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Ambiente

ループ媒介等熱増幅を用いた灌漑水中フィ トフトーラカプシ の検出

Published: June 25, 2020
doi:
10.3791/61478
, , , , ,
1Department of Plant Pathology, Coastal Plain Experiment Station,University of Georgia, 2University of Georgia Cooperative Extension, 3Department of Plant Pathology, Tropical Research & Education Center,University of Florida, 4Department of Agricultural and Environmental Sciences, Otis L. Floyd Nursery Research Center,Tennessee State University

Summary

フィルターペーパーDNA抽出法と、現場や研究室で分析できるループ媒介等熱増幅(LAMP)アッセイを用いて、水源中の フィトフトーラ・カプシチ 動物園の胞子を検出する方法を開発しました。

Abstract

フィトフトラカプシーチ は、毎年野菜生産に大きな経済的損失を引き起こす多くの重要なソラ紀とcucurbit作物に影響を与える壊滅的な卵母菌病原体です。 フィトフトラカプチーは 土壌を媒介し、風化や劣化に抵抗する長命の生存構造(オースポアおよびクラミドスポア)による野菜畑の持続的な問題です。分散の主な方法は、表面や水で満たされた土壌の毛穴に存在する水の薄膜を泳ぐことができ、水たまりや池に蓄積することができる単細胞、フラグ付き胞子である動物園の胞子の生産を通じてです。したがって、灌漑池は、病原体の発生源であり、病気の発生の初期点となり得る。灌漑水中の P.カプシチ の検出は、 ピシウム sppなどの環境中に存在する他の微生物が通常P. カプシチ を検出不能にするため、伝統的な培養ベースの方法を使用して困難である。 P.カプシシ 胞子の水源(灌漑水、流出など)の存在を判断するために、病原体の胞子(zoospore)を捕捉し、後に新しいループ媒介等熱増幅(LAMP)を介して特異的な増幅法を通じて病原体のDNAを増幅するハンドポンプベースのろ紙(8-10 μm)法を開発しました 。 この方法は、従来のPCRの40倍の感度を持つ1.2 x 102 の動物園/mLの低濃度からDNAを増幅して検出することができます。密接に関連する種を試験する場合、クロス増幅は得られない。LAMPは、カラーメトリックLAMPマスターミックス染料を用いて行われ、現場での迅速な検出のために肉眼で読み取ることができる結果を表示しました。このプロトコルは、汚染された灌漑システムを介して存在、蓄積、または分散している他の病原体に適応することができる。

Introduction

水の使用量の増加や水の使用に伴う環境問題により、農場や保育園の水のリサイクルがますます普及しています。植物病の広がりや発生を減らすために、生産者のために多くの灌漑方法が開発されています。水源(灌漑や降水量)に関係なく、流出が発生し、多くの野菜や保育園の生産者は、流出を収集し、リサイクルする池を持っています1.これは、再生水が作物2、3、43を灌漑するために使用される場合、病原体の広がりを支持2する可能性のある病原体蓄積のための貯水池を4作成します。動物園の胞子は水に蓄積し、一次分散胞子は自己運動性であるが、表面水55、6、76を必要とするので、Oomycete7植物病原体は、この練習の恩恵を特に受ける。フィトフトラカプシチは、異なる方法で、ナス類とキュビリット作物のかなりの数に影響を与えるオマイセテ病原体8.多くの場合、症状は苗、根とクラウンの腐敗の減衰です。しかし、キュウリ、スカッシュ、メロン、カボチャ、スイカ、ナス、コショウなどの作物では、果実腐敗9のために収穫全体が失われる可能性があります。この植物病原体を検出する方法は知られているが、ほとんどの感染は、任意の予防殺菌剤が有意な効果を有するには遅すぎる既に起こるために行われている10を必要とします。

標的微生物の検出と診断のための灌漑水をテストする従来の方法は、速度と感度が成功し、収益性の高い作物生産11、12,12に不可欠である時代遅れのアプローチです。標的病原体(例えば、P.カプシチのナス)に感染のために除去され、検査される前に長期間、灌漑池に吊り下げられる変性トラップに付着している植物組織(例えば、P.カプシチのナス)に付着している。次いで植物組織からのサンプルを半選択的培地(PARPH)上でめっきし、培養増殖のためにインキュベートし、次いで、複合顕微鏡13を用いて形態学的同定が行われる。他の植物病原体に対しても、選択的培地を用いて、少量の汚染水をめっきしてから、14,15,15をサブ培養する前に同様の検出方法がある。これらの方法は、2〜6週間の任意の場所、生物を分離するためのサブ培養のいくつかのラウンド、および各種の主要な形態学的文字を認識することができるようにフィトフトーラ診断上の経験を必要とする。これらの伝統的な方法は、水源にも存在する他の微生物による干渉などの要因により、P.カプシチによって汚染された灌漑水の検出にはうまく機能しません。ピシウム属細菌や水媒介細菌のような急速に成長している微生物は、P.カプシチを検出不能16、17,17にするプレート上で増殖する可能性があります。

本研究の目的は、灌漑水中のP.カプシチ動物園を検出するために、現場と実験室の両方の設定で使用できる敏感で特異的な分子法を開発することであった。このプロトコルは、P.カプシチの1121基対(bp)フラグメントに基づいて、P.カプシチを特異的に増幅することができる新規ループ媒介等温増幅(LAMP)プライマーセットの開発を含む、 P. capsici19.19Dong et al. (2015) から以前に開発された LAMP プライマーは、この研究のために開発されたアッセイと比較して使用されました20.

LAMPアッセイは、従来のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)21よりも迅速、感受性、および特異的であることが実証された比較的新しい分子検出形態である。一般に、従来のPCRアッセイでは500コピー(1.25 pg/μL)以下では検出できません。対照的に、以前の研究では、LAMPの感度は従来のPCRよりも10〜1,000倍高く、ゲノムDNA22,23,23の1fg/μLでも容易に検出できることが示されている。さらに、アッセイは、増幅のためのポータブル加熱ブロックと正のサンプルの色を変化させる着色色素(電気泳動の必要性を取り除く)を使用して、迅速に(多くの場合、30分)およびオンサイト(フィールド)を行うことができます。本研究では、フィルター抽出法を用いてPCRとLAMPアッセイの感度を比較した。提案された検出方法により、研究者および拡張剤は、異なる水源からのP.カプシシ胞子の存在を2時間以内に容易に検出することができる。このアッセイは、従来のPCRよりも感度が高く、栽培者が使用する灌漑水中の病原体の存在を検出することによってその時点で検証されました。この検出方法により、生産者は灌漑に使用されている様々な水源における病原体の存在と人口密度を推定し、壊滅的な発生や経済的損失を防ぐことができます。

Protocol

1. ポータブルループ媒介等温増幅を用いた灌漑水からの フィトフトーラカプシチ のオンサイト検出 ポンプとフィルターの設定 ハンドポンプに接続されたチューブにフィルターフラスコを取り付け、ポンプが作動したときに、濾過フラスコの口から空気が吸い込まれるようにします。 Buchner漏斗をゴム栓にろ過フラスコの口に合わせ、適切なサイズのろ紙をBuchner?…

Representative Results

LAMP法の最適化本研究では、ポータブルループ媒介等温増幅(LAMP)アッセイを用いて、灌漑水中の フィトフトーラカプシ の存在を検出した。まず、提案されたLAMPアッセイは、異なるLAMPプライマー濃度[F3、B3(それぞれ0.1〜0.5 μM)をテストすることによって最適化されました。LF、LB(各0.5~1.0 μM)およびFIP、BIP(0.8~2.4 μM)、持続時間(30~70分)、温度(55~70°C)この研究で使用された最?…

Discussion

植物病原体の灌漑水の試験は、灌漑池とリサイクル水27を使用して生産者にとって重要なステップです。灌漑池は、過剰な灌漑水が16、27存在している可能性のある病原体を運ぶ池にフィールドから向けられているように、植物病原体の数のための貯水池と27繁殖地を提供します。大きな水源における植物病原体の検出のための伝統…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、ジョージア州野菜商品委員会プロジェクトID# FP00016659の財政支援を受けました。著者らは、ピシェン・ジ博士(ジョージア大学)とオハイオ州立大学アン・ドランス博士に感謝し、 フィトフトーラ・スップの純粋な文化を提供してくれた。また、研究を通じて彼らの技術的支援のために李王とデロリス・ヴェニーに感謝します。

Materials

Agarose gel powder Thomas Scientific C997J85
Buchner funnel Southern Labware JBF003
Bullet Blender Next Advance BBX24
Centrifuge 5430 Eppendorf 22620509
Chloroform Fischer Scientific C298-500
CTAB solution Biosciences 786-565
Dneasy Extraction Kit Qiagen 69104
Filter Flask United FHFL1000
Filter Paper United Scientific Supplies FPR009
Gel Green 10000X Thomas Scientific B003B68 (1/EA)
Genie III OptiGene
Hand pump Thomas Scientific 1163B06
Iso-amyl Alcohol Fischer Scientific BP1150-500
LAVA LAMP master mix Lucigen 30086-1
Magnetic bead DNA extraction Genesig genesigEASY-EK
Magnetic Separator Genesig genesigEASY-MR
polyvinylpyrrolidone Sigma Aldrich PVP40-500G
Primers Sigma Aldrich
Prism Mini Centrifuge Labnet C1801
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
UV Gel Doc Analytik Jena 849-00502-2
Warmstart Colorimetric Dye Lucigen E1800m
Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell Bio-Rad 1704489EDU
70% isopropanol Fischer Scientific A451-1
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Riferimenti

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Keywords: Phytophthora CapsiciIrrigation WaterLoop-mediated Isothermal AmplificationPathogen DetectionDNA ExtractionFilter PaperMagnetic BeadsIrrigation Water ContaminationWaterborne Pathogen

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Hudson, O., Waliullah, S., Hand, J., Gazis-Seregina, R., Baysal-Gurel, F., Ali, M. E. Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification. J. Vis. Exp. (160), e61478, doi:10.3791/61478 (2020).
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