Systemanalys av det neuroinflammatoriska och hemodynamiska svaret på traumatisk hjärnskada
Summary
Detta protokoll presenterar metoder för att karakterisera det neuroinflammatoriska och hemodynamiska svaret på mild traumatisk hjärnskada och för att integrera dessa data som en del av en multivariat systemanalys med partiell minsta kvadratregression.
Abstract
Milda traumatiska hjärnskador (mTBI) är ett betydande folkhälsoproblem. Upprepad exponering för mTBI kan leda till kumulativa, långvariga funktionella underskott. Många studier av vår grupp och andra har visat att mTBI stimulerar cytokinuttryck och aktiverar mikroglia, minskar cerebralt blodflöde och metabolism och försämrar cerebrovaskulär reaktivitet. Dessutom har flera verk rapporterat en koppling mellan störningar i dessa neuroinflammatoriska och hemodynamiska markörer och kognitiva funktionsnedsättningar. Här beskriver vi metoder för att karakterisera det neuroinflammatoriska och hemodynamiska vävnadssvaret på mTBI hos möss. Specifikt beskriver vi hur man utför en viktminskningsmodell av mTBI, hur man i längdriktningen mäter cerebralt blodflöde med hjälp av en icke-invasiv optisk teknik som kallas diffus korrelationsspektroskopi och hur man utför en Luminex multiplexerad immunanalys på hjärnvävnadsprover för att kvantifiera cytokiner och immunmodulerande fosfoproteiner (t.ex. inom MAPK- och NFκB-vägarna) som svarar på och reglerar aktiviteten hos mikroglia och andra neurala immunceller. Slutligen beskriver vi hur man integrerar dessa data med hjälp av en multivariat systemanalysmetod för att förstå relationerna mellan alla dessa variabler. Att förstå relationerna mellan dessa fysiologiska och molekylära variabler kommer i slutändan att göra det möjligt för oss att identifiera mekanismer som är ansvariga för mTBI.
Introduction
Överblick
Milda traumatiska hjärnskador (mTBI) påverkar ~ 1.6-3.8 miljoner idrottare årligen1. Dessa skador, inklusive sub-hjärnskakning och hjärnskakningsskador, kan lämna patienter med övergående fysiska, emotionella, psykologiska och kognitiva symtom2. Dessutom kan repetitiv mTBI (rmTBI) som upprätthålls inom ett “sårbarhetsfönster” leda till kumulativ svårighetsgrad och varaktighet av kognitiva konsekvenser som varar längre än effekterna av en enda mTBI ensam3, och i slutändan även till permanent funktionsförlust 4,5,6. Även om många patienter återhämtar sig inom en relativt kort tidsram ( 1 månad, med några som varar upp till 1 år 3,7,8,9. Trots den höga förekomsten och de varaktiga konsekvenserna av dessa skador är skademekanismerna dåligt förstådda och inga effektiva behandlingsstrategier finns.
Med tanke på den höga variationen i resultat efter mTBI /rmTBI är en utmaning när det gäller att identifiera molekylära triggers i tidigt stadium från vävnad erhållen i terminala mTBI/rmTBI-studier bristen på longitudinella data som visar definitiva “akuta molekylära länkar” av dessa molekylära triggers till långsiktiga resultat. För att övervinna denna utmaning har vår grupp upptäckt att akut minskat cerebralt blodflöde mätt akut med hjälp av ett optiskt verktyg som kallas diffus korrelationsspektroskopi (DCS), starkt korrelerar med långsiktigt kognitivt resultat i en musmodell av rmTBI10. Med hjälp av denna hemodynamiska biomarkör visade vi att möss med akut lågt cerebralt blodflöde (och i förlängningen sämre förutsagt långsiktigt resultat) har samtidiga akuta ökningar av neuronal fosfosignalering inom både MAPK- och NFκB-vägar, ökningar i neuronalt uttryck av proinflammatoriska cytokiner och ökningar i uttrycket av fagocyten /mikrogliamarkören Iba111 . Dessa data tyder på en möjlig roll för neuronal fosfo-signalering, cytokinuttryck och mikrogliaaktivering i både akut reglering av cerebralt blodflöde efter skada samt för att utlösa en signalkaskad som leder till neuronal dysfunktion och sämre kognitivt resultat. Här beskriver vi vårt tillvägagångssätt för att samtidigt undersöka både den hemodynamiska och neuroinflammatoriska miljön efter rmTBI och hur man integrerar dessa komplexa dataset. Specifikt beskriver vi förfaranden för fyra viktiga steg i detta övergripande tillvägagångssätt: (1) en viktminskningsmodell av mild traumatisk hjärnskada, (2) bedömning av cerebralt blodflöde med diffus korrelationsspektroskopi, (3) kvantifiering av den neuroinflammatoriska miljön och (4) dataintegration (figur 1). Nedan ger vi en kort introduktion till vart och ett av dessa viktiga steg för att hjälpa läsarna genom motiveringen bakom våra metoder. Resten av manuskriptet ger ett detaljerat protokoll för vart och ett av dessa nyckelsteg.
Viktminskningsmodell av mild traumatisk hjärnskada
Även om många utmärkta prekliniska modeller av repetitiv mild TBI finns 12,13,14,15,16,17,18, använder vi en väletablerad och kliniskt relevant viktfallsmodell för sluten huvudskada. Viktiga funktioner i denna modell inkluderar (1) trubbig påverkan av den intakta skallen / hårbotten följt av obegränsad rotation av huvudet runt nacken, (2) ingen öppen strukturell hjärnskada, ödem, blod-hjärnbarriärskador, akut celldöd eller kronisk hjärnvävnadsförlust och (3) ihållande (upp till 1 år) kognitiva underskott som uppstår först efter flera träffar19 (Figur 2).
Bedömning av cerebralt blodflöde med diffus korrelationsspektroskopi
Diffus korrelationsspektroskopi (DCS) är en icke-invasiv optisk teknik som mäter blodflödet 5,20,21. I DCS placeras en nära infraröd ljuskälla på vävnadsytan. En detektor placeras på ett fast avstånd från källan på vävnadsytan för att detektera ljus som har förökat sig genom vävnaden (Figur 3). Spridning av rörliga röda blodkroppar gör att den detekterade ljusintensiteten fluktuerar med tiden. En enkel analytisk modell som kallas korrelationsdiffusionsteori används för att relatera dessa intensitetsfluktuationer till ett index för blodflödet (CBFi, figur 4). Även om enheterna av CBFi (cm2 / s) inte är de traditionella flödesenheterna (ml / min / 100 g), har en tidigare studie på möss visat att CBFi starkt korrelerar med cerebralt blodflöde mätt med arteriell spin märkt MRI21.
Som referens byggdes DCS-instrumentet som används här internt och består av en 852 nm lång koherenslängdslaser, en uppsättning av 4 fotonräknande lavinfotodioder och ett hårdvaruautokorrelatorkort (enkel tau, 8 kanal, 100 ns minsta provtid)21,22. Data förvärvas med hemlagad programvara skriven i LabView. Djurgränssnittet för enheten består av en 400 μm multimode källfiber (400-2200 nm våglängdsområde, ren kiseldioxidkärna, TECS Hard Cladding) och en 780 nm enkellägesdetektorfiber (780-970 nm våglängdsområde, ren kiseldioxidkärna, TECS Hard Cladding, 730 ± 30 nm andra lägesavstängning) åtskilda 6 mm från varandra och inbäddade i en svart 3D-tryckt sensor (4 mm x 8 mm, Figur 3).
Kvantifiering av den neuroinflammatoriska miljön
Även om neuroinflammation regleras av olika cellulära processer, är två viktiga relevanta mekanismer extracellulär signalering av cytokiner / kemokiner och intracellulär signalering av fosfoproteiner. För att undersöka hjärnans neuroinflammatoriska miljö efter skada extraheras hjärnor från möss, mikrodissekeras och cytokiner / kemokiner och fosfoproteiner kvantifieras med luminex (figur 5, figur 6, figur 7). Luminex multiplexerade immunanalyser möjliggör samtidig kvantifiering av en mångsidig samling av dessa proteiner genom att koppla enzymbundna immunosorbentanalyser (ELISA) till fluorescerande märkta magnetiska pärlor. Distinkta fluorescerande taggar används för varje protein av intresse, och pärlor av varje tagg funktionaliseras med en fångstantikropp mot det specifika proteinet. Hundratals pärlor för att fånga varje protein blandas ihop, placeras i en 96 brunnsplatta och inkuberas med prov. Efter provinkubation används en magnet för att fånga pärlorna i brunnen medan provet tvättas ut. Därefter binder biotinylerad detektionsantikropp till analyten av intresse för att bilda en antikropps-antigensmörgås som liknar en traditionell ELISA, men med ELISA för varje protein som förekommer på en annan fluorescerande märkt pärla. Tillsats av fykoerytrinkonjugerad streptavidin (SAPE) fullbordar varje reaktion. Luminex-instrumentet läser sedan pärlorna och separerar signalen enligt varje fluorescerande tagg / protein.
Dataintegrering
På grund av det stora antalet analyter (t.ex. cytokiner) som mäts i Luminex-analysen kan dataanalys vara svår att tolka om varje kvantifierat protein analyseras individuellt. För att förenkla analysen och fånga trender som observerats bland analyter använder vi en multivariat analysmetod som kallas partiell minsta kvadratregression (PLSR, figur 8)23. PLSR fungerar genom att identifiera en viktaxel som motsvarar varje uppmätt protein (dvs. cytokiner eller fosfoproteiner, kallade “prediktorvariabler”) som tillsammans optimalt förklarar samvariansen mellan de uppmätta proteinerna med en svarsvariabel (t.ex. cerebralt blodflöde). Vikterna kallas “lastningar” och monteras i en vektor som kallas en latent variabel (LV). Genom att projicera (kallad “scoring”) de uppmätta proteindata på var och en av två LV kan data ritas om i termer av dessa LV. Efter beräkning av PLSR använder vi en varimaxrotation för att identifiera en ny LV som maximerar kovariansen mellan provprojektionerna på LV och prediktorvariabeln24. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för oss att definiera LV1 som den axel för vilken variansen för svarsvariabeln bäst förklaras. LV2 maximerar samvariansen mellan responsvariabeln och LV1-restdata, vilket kan vara förknippat med biologisk eller teknisk variation mellan prover. Slutligen genomför vi en Leave One Out Cross Validation (LOOCV) för att säkerställa att PLSR-modellen inte är starkt beroende av något prov23.
I detta protokoll beskriver vi metoder för att karakterisera det neuroinflammatoriska och hemodynamiska vävnadssvaret på mTBI. Det allmänna arbetsflödet beskrivs i figur 1. I detta protokoll utsätts möss för en eller flera mTBI med hjälp av en viktfallsmodell med sluten huvudskada. Cerebralt blodflöde mäts i längdriktningen före och vid flera tidpunkter efter skada. Vid tidpunkten för intresse för förhör av neuroinflammatoriska förändringar avlivas djuret och hjärnan extraheras. Hjärnregioner av intresse isoleras via mikrodissektion och lyseras sedan för att extrahera protein. Lysater används sedan för både Luminex multiplexerade immunanalyser av cytokin och fosfo-proteinuttryck samt Western blot. Slutligen integreras denna holistiska datauppsättning med hjälp av en partiell regressionsanalys med minsta kvadrat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi metoder för bedömning av det hemodynamiska och neuroinflammatoriska svaret på repetitiv mild traumatisk hjärnskada. Vidare har vi visat hur man integrerar dessa data som en del av en multivariat systemanalys med partiell minsta kvadratregression. I texten nedan kommer vi att diskutera några av de viktigaste stegen och begränsningarna i samband med protokollet samt fördelarna / nackdelarna med metoderna jämfört med befintliga metoder.
Viktminskningsmodell av m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta projekt stöddes av National Institutes of Health R21 NS104801 (EMB) och R01 NS115994 (LBW / EB) och Children’s Healthcare of Atlanta Junior Faculty Focused Award (EMB). Detta arbete stöddes också av det amerikanska försvarsdepartementet genom congressionally Directed Medical Research Programs under Award No. W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB). Åsikter, tolkningar, slutsatser och rekommendationer är författarens och stöds inte nödvändigtvis av försvarsdepartementet. Detta material är baserat på arbete som stöds av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant No. 1937971. Alla åsikter, resultat och slutsatser eller rekommendationer som uttrycks i detta material är författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis National Science Foundations åsikter.
Materials
| Adjustable pipettes | any adjustable pipette | ||
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Bio-Plex cell lysis kit | C Bio-Rad | 171304012 | |
| BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile | BrandTech | 781602 96 | |
| Complete mini protease inhibitor tablet | Sigma-Aldrich | 11836153001 | |
| Depilatory cream | Amazon | Nair | |
| DiH2O | VWR | VWRL0200-1000 | |
| Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates | Millipore Sigma Catalogue | 40-285 | |
| Hardware Autocorrelator Board | www.correlator.com | Flex05-8ch | |
| Isoflurane 250 mL | MED-VET INTERNATIONAL | RXISO-250 | |
| Kimwipe (11.2 x 21.3 cm) | VWR | 21905-026 | |
| Laboratory vortex mixer | VWR | 10153-838 | |
| LabView | National Instruments | LabVIEW | |
| Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software | Luminex Corporation | ||
| Luminex Drive Fluid | Luminex | MPXDF-4PK | |
| Luminex sheath fluid | EMD Millipore | SHEATHFLUID | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel – Premixed 32 Plex – Immunology Multiplex Assay | Millipore Sigma | MCYTMAG-70K-PX32 | |
| MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay | Millipore Sigma | 48-660MAG | |
| Mini LabRoller rotator | VWR | 10136-084 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626-1G | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | VWR | 97064-158 | |
| Plate Sealer | VWR | 82050-992 | |
| Polypropylene microfuge tubes | VWR | 20901-547 | |
| Mini LabRoller | Millipore Sigma | Z674591 | |
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-668 | |
| R Programming Language | |||
| RStudio | www.rstudio.com | ||
| Sonicator | |||
| Titer plate shaker | VWR | 12620-926 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| 1 m acrylic guide tube | McMaster-Carr | 49035K85 | |
| 4 photon counting avalanche photodiode | Perkin-Elmer | SPCM-AQ4C-IO | |
| 400 um multimode source fiber | Thorlabs Inc. | FT-400-EMT | |
| 54 g bolt | Ace Hardware | 0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length | |
| 780 nm single mode detector fiber | Thorlabs Inc. | 780HP | |
| 852 nm long-coherence length laser | TOPTICA Photonics | iBeam smart |
Riferimenti
- Langlois, J. A., Rutland-Brown, W., Wald, M. M. The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview. Journal of Head Trauma Rehabilitation. 21 (5), 375-378 (2006).
- Iraji, A., et al. Resting State Functional Connectivity in Mild Traumatic Brain Injury at the Acute Stage: Independent Component and Seed-Based Analyses. Journal of Neurotrauma. 32 (14), 1031-1045 (2015).
- Guskiewicz, K. M., et al. Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study. Journal of the American Medical Association. 290 (19), 2549-2555 (2003).
- Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
- Committee on Sports-Related Concussions in Youth, Board on Children, Youth, and Families, Institute of Medicine, National Research Council. . Sports-Related Concussions in Youth: Improving the Science, Changing the Culture. , (2014).
- Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. The Molecular Pathophysiology of Concussive Brain Injury – an Update. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 27 (2), 373-393 (2016).
- McCrory, P., et al. Consensus statement on concussion in sport–the 4th International Conference on Concussion in Sport held in Zurich, November 2012. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (2), 89-117 (2012).
- Belanger, H. G., Vanderploeg, R. D., Curtiss, G., Warden, D. L. Recent neuroimaging techniques in mild traumatic brain injury. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences. 19 (1), 5-20 (2007).
- Sours, C., Zhuo, J., Roys, S., Shanmuganathan, K., Gullapalli, R. P. Disruptions in Resting State Functional Connectivity and Cerebral Blood Flow in Mild Traumatic Brain Injury Patients. PLoS ONE. 10 (8), 0134019 (2015).
- Buckley, E. M., et al. Decreased Microvascular Cerebral Blood Flow Assessed by Diffuse Correlation Spectroscopy after Repetitive Concussions in Mice. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (12), 1995-2000 (2015).
- Sankar, S. B., et al. Low cerebral blood flow is a non-invasive biomarker of neuroinflammation after repetitive mild traumatic brain injury. Neurobiology of Disease. 124, 544-554 (2019).
- Vagnozzi, R., et al. Temporal window of metabolic brain vulnerability to concussions: mitochondrial-related impairment–part I. Neurosurgery. 61, 379-388 (2007).
- Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56, 364-374 (2005).
- Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage. Journal of Neurotrauma. 29, 2172-2180 (2012).
- Angoa-Perez, M., et al. Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between preclinical research and clinical reality. Journal of Neurochemistry. 129, 916-931 (2014).
- Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. A. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Developmental Neuroscience. 32, 510-518 (2010).
- Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Saljo, A. Concussion in professional football: animal model of brain injury–part 15. Neurosurgery. 64, 1162-1173 (2009).
- Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).
- Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing Recovery Time Between Injuries Improves Cognitive Outcome After Repetitive Mild Concussive Brain Injuries in Mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-892 (2012).
- Durduran, T., Yodh, A. G. Diffuse correlation spectroscopy for non-invasive, micro-vascular cerebral blood flow measurement. NeuroImage. 85, 51-63 (2014).
- Sathialingam, E., et al. Small separation diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow in rodents. Biomedical Optics Express. 9 (11), 5719 (2018).
- Lee, S. Y., et al. Noninvasive optical assessment of resting-state cerebral blood flow in children with sickle cell disease. Neurophotonics. 6 (03), 1 (2019).
- Wang, H., Liu, Q., Tu, Y. Interpretation of partial least-squares regression models with VARIMAX rotation. Partial Least Squares. 48 (1), 207-219 (2005).
- Eriksson, L., Byrne, T., Johansson, E., Trygg, J., Vikström, C. Multi- and Megavariate Data Analysis Basic Principles and Applications. Umetrics Academy. , (2013).
- Conzen, P. F., et al. Systemic and regional hemodynamics of isoflurane and sevoflurane in rats. Anesthesia and Analgesia. 74 (1), 79-88 (1992).
- Durduran, T., Choe, R., Baker, W. B., Yodh, A. G. Diffuse optics for tissue monitoring and tomography. Reports on Progress in Physics. 73 (7), 076701 (2010).
- Lee, S. Y., et al. Small separation frequency-domain near-infrared spectroscopy for the recovery of tissue optical properties at millimeter depths. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5362-5377 (2019).
- . plsRglm: Partial Least Squares Regression for Generalized Linear Models Available from: https://CRAN.R-project.org/package=pplsRglm (2019)
- White, B. R., Bauer, A. Q., Snyder, A. Z., Schlaggar, B. L., Lee, J. M., Culver, J. P. Imaging of functional connectivity in the mouse brain. PLoS One. 6, 16322 (2011).
- Buckley, E. M., Parthasarathy, A. B., Grant, P. E., Yodh, A. G., Franceschini, M. A. Diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow: future prospects. Neurophotonics. 1 (1), 011009 (2014).
- Rowan, O., et al. Cerebrovascular reactivity measured in awake mice using diffuse correlation spectroscopy. Neurophotonics. 8 (1), (2021).
- Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist. Reviews. 25 (2), 105-120 (2004).
- Staples, E., Ingram, R. J. M., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
- Gierut, J. J., et al. Network-level effects of kinase inhibitors modulate TNF-α-induced apoptosis in the intestinal epithelium. Science Signaling. 8 (407), 129 (2015).
