Nachweis von Phytophthora capsici im Bewässerungswasser mit Loop-Mediad Isothermale Amplifikation
Summary
Wir haben eine Methode entwickelt, um Phytophthora capsici zoospores in Wasserquellen mit einer Filterpapier-DNA-Extraktionsmethode in Verbindung mit einem schleifenvermittelten isothermen Amplifikationstest (LAMP) zu detektieren, der im Feld oder im Labor analysiert werden kann.
Abstract
Phytophthora capsici ist ein verheerender Oomycete-Erreger, der viele wichtige solanaceous und cucurbit Kulturen betrifft, die erhebliche wirtschaftliche Verluste in der Gemüseproduktion jährlich verursachen. Phytophthora capsici ist bodenbedingt und aufgrund seiner langlebigen Überlebensstrukturen (Oosporen und Chlamydosporen), die Witterung und Degradation widerstehen, ein anhaltendes Problem auf Gemüsefeldern. Die Hauptmethode der Dispersion ist durch die Herstellung von Zoosporen, die einzellig sind, flagellated Sporen, die durch dünne Wasserschichten auf Oberflächen oder in wassergefüllten Bodenporen schwimmen können und in Pfützen und Teichen ansammeln können. Daher können Bewässerungsteiche eine Quelle des Erregers und der Anfangspunkte von Krankheitsausbrüchen sein. Der Nachweis von P. capsici in Bewässerungswasser ist mit traditionellen kulturbasierten Methoden schwierig, da andere Mikroorganismen, die in der Umwelt vorkommen, wie Pythium spp., in der Regel P. capsici überwuchern, was es nicht nachweisbar macht. Um das Vorhandensein von P. capsici-Sporen in Wasserquellen (Bewässerungswasser, Abflusses usw.) zu bestimmen, haben wir ein Handpumpen-basiertes Filterpapier (8-10 m) entwickelt, das die Sporen des Erregers (Zoosporen) erfasst und später verwendet wird, um die DNA des Erregers durch eine neuartige, schleifenvermittelte isotherme isotherme Amplifikation (LAMP) zu verstärken. Diese Methode kann DNA aus einer Konzentration von bis zu 1,2 x 102 Zoosporen/ml verstärken und detektieren, was 40-mal empfindlicher ist als herkömmliche PCR. Bei der Prüfung eng verwandter Arten wurde keine Kreuzverstärkung erreicht. LAMP wurde auch mit einem kolorimetrischen LAMP-Master-Mix-Farbstoff durchgeführt, der Ergebnisse anzeigte, die mit bloßem Auge für die schnelle Erkennung vor Ort gelesen werden konnten. Dieses Protokoll könnte an andere Krankheitserreger angepasst werden, die sich über kontaminierte Bewässerungssysteme aufhalten, ansammeln oder dispergieren.
Introduction
Das Recycling von Wasser in landwirtschaftlichen Betrieben und Baumschulen wird aufgrund der steigenden Wasserkosten und der Umweltbedenken hinter der Wassernutzung immer beliebter. Viele Bewässerungsmethoden wurden für Züchter entwickelt, um die Ausbreitung und das Auftreten von Pflanzenkrankheiten zu reduzieren. Unabhängig von der Quelle des Wassers (Bewässerung oder Niederschlag) wird Abflusses erzeugt, und viele Gemüse- und Gärtnereien haben einen Teich, um Abflusses zu sammeln und zu recyceln1. Dadurch entsteht ein Reservoir für eine mögliche Anhäufung von Krankheitserregern, die die Ausbreitung von Krankheitserregern begünstigt, wenn das recycelte Wasser zur Bewässerung von Pflanzen2,3,4verwendet wird. Oomycete Pflanzenpathogene profitieren besonders von dieser Praxis, da Zoosporen sich im Wasser ansammeln und die primäre dispersive Sporen ist selbst-motil, erfordert aber Oberflächenwasser5,6,7. Phytophthora capsici ist ein Oomycete-Erreger, der eine erhebliche Anzahl von solanaceous und Cucurbit Kulturen in verschiedenenWeisen8 betrifft. Oft sind die Symptome Dämpfung von Sämlingen, Wurzel und Krone Fäulnis; Bei Kulturen wie Gurke, Kürbis, Melone, Kürbis, Wassermelone, Auberginen und Pfeffer können jedoch ganze Ernten durch Fruchtfäule verloren gehen9. Obwohl es bekannte Methoden zum Nachweis dieses Pflanzenerregers gibt, benötigen die meisten eine Infektion, die bereits stattgefunden hat, was zu spät ist, damit irgendwelche präventiven Fungizide eine signifikante Wirkung haben10.
Die traditionelle Methode, Bewässerungswasser für den Nachweis und die Diagnose von gezielten Mikroorganismen zu testen, ist ein antiquierter Ansatz, wenn Geschwindigkeit und Empfindlichkeit entscheidend für den Erfolg und profitable Pflanzenproduktion sind11,12. Pflanzengewebe, das für den gezielten Erreger empfänglich ist (z. B. Auberginen für P. capsici), wird an einer modifizierten Falle befestigt, die über einen längeren Zeitraum in einem Bewässerungsteich aufgehängt wird, bevor sie entfernt und auf Infektionen untersucht wird. Proben aus dem Pflanzengewebe werden dann auf semiselektiven Medien (PARPH) plattiert und für das Kulturwachstum inkubiert, dann wird die morphologische Identifizierung mit einem zusammengesetzten Mikroskop13durchgeführt. Es gibt andere ähnliche Nachweismethoden für andere Pflanzenpathogene, die selektive Medien verwenden und kleine Mengen kontaminierten Wassers plattieren, bevorsie 14,15sub-culturing sub-culturing. Diese Methoden erfordern zwischen 2 und 6 Wochen, mehrere Unterkultivierungsrunden, um den Organismus zu isolieren, und Erfahrung mit Phytophthora-Diagnostik, um die wichtigsten morphologischen Charaktere jeder Art erkennen zu können. Diese traditionellen Methoden eignen sich nicht gut für den Nachweis von Bewässerungswasser, das durch P. capsici aufgrund von Faktoren wie Interferenzen durch andere Mikroorganismen kontaminiert ist, die auch in den Wasserquellen vorhanden sind. Einige schnell wachsende Mikroorganismen wie Pythium spp. und wassergetragene Bakterien können auf der Platte überwuchern, so dass P. capsici nicht nachweisbar16,17.
Der Zweck dieser Studie war die Entwicklung einer empfindlichen und spezifischen molekularen Methode, die sowohl in Feld- als auch laboratoriumsspezifischen Umgebungen zum Nachweis von P. capsici Zoosporen im Bewässerungswasser verwendet werden kann. Das Protokoll beinhaltet die Entwicklung eines neuartigen schleifenvermittelten isothermen Amplifikations-Primers (LAMP)-Primers, das in der Lage ist, P. capsicispezifisch zu verstärken, basierend auf einem 1121-Basenpaar (bp) Fragment von P. capsici18,19. Ein zuvor entwickelter LAMP Primer von Dong et al. (2015) wurde im Vergleich zu dem für diese Studie entwickelten Test verwendet20.
Der LAMP-Assay ist eine relativ neue Form der molekularen Detektion, die nachweislich schneller, empfindlicher und spezifischer ist als herkömmliche Polymerase-Kettenreaktion (PCR)21. Im Allgemeinen können herkömmliche PCR-Assays nicht unter 500 Kopien (1,25 pg/l) erkennen; Im Gegensatz dazu haben frühere Studien gezeigt, dass die Empfindlichkeit von LAMP 10 bis 1.000 Mal höher sein kann als herkömmliche PCR und leicht sogar 1 fg/l genomische DNA22,23erkennen kann. Darüber hinaus kann der Test schnell (oft in 30 min) und vor Ort (im Feld) mit einem tragbaren Heizblock für die Verstärkung und einem kolorimetrischen Farbstoff durchgeführt werden, der die Farbe für eine positive Probe ändert (wodurch die Elektrophorese entfällt). In dieser Studie haben wir die Empfindlichkeit von PCR- und LAMP-Assays mit einer Filterextraktionsmethode verglichen. Die vorgeschlagene Nachweismethode ermöglicht es Forschern und Erweiterungsmitteln, das Vorhandensein von P. Capsici-Sporen aus verschiedenen Wasserquellen in weniger als zwei Stunden leicht zu erkennen. Der Test ist nachweislich empfindlicher als herkömmliche PCR und wurde vor Ort durch den Nachweis des Vorhandenseins des Erregers in dem von einem Züchter verwendeten Bewässerungswasser validiert. Diese Nachweismethode wird es den Züchtern ermöglichen, das Vorhandensein und die Populationsdichte des Erregers in verschiedenen Wasserquellen zu schätzen, die für die Bewässerung verwendet werden, wodurch verheerende Ausbrüche und wirtschaftliche Verluste verhindert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Prüfung von Bewässerungswasser auf Phytopathogene ist ein entscheidender Schritt für Züchter, die Bewässerungsteiche und recyceltes Wasser verwenden27. Bewässerungsteiche bieten ein Reservoir und Brutplatz für eine Reihe von Phytopathogenen, da überschüssiges Bewässerungswasser vom Feld zum Teich geleitet wird, der alle Krankheitserreger mit sich führt, die möglicherweise vorhanden waren16,27. Die traditionelle Methode zum …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit erhielt die finanzielle Unterstützung der Georgia Commodity Commission for Vegetables Projekt ID- FP00016659. Die Autoren danken Dr. Pingsheng Ji, University of Georgia und Dr. Anne Dorrance, Ohio State University für die Bereitstellung reiner Kulturen von Phytophthora spp. Wir danken auch Li Wang und Deloris Veney für ihre technische Unterstützung während der gesamten Studie.
Materials
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
Riferimenti
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