Apresentado aqui é um método de investigação dos papéis da bomba Na+/K+ e persistente Na+ corrente em interneurônios de coração de sanguessuga usando grampo dinâmico.
A bomba Na+/K+, muitas vezes considerada como uma função de fundo na atividade neuronal, contribui com uma corrente externa (eubombeio) que responde à concentração interna de Na+ ([Na+]i). Em neurônios estourando, como os encontrados em redes neuronais geradoras de padrão central (CPG) que produzem movimentos rítmicos, o [Na+]i e, portanto, a bombaI, pode-se esperar que varie ao longo do ciclo de estouro. Essa capacidade de resposta à atividade elétrica, combinada com a independência do potencial da membrana, doto que eubombeio com propriedades dinâmicas não comuns às correntes baseadas em canais (por exemplo, canais de tensão ou transmissores ou canais de vazamento). Além disso, em muitos neurônios, a atividade da bomba é modulada por uma variedade de moduladores, expandindo ainda mais o papel potencial de eubombear em atividade de estouro rítmico. Este artigo mostra como usar uma combinação de modelagem e métodos dinâmicos de grampo para determinar como eubombeio e sua interação com a atividade rítmica de Na+ corrente persistente em um CPG. Especificamente, este artigo se concentrará em um protocolo de grampo dinâmico e métodos de modelagem computacional em interneurônios cardíacos de sanguessugas medicinais.
O batimento cardíaco em sanguessugas é impulsionado por um CPG composto por 9 pares bilaterais de interneurônios cardíacos (HNs) distribuídos em tantos gânglios segmentais do corpo médio. No núcleo do CPG estão pares mutuamente inibidores de interneurônios localizados nos gânglios3º e 4segmentos que formam osciladores de meio centro (HCOs)(Figura 1A). Esses neurônios continuam a estourar quando isolados farmacologicamente sinacicamente usando bicuculina1. Outros, como a dupla no7º gânglios segmentais (foco deste protocolo), também são estouros, capazes de produzir atividade estourando quando isolados sinapticamente. Eles não estão mutuamente conectados e recebem apenas entrada descendente, e assim são facilmente isolados cortando o gânglio do resto do cordão nervoso. Esta atividade de estouro independente é sensível à introdução da corrente de vazamento causada pela penetração com microeletrodos afiados para gravação, mas vigorosamente estourada quando gravada com métodos de patch soltos1.
Ambos os neurônios HN individuais e HCOs HN foram modelados (modelos individuais de compartimento isopotencial baseados em Hodgkin-Huxley de neurônios HN contendo todas as correntes sinopáticas e de tensão identificadas experimentalmente), e todas as características de explosão do sistema vivo foram capturadas com sucesso2. A miomodulina, um neuropeptídeo endógeno em sanguessugas, diminui significativamente o período (T) do ritmo de explosão de neurônios HN isolados e HN HCOs. Este modulador atua para aumentar a corrente h (corrente interna ativada por hiperpolarização, Ih) e diminuir abomba3. Essa observação levou à exploração de como eubombeio interage com Ih, e como sua co-modulação contribui para a atividade rítmica dos neurônios HN. A ativação da bomba aumentando [Na+]i (usando o monensin ionophore) acelera o ritmo de explosão hn tanto em HCOs HN quanto em neurônios HN isolados4. Essa aceleração dependia de Ih. Quando ih foi bloqueado (2 mM Cs+), o período de estouro não foi alterado por este método de ativação da bomba; no entanto, a duração da explosão (BD) foi reduzida, e o intervalo de interexploração (IBI) aumentou tanto em HN HCOs quanto em neurônios HN isolados4.
Para este protocolo, todas as correntes de um neurônio HN(7) vivo, incluindo a corrente da bomba, eubombeio,são incorporadas no modelo HN da seguinte forma:
(1)
onde C é a capacitância de membrana (em nF), V é o potencial de membrana (em V), t é tempo (em s). Descrições e equações detalhadas da corrente iônica foram descritas em outros lugares2,4. O neurônio modelo HN completo é executado em tempo real(Figura 2). O software será disponibilizado no GitHub após a publicação e será adequado para ser executado na placa de processamento de sinal digital descrita na Tabela de Materiais. Aqui, o foco da investigação é a corrente na+/K+ da bomba(eubombeio)e as correntes fechadas de tensão contribuindo significativamente na+ fluxo: um Na+ corrente rápida (INa) e uma corrente na+ persistente(IP). As conduções máximas dessas correntes
são, respectivamente,. A bomba Na+/K+ troca três íons Intracelulares Na+ por dois íons extracelulares K+ ions, produzindo assim uma corrente externa líquida. É importante ressaltar que ele bombeia 3 vezes mais Na+ para fora do neurônio do que esta corrente indica, o que é importante para calcular a concentração intracelular Na+.
A corrente de bomba Na+/K+ depende de concentrações na+ intracelulares e é expressa pela seguinte função sigmoidal:
(2)
onde [Na]i é a concentração intracelular Na+, é a máxima Na+/K+ corrente de bomba, [Na]ih é a concentração intracelular Na+ para a meia-ativação da bomba Na+/K+ e [Na]é a sensibilidade da bomba Na+/K+ para [Na]i. [Na]eu constrói como resultado dos influxos Na+ transportados por IP e INa e é diminuído pelo Na+ efflux da bomba Na+/K+. A contribuição de Ih e ILeak para o fluxo na+ total é pequena e não é considerada no modelo em tempo real.
(3)
onde, v é o volume (~6,7 pL) do reservatório intracelular Na+ , F é constante de Faraday, e a concentração extracelular Na+ é mantida constante.
As condutenções de tensão e de vazamento têm sido diferenciadas – estas respondem ao potencial da membrana – da corrente da bomba, que é regulada pela concentração na+ intracelular calculada ([Na+]i). [Na+] i é construído através da entrada Na+ através da rápida Na+ corrente (INa) que produz potenciais de ação (picos) e a persistente Corrente Na+ (IP) que fornece a despolarização para suportar o spiking. [Na+] i é, por sua vez, reduzido pela ação da bomba através da extrusão de Na+. Os valores hn vivos da linha de base de (5nS) e
(150 nS) foram assumidos, e levamos em conta qualquer grampo dinâmico
adicionado.
O objetivo do protocolo descrito aqui é manipular eubombear com precisão e reversivelmente em tempo real para descobrir como ele interage com correntes fechadas de tensão (corrente na+ persistente no protocolo atual) para controlar o estouro rítmico em HNs únicos. Para atingir esse objetivo, utilizou-se um grampo dinâmico, que introduz artificialmente, sob o comando, uma quantidade precisa de qualquer corrente que possa ser calculada à medida que o modelo está em execução. Este método tem vantagens sobre a manipulação farmacológica da bomba, que afeta todo o tecido, pode ter efeitos fora do alvo que muitas vezes são difíceis de reverter, e não podem ser precisamente manipulados. O grampo dinâmico5,6 lê a tensão de um neurônio registrado em tempo real(Figura 1B) e calcula e injeta, em tempo real, a quantidade de qualquer corrente baseada em equações de modelo e os valores definidos de qualquer ou
. Métodos semelhantes podem ser facilmente aplicados a qualquer neurônio que possa ser registrado intracelularmente. No entanto, os parâmetros terão que ser redimensionados ao neurônio escolhido, e o neurônio deve ser isolado de entradas sinápticas, por exemplo, farmacologicamente.
Modelagem, grampo dinâmico e as análises resultantes que permitem são técnicas úteis para explorar como indivíduos e grupos de conduência/correntes iônicas contribuem para a atividade elétrica dos neurônios(Figura 1, Figura 2,Figura 4e Figura 5). O uso dessas técnicas mostra como a corrente de bomba Na+/K+ (eubombeio)interage com correntes fechadas de tensão, particularmente a persistente Corrente Na+ (IP),para promover uma explosão robusta no núcleo de HNs do gerador de batimentos cardíacos de sanguessuga. Combinando experimentos dinâmicos de grampos e modelagem, é possível testar modelos mais diretamente do que é possível com técnicas comuns de gravação de tensão e grampo de corrente. Os resultados obtidos a partir dos experimentos dinâmicos de grampo(Figura 5) serãoutilizados para refinar ainda mais o modelo HN. O método básico de fixação dinâmica demonstrado aqui pode ser personalizado para refletir as propriedades de qualquer neurônio em estudo se um modelo matemático de correntes neuronais pode ser determinado com experimentos de grampo de tensão.
A conclusão bem sucedida dos experimentos do tipo aqui mostrados requer um empetivo cuidadoso de um HN ou outro neurônio ao usar uma microeletrídra afiada, pois o forte estouro é reduzido pela penetração de eletrodos1. (Técnicas de gravação de patches de células inteiras, que minimizam o vazamento introduzido, também são aplicáveis a outros neurônios, mas não funcionam bem em neurônios de sanguessuga.) É fundamental que o emalamento do neurônio HN cause danos mínimos ao neurônio (vazamento adicional), e a resistência à entrada deve ser monitorada e deve estar na faixa de 60-100 MOhms para experimentos bem sucedidos4.
O grampo dinâmico é uma técnica poderosa, mas tem limitações impostas pela geometria neuronal porque as condutâncias artificiais são implementadas no local do eletrodo de gravação – geralmente o corpo celular não no local onde as correntes geradoras de ritmo são geralmente localizadas5,6,10. Nos neurônios HN de sanguessuga, o corpo celular está eletricamente próximo da zona de integração (neurite principal) do neurônio onde a maioria das correntes ativas são localizadas, e picos são iniciados.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Christian Erxleben por experimentos preliminares de grampo dinâmico em neurônios HN(7) que demonstraram suas capacidades de estouro. Angela Wenning ajudou os experimentos com conselhos de especialistas. Reconhecemos o NIH por financiar este trabalho através do Grant 1 R21 NS111355 para gsc e RLC.
ANIMALS | |||
Hirudo verbana | Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches | live leeches 2-3 grams | |
CHEMICALS | |||
ARTIFICIAL POND WATER | |||
CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670-100G | 1.8 mM add last after adjusting pH |
glucose | Sigma Aldrich | G7021-100G | 10 mM |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034-100G | 10 mM |
Instant Ocean (sea salt ) | Spectrum Brands Inc., Madison, WI | 0.05% (w/v) diluted in deionized water | |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 4 mM |
NaCl | Sigma Aldrich | S7653-250G | 115 mM |
NaOH 0.1 N Solution | Sigma Aldrich | 2105-50ML | Adjust to pH 7.4 with NaOH |
MICROELECTRODES | |||
K Acetate | Sigma Aldrich | P1190-100G | 2 M |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 20 mM |
SALINE | |||
EQUIPMENT | |||
#5 Forceps | Fine Science Tools Dumont | 11251-30 OR 11251-20 | For general leech dissection |
AxoClamp 2A/2B DCC electrometer | Axon Instruments Molecular Devices | 2A/2B | For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Black resin | Dow Sylguard | 170 | Lines general dissect dish |
Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter | A-M Systems | 615000 | For fabricating sharp microelectrodes |
Clear resin | Dow Sylguard | 184 | Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy |
Dark field condenser | Nikon | Dry 0.95-0.80 MBL 1210 | For illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Digidata 1440A | Axon CNS Molecular Devices | 1440A | Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Digital signal processing board | dSpace | CLP1104 | Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9. |
Falming/Brown Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-97 | For fabricating sharp microelectrodes |
Fiber-Lite high intensity illuminator | Dolan Jenner Industries | 170D | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Headstage amplifier for AxoClamp 2A | Axon Instruments | HS-2A Gain:0.1LU | Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Light guide | Dolan Jenner Industries | Rev R 38 08 3729107 | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-385 | Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes |
Micromanipulator controller | Sutter Instruments | MPC-200 | Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes |
Minuten pins | BioQuip | 0.15 mm diameter 1208SA | Should be shortened by curtting to ~5 mm |
Optical Breadboard 3' x 5' x 8" | Newport | Obsolete | With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Oscilloscope | HAMEG Instruments | HM303-6 | To monitor electrode setteling during DCC |
Pascheff-Wolff spring scissors | Moria | Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92 | |
pClamp 9 Software | Axon Instruments | 9 | Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Pneumatic Isolators 28" | Newport | Obsolete | With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Simulink / MATLAB software | MathWorks | 2006 (Obsolete) | Implements dynamic clamp on the digital signal processing board |
Stereomicroscope | Wild | M5A | 10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia |
Steromicroscope | Wild | M5 | 20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | For general leech dissection |