Vergleich zur Anti-CD3/CD28-Stimulation verursachte. Darüber hinaus zeigten sie, dass die langsamere Aktivierungskinetik mit Anti-CD3/CD28-Antikörpern möglicherweise auf die Vernetzung und Membransignalisierung zurückzuführen ist, die für die Stimulation notwendig sind. Darüber hinaus wurden Trends in der Expression von Zytokinen unter den verschiedenen untersuchten Zellpopulationen mit PMA/A23187 beibehalten. Da wir uns für die Aktivierung der Genexpression interessieren, ist die chemische Stimulation ein idealer Ansatz, da sie als breiter Aktivator wirkt und im Vergleich zur antigenspezifischen Stimulation konsistenter ist. Die CD3/CD28-Ligatur ist ideal, um Signalwege zu untersuchen, die für die membranbasierte Signaltransduktion wichtig sind. Darüber hinaus ist die chemische Aktivierung kostengünstiger und erfordert keine spezielle Ausrüstung. In der aktuellen Studie aktivierte PMA + A23187 signifikant Zytokingene in ND-, aber nicht in SS-T-Zellen, was darauf hindeutet, dass SS-T-Zellen funktionelle Mängel nach der TCR aufweisen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll phänotypisch reine T-Zellen aus wertvollem Patientenblut und eine Methode zur Beurteilung genomweiter Veränderungen der funktionellen Genexpression bietet. Wir zeigen, dass das transkriptomische Profiling von SS-T-Zellen im Vergleich zu normalen CD45RO+-T-Zellen tiefgreifende Unterschiede in der Genaktivierung in frischen menschlichen T-Zellen von Patienten mit CTCL zeigt. Diese Studien werden die Entwicklung von diagnostischen Biomarkern und therapeutischen Strategien unterstützen, die auf neuartige Marker in CTCL abzielen. Darüber hinaus können diese Strategie und dieses Protokoll bei der Untersuchung primärer menschlicher T-Zellen bei der Anpassung an Studien anderer T-Zell-vermittelter Krankheiten wertvoll sein.
Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Ethische Offenlegung:
Dieses Forschungsprotokoll wurde vom Institutional Review Board (IRB) der University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS, Little Rock, AR) genehmigt. Die in dieser Studie vorgestellten Microarray-Daten wurden an den Proben durchgeführt, die im Rahmen eines vom IRB des Henry Ford Hospital (Detroit, MI) genehmigten Forschungsprotokolls rekrutiert wurden.
Acknowledgments
Wir danken den Patienten und Freiwilligen, die an unserer Forschung teilgenommen haben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| 10 ml Disposable Plastic Pipette | Thermo Scientific | 170356 | |
| 1000 ul Pipet tips | VWR | 10017-038 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 352196 | |
| 25 ml Disposable Plastic Pipette | Thermo Scientific | 170357 | |
| 5 ml Disposable Plastic Pipette | Thermo Scientific | 170355 | |
| 50 ml Conical Tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| A23187 ionophore | Fisher Scientific | BP595 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004381 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ml | |
| EasySep Human Memory CD4+ T cell Enrichment Kit | StemCell | 19157 | |
| FBS | GIBCO | 16140-071 | |
| HBSS | GIBCO | 14185-052 | |
| HEPES | Fisher Bioreagents | BP310-500 | |
| KHCO3 | Fisher Bioreagents | P184-500 | |
| Lymphocyte Separation Medium | Corning | 25-072-CV | |
| Na2EDTA | ACROS | 10378-23-1 | |
| NaHCO3 | Fisher Bioreagents | S233-500 | |
| NH4Cl | Fisher Bioreagents | A661-500 | |
| Penicillin-streptomycin solution | GIBCO | 15140122 | |
| phorbol12-myristate13-acetate (PMA) | Sigma | P-8139 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | RAININ | 17014382 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | RAININ | 17014388 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | RAININ | 17014391 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | RAININ | 17014392 | |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1013 | |
| Rneasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74136 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 31800-022 | |
| T-25 Flask | Thermo Scientific | 2024-10 |
References
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