Påvisning av Phytophthora capsici i vanning vanning vann ved hjelp av Loop-mediert isotermisk forsterkning
Summary
Vi utviklet en metode for å oppdage Phytophthora capsici zoospores i vannkilder ved hjelp av en filterpapir DNA ekstraksjon metode kombinert med en loop-mediert isothermal forsterkning (LAMP) analyse som kan analyseres i feltet eller i laboratoriet.
Abstract
Phytophthora capsici er et ødeleggende oomycete patogen som påvirker mange viktige solanaceous og cucurbit avlinger forårsaker betydelige økonomiske tap i vegetabilsk produksjon årlig. Phytophthora capsici er jordbåren og et vedvarende problem i vegetabilske felt på grunn av sine langvarige overlevelsesstrukturer (oospores og klamydospores) som motstår forvitring og nedbrytning. Den viktigste metoden for spredning er gjennom produksjon av dyrespores, som er encellede, flagellated sporer som kan svømme gjennom tynne filmer av vann tilstede på overflater eller i vannfylte jordporer og kan akkumuleres i pytter og dammer. Derfor kan vanningsdammer være en kilde til patogenet og de første punktene av sykdomsutbrudd. Påvisning av P. capsici i vanning vanning vann er vanskelig å bruke tradisjonelle kulturbaserte metoder fordi andre mikroorganismer tilstede i miljøet, for eksempel Pythium spp., vanligvis overgrow P. capsici gjør det umulig å oppdage. For å bestemme tilstedeværelsen av P. capsici sporer i vannkilder (vanning vann, avrenning, etc.), utviklet vi en håndpumpebasert filterpapir (8-10 μm) metode som fanger patogenets sporer (zoospores) og brukes senere til å forsterke patogenets DNA gjennom en ny loop-mediert isotermisk forsterkning (LAMP) analyse designet for den spesifikke forsterkningen av P. capsici. Denne metoden kan forsterke og oppdage DNA fra en konsentrasjon så lavt som 1,2 x 102 zoospores / ml, som er 40 ganger mer følsom enn konvensjonell PCR. Ingen kryssforsterkning ble oppnådd ved testing av nært beslektede arter. LAMP ble også utført ved hjelp av en kolorimetrisk LAMP master mix fargestoff, viser resultater som kan leses med det blotte øye for rask deteksjon på stedet. Denne protokollen kan tilpasses andre patogener som bor, akkumuleres eller spres via forurensede vanningssystemer.
Introduction
Resirkulering av vann i gårder og barnehager blir stadig mer populært på grunn av økningen i vannkostnader og miljøhensyn bak vannforbruket. Mange vanningsmetoder er utviklet for dyrkere for å redusere spredningen og forekomsten av plantesykdom. Uavhengig av kilden til vannet (vanning eller nedbør), genereres avrenning, og mange grønnsaks- og barnehagedyrkere har en dam å samle og resirkulere avrenning1. Dette skaper et reservoar for mulig patogenakkumulering som favoriserer spredningen av patogener når resirkulert vann brukes til å vanneavlinger 2,,3,,4. Oomycete plante patogener spesielt dra nytte av denne praksisen som zoospores vil akkumuleres i vann og den primære dispersive spore er selvmotil, men krever overflatevann5,,6,,7. Phytophthora capsici er et oomycete patogen som påvirker et betydelig antall solanaceous og cucurbit avlinger på forskjellige måter8. Ofte er symptomene demping av frøplanter, rot og kroneråte; Men i avlinger som agurk, squash, melon, gresskar, vannmelon, aubergine og pepper, kan hele avlinger gå tapt på grunn av fruktråte9. Selv om det finnes kjente metoder for å oppdage dette plantepatogenet, krever de fleste en infeksjon som allerede har funnet sted, noe som er for sent for at forebyggende soppmidler har en betydelig effekt10.
Den tradisjonelle metoden for å teste vanningsvann for deteksjon og diagnose av målrettede mikroorganismer er en foreldet tilnærming når hastighet og følsomhet er avgjørende for suksess og lønnsom avlingsproduksjon11,,12. Plantevev utsatt for det målrettede patogenet (f.eks. aubergine for P. capsici) er festet til en modifisert felle som er suspendert i en vanningsdam i lengre periode før den fjernes og inspiseres for infeksjon. Prøver fra plantevevet blir deretter belagt på halvselektive medier (PARPH) og inkubert for kulturvekst, deretter utføres morfologisk identifikasjon ved hjelp av et sammensatt mikroskop13. Det finnes andre lignende deteksjonsmetoder for andre plantepatogener ved hjelp av selektive medier og plating små mengder forurenset vann før sub-culturing14,15. Disse metodene krever alt fra 2 til 6 uker, flere runder med sub-culturing for å isolere organismen, og erfaring på Phytophthora diagnostikk for å kunne gjenkjenne de viktigste morfologiske tegnene til hver art. Disse tradisjonelle metodene fungerer ikke godt for påvisning av vanningsvann forurenset av P. capsici på grunn av faktorer som interferens av andre mikroorganismer som også finnes i vannkildene. Noen raskt voksende mikroorganismer som Pythium spp. og vannbårne bakterier kan overgrow på platen gjør P. capsici undetectable16,17.
Formålet med denne studien var å utvikle en sensitiv og spesifikk molekylær metode som kan brukes i både felt- og laboratorieinnstillinger for å oppdage P. capsici zoospores i vanningsvann. Protokollen inkluderer utvikling av en ny loop-mediert isotermisk forsterkning (LAMP) primer satt i stand til å spesifikt forsterke P. capsici, basert på en 1121-base par (bp) fragment av P. capsici18,19. En tidligere utviklet LAMP primer fra Dong et al. (2015) ble brukt i forhold til analysen som ble utviklet for denne studien20.
LAMP-analysen er en relativt ny form for molekylær deteksjon som har vist seg å være raskere, følsom og spesifikk enn konvensjonell polymerasekjedereaksjon (PCR)21. Generelt kan ikke konvensjonelle PCR-analyser oppdages under 500 kopier (1,25 pg/μL); I motsetning har tidligere studier vist at følsomheten til LAMP kan være 10 til 1000 ganger høyere enn konvensjonell PCR og kan lett oppdage selv 1 fg / μL genomisk DNA22,23. I tillegg kan analysen utføres raskt (ofte i 30 min) og på stedet (i feltet) ved hjelp av en bærbar varmeblokk for forsterkning og et kolorimetrisk fargestoff som endrer farge for en positiv prøve (fjerne behovet for elektroforese). I denne studien sammenlignet vi følsomheten til PCR- og LAMP-analyser ved hjelp av en filterekstraksjonsmetode. Den foreslåtte deteksjonsmetoden gjør det mulig for forskere og utvidelsesmidler å enkelt oppdage tilstedeværelsen av P. capsici sporer fra forskjellige vannkilder på mindre enn to timer. Analysen er bevist å være mer følsom enn konvensjonell PCR og ble validert in situ ved å oppdage tilstedeværelsen av patogenet i vanningsvannet som brukes av en dyrker. Denne påvisningsmetoden vil tillate dyrkere å estimere tilstedeværelsen og befolkningstettheten til patogenet i ulike vannkilder som brukes til vanning, og forhindrer ødeleggende utbrudd og økonomiske tap.
Protocol
Representative Results
Discussion
Testing av vanning vann for fytopathogens er et avgjørende skritt for dyrkere ved hjelp av vanning dammer og resirkulert vann27. Vanning dammer gir et reservoar og avlsmiljø for en rekke fytopatogener som overflødig vanning vanning vann er rettet fra feltet til dammen bærer med seg noen patogener som kan ha vært tilstede 16,27. Den tradisjonelle metoden for påvisning av plantepatogener i en stor vannkilde er å sette en agn for patog…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet fikk økonomisk støtte fra Georgia Commodity Commission for Vegetables prosjekt ID # FP00016659. Forfatterne takker Dr. Pingsheng Ji, University of Georgia og Dr. Anne Dorrance, Ohio State University for å gi rene kulturer av Phytophthora spp. Vi takker også Li Wang og Deloris Veney for deres tekniske hjelp gjennom hele studien.
Materials
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
Riferimenti
- Hong, C., Moorman, G. J. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).
- Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater. Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).
- Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system. Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).
- Ghimire, S. R., et al. Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months. Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).
- Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).
- Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water. Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).
- Thomson, S., Allen, R. Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water. Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Sanogo, S., Ji, P. Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops. Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).
- Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water. Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).
- Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).
- Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
- Wang, Z., et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).
- Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan). Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).
- Pringsh, P. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants. Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).
- Stewart-Wade, S. M. Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management. Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).
- Aragaki, M., Uchida, J. Y. Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov. Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).
- Tomlinson, J., Boonham, N. Potential of LAMP for detection of plant pathogens. CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).
- Li, P., et al. A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici. Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).
- Dong, Z., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici. Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).
- Khan, M., et al. Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani. Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).
- Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods. Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).
- Waliullah, S., et al. Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry. PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).
- Böhm, J., et al. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).
- Klimczak, L., Prell, H. J. C. Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans. Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).
- Ghimire, S. R., et al. Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter. Phytopathology. 96 (6), (2006).
- Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields. Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).
- Aglietti, C., et al. Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection. AMB Express. 9 (1), 50 (2019).
- Almasi, M. A. Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).
- Gill, D. J. Pathogenic Pythium from irrigation ponds. Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).
