外傷性脳損傷に対する神経炎症および血行動態応答のシステム解析
Summary
このプロトコルは、軽度の外傷性脳損傷に対する神経炎症性および血行力学的応答を特徴付け、部分最小二乗回帰を用いた多変量系分析の一部としてこれらのデータを統合する方法を提示する。
Abstract
軽度の外傷性脳損傷(mTBI)は、重大な公衆衛生上の問題である。mTBIへの反復曝露は、累積的で長期的な機能的欠損につながる可能性がある。私たちのグループや他のグループによる多くの研究は、mTBIがサイトカイン発現を刺激し、ミクログリアを活性化し、脳血流と代謝を減少させ、脳血管反応性を損なうことを示しています。さらに、いくつかの研究は、これらの神経炎症および血行動態マーカーにおける狂乱と認知障害との関連を報告している。本明細書では、マウスにおけるmTBIに対する神経炎症性および血行動態組織応答を特徴付ける方法を詳述する。具体的には、mTBIの重量減少モデルを実行する方法、びまん性相関分光法と呼ばれる非侵襲的光学技術を用いて脳血流を縦方向に測定する方法、およびミクログリアおよび他の神経免疫細胞の活性に応答し調節するサイトカインおよび免疫調節リンタンパク質(例えば、MAPKおよびNFκB経路内)を定量するために、脳組織サンプルに対してルミネックス多重免疫アッセイを実行する方法について説明する。最後に、多変量システム分析アプローチを使用してこれらのデータを統合して、これらすべての変数間の関係を理解する方法を詳しく説明します。これらの生理学的変数と分子変数の関係を理解することで、最終的にはmTBIの原因となるメカニズムを同定することができます。
Introduction
概要
軽度の外傷性脳損傷(mTBI)は、年間約160万人から380万人のアスリートに影響を与えます1.副脳震盪および脳震盪傷害を含むこれらの傷害は、患者に一時的な身体的、感情的、心理的および認知的症状を残す可能性がある2。さらに、「脆弱性の窓」内で持続する反復的なmTBI(rmTBI)は、単一のmTBI単独の影響よりも長く続く認知的結果の累積的な重症度および持続時間をもたらし得3、そして最終的には機能の永久的な喪失につながることさえある4,5,6。多くの患者は比較的短い時間枠(苦しみ、一部は1年まで持続する3、7、8、9。これらの傷害の高い有病率および永続的な結果にもかかわらず、傷害メカニズムはほとんど理解されておらず、効果的な治療戦略は存在しない。
mTBI/rmTBI後の転帰のばらつきが大きいことを考えると、末端mTBI/rmTBI研究で得られた組織から初期段階の分子トリガーを同定する際の課題の1つは、これらの分子トリガーの長期的な転帰への決定的な「急性分子リンク」を実証する縦断的データの欠如である。この課題を克服するために、我々のグループは、びまん性相関分光法(DCS)と呼ばれる光学ツールを使用して急性に測定された脳血流の急性減少が、rmTBI10のマウスモデルにおける長期的な認知転帰と強く相関することを発見した。この血行動態バイオマーカーを用いて、我々は、脳血流が極端に低いマウス(および、拡張により、より悪い予測された長期転帰)を有するマウスが、MAPKおよびNFκB経路の両方におけるニューロンホスホシグナル伝達の急性増加、炎症誘発性サイトカインのニューロン発現の増加、および貪食細胞/ミクログリアマーカーIba111の発現の増加を有することを示した。.これらのデータは、ニューロンホスホシグナル伝達、サイトカイン発現、およびミクログリア活性化が、傷害後の脳血流の急性調節と、ニューロン機能障害および認知転帰の悪化につながるシグナル伝達カスケードの誘発の両方において、可能な役割を示唆している。ここでは、rmTBI後の血行動態と神経炎症の両方の環境を同時にプローブするアプローチと、これらの複雑なデータセットを統合する方法を詳述します。具体的には、(1)軽度の外傷性脳損傷の重量減少モデル、(2)びまん性相関分光法による脳血流の評価、(3)神経炎症環境の定量化、(4)データ統合(図1)の4つの重要なステップの手順を概説する。以下では、これらの重要なステップのそれぞれを簡単に紹介し、読者に私たちの方法の背後にある理論的根拠を導くのに役立ちます。原稿の残りの部分では、これらの重要なステップのそれぞれについて詳細なプロトコルを提供しています。
軽度外傷性脳損傷の体重減少モデル
反復軽度のTBIの多くの優れた前臨床モデルが存在するが、12,13,14,15,16,17,18、我々は十分に確立され、臨床的に関連する体重減少閉鎖性頭部損傷モデルを採用している。このモデルの主な特徴には、(1)無傷の頭蓋骨/頭皮の鈍い衝撃に続いて首周りの頭部の無制限の回転、(2)明白な構造的脳損傷、浮腫、血液脳関門損傷、急性細胞死、または慢性脳組織喪失、および(3)複数回のヒット後にのみ現れる持続性(最大1年)認知障害19(図2)が含まれる。
びまん性相関分光法による脳血流の評価
びまん性相関分光法(DCS)は、血流5、20、21を測定する非侵襲的な光学技術です。DCSでは、近赤外光源を組織表面に配置する。検出器を組織表面の光源から一定の距離に配置して、組織を透過して散乱した光を検出します(図3)。移動する赤血球を散乱させると、検出された光強度が時間とともに変動します。相関拡散理論として知られる単純な分析モデルを使用して、これらの強度変動を血流の指標に関連付ける(CBFi、図4)。CBF i(cm2/s)の単位は従来の流れの単位(mL/min/100g)ではないが、マウスでの以前の研究では、CBFiが動脈スピン標識MRI 21によって測定された脳血流と強く相関することが示されている。
参考までに、ここで使用したDCS機器は社内で製造されたもので、長さ852nmのコヒーレンス長レーザ、4光子カウントアバランシェフォトダイオードのアレイ、およびハードウェア自己相関器ボード(シングルタウ、8チャネル、100ns最小サンプル時間)21,22で構成されています。データは、LabViewで書かれた自家製ソフトウェアで取得されます。このデバイスの動物インターフェースは、400 μmのマルチモードソースファイバ(400-2200 nmの波長範囲、純粋なシリカコア、TECSハードクラッディング)と780 nmのシングルモード検出器ファイバ(780-970 nmの波長範囲、純粋なシリカコア、TECSハードクラッディング、730 ± 30 nmのセカンドモードカットオフ)で構成され、6 mm間隔で黒の3Dプリントセンサー(4 mm x 8 mm、 図3)。
神経炎症環境の定量化
神経炎症は多様な細胞プロセスによって調節されるが、2つの重要な関連メカニズムはサイトカイン/ケモカインによる細胞外シグナル伝達およびリンタンパク質による細胞内シグナル伝達である。損傷後の脳の神経炎症環境を調べるために、マウスから脳を抽出し、微小解剖し、ルミネックスを用いてサイトカイン/ケモカインおよびリンタンパク質を定量する(図5、 図6、 図7)。ルミネックスの多重化イムノアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を蛍光タグ付き磁気ビーズに結合させることにより、これらのタンパク質の多様なコレクションの同時定量を可能にします。異なる蛍光タグが目的のタンパク質ごとに使用され、各タグのビーズがその特定のタンパク質に対する捕捉抗体で官能化されます。各タンパク質を捕捉するための何百ものビーズを一緒に混合し、96ウェルプレートに入れ、サンプルと共にインキュベートした。サンプルインキュベーション後、磁石を使用してビーズをウェルにトラップし、サンプルを洗い流します。次に、ビオチン化された検出抗体は、目的の分析物に結合して、従来のELISAと同様に抗体抗原サンドイッチを形成しますが、タンパク質ごとに異なる蛍光タグ付きビーズ上でELISAが発生します。フィコエリスリン結合型ストレプトアビジン(SAPE)を添加すると、各反応が完了する。次に、ルミネックス装置はビーズを読み取り、各蛍光タグ/タンパク質に従ってシグナルを分離します。
データ統合
ルミネックスアッセイでは多数の分析物(サイトカインなど)が測定されるため、定量された各タンパク質を個別に分析すると、データ分析の解釈が困難な場合があります。分析を簡素化し、分析種間で観察された傾向を捉えるために、偏最小二乗回帰(PLSR、 図8)23と呼ばれる多変量分析法を使用します。PLSRは、測定されたタンパク質の共分散を応答変数(例えば、脳血流)とともに最適に説明する、各測定されたタンパク質(すなわち、「予測変数」と呼ばれるサイトカインまたはリンタンパク質)に対応する重みの軸を同定することによって機能する。重みは「負荷量」と呼ばれ、潜在変数 (LV) と呼ばれるベクトルに組み立てられます。測定されたタンパク質データを2つのLVの各々に投影(「スコアリング」と呼ぶ)することによって、データはこれらのLVに関して再プロットされ得る。PLSRを計算した後、我々は、LVへのサンプル投影と予測変数24との間の共分散を最大化する新しいLVを識別するために、バリマックス回転を使用する。このアプローチにより、LV1を応答変数の分散が最もよく説明される軸として定義できます。LV2は、応答変数とLV1残差データとの間の共分散を最大化し、これはサンプル間の生物学的または技術的変動性と関連している可能性がある。最後に、PLSRモデルが1つのサンプルに大きく依存していないことを確認するために、1つのアウトクロス検証(LOOCV)を実行します23。
このプロトコールでは、mTBIに対する神経炎症性および血行力学的組織応答を特徴付ける方法を詳述する。一般的なワークフローの概要を 図 1 に示します。このプロトコルにおいて、マウスは、体重減少閉鎖頭部損傷モデルを用いて1つ以上のmTBIを受ける。脳血流は、傷害の前後に複数の時点で縦方向に測定される。神経炎症性変化の尋問の対象となる時点で、動物を安楽死させ、脳を抽出する。関心のある脳領域は、マイクロダイセクションによって単離され、次いで溶解されてタンパク質を抽出する。溶解物は、その後、サイトカインおよびリンタンパク質発現のルミネックス多重化免疫アッセイならびにウェスタンブロットの両方に使用される。最後に、この全体的なデータセットは、偏最小二乗回帰分析を使用して統合されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書では、反復的な軽度の外傷性脳損傷に対する血行動態および神経炎症反応の評価方法を詳述する。さらに、偏最小二乗回帰を使用した多変量システム分析の一部としてこれらのデータを統合する方法を示しました。以下のテキストでは、プロトコルに関連する重要な手順と制限事項のいくつか、および既存の方法に対する方法の長所/短所について説明します。
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Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、国立衛生研究所R21 NS104801(EMB)およびR01 NS115994(LBW / EB)およびアトランタジュニア教員フォーカスアワード(EMB)の小児医療によって支援されました。この研究は、米国国防総省によって、議会が指示する医学研究プログラムを通じて、賞番号の下でも支援されました。W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB).意見、解釈、結論および勧告は著者のものであり、必ずしも国防総省によって承認されるものではありません。この資料は、助成金番号1937971の下で国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムによって支援された研究に基づいています。本資料に記載されている意見、所見、結論または勧告は著者のものであり、必ずしも国立科学財団の見解を反映するものではありません。
Materials
| Adjustable pipettes | any adjustable pipette | ||
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Bio-Plex cell lysis kit | C Bio-Rad | 171304012 | |
| BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile | BrandTech | 781602 96 | |
| Complete mini protease inhibitor tablet | Sigma-Aldrich | 11836153001 | |
| Depilatory cream | Amazon | Nair | |
| DiH2O | VWR | VWRL0200-1000 | |
| Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates | Millipore Sigma Catalogue | 40-285 | |
| Hardware Autocorrelator Board | www.correlator.com | Flex05-8ch | |
| Isoflurane 250 mL | MED-VET INTERNATIONAL | RXISO-250 | |
| Kimwipe (11.2 x 21.3 cm) | VWR | 21905-026 | |
| Laboratory vortex mixer | VWR | 10153-838 | |
| LabView | National Instruments | LabVIEW | |
| Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software | Luminex Corporation | ||
| Luminex Drive Fluid | Luminex | MPXDF-4PK | |
| Luminex sheath fluid | EMD Millipore | SHEATHFLUID | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel – Premixed 32 Plex – Immunology Multiplex Assay | Millipore Sigma | MCYTMAG-70K-PX32 | |
| MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay | Millipore Sigma | 48-660MAG | |
| Mini LabRoller rotator | VWR | 10136-084 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626-1G | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | VWR | 97064-158 | |
| Plate Sealer | VWR | 82050-992 | |
| Polypropylene microfuge tubes | VWR | 20901-547 | |
| Mini LabRoller | Millipore Sigma | Z674591 | |
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-668 | |
| R Programming Language | |||
| RStudio | www.rstudio.com | ||
| Sonicator | |||
| Titer plate shaker | VWR | 12620-926 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| 1 m acrylic guide tube | McMaster-Carr | 49035K85 | |
| 4 photon counting avalanche photodiode | Perkin-Elmer | SPCM-AQ4C-IO | |
| 400 um multimode source fiber | Thorlabs Inc. | FT-400-EMT | |
| 54 g bolt | Ace Hardware | 0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length | |
| 780 nm single mode detector fiber | Thorlabs Inc. | 780HP | |
| 852 nm long-coherence length laser | TOPTICA Photonics | iBeam smart |
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