Ein Suppressor-Bildschirm zur Charakterisierung genetischer Links, die die chronologische Lebensdauer in Saccharomyces cerevisiae regulieren

Summary

Hier ist ein Protokoll, um genetische Wechselwirkungen durch eine erhöhte Kopierzahl Suppressor-Bildschirm in Saccharomyces cerevisiaezu identifizieren. Diese Methode ermöglicht es Forschern, Suppressoren in kurzlebigen Hefemutanten zu identifizieren, zu klonen und zu testen. Wir testen den Effekt der Erhöhung der Kopierzahl von SIR2 auf die Lebensdauer in einem autophagy null Mutant.

Abstract

Altern ist die zeitabhängige Verschlechterung der normalen biologischen Prozesse eines Organismus, die die Wahrscheinlichkeit des Todes erhöht. Viele genetische Faktoren tragen zu Veränderungen im normalen Alterungsprozess bei. Diese Faktoren kreuzen sich auf komplexe Weise, wie die Fülle dokumentierter Verbindungen zeigt, die in vielen Organismen identifiziert und konserviert werden. Die meisten dieser Studien konzentrieren sich auf Funktionsverlust, Nullmutanten, die ein schnelles Screening vieler Gene gleichzeitig ermöglichen. Es gibt viel weniger Arbeit, die sich darauf konzentriert, die Rolle zu charakterisieren, die die Überexpression eines Gens in diesem Prozess überträgt. In der vorliegenden Arbeit präsentieren wir eine einfache Methodik zur Identifizierung und Klonung von Genen in der angehenden Hefe, Saccharomyces cerevisiae, zur Untersuchung zur Unterdrückung des kurzlebigen chronologischen Lebenserwartungsphänotyps, der in vielen genetischen Hintergründen zu sehen ist. Dieses Protokoll soll Forschern unterschiedlichster Herkunft und verschiedenen akademischen Stadien zugänglich sein. Das SIR2-Gen, das für eine Histon-Deacetylase kodiert, wurde für das Klonen im pRS315-Vektor ausgewählt, da es widersprüchliche Berichte über seine Auswirkungen auf die chronologische Lebensdauer gegeben hat. SIR2 spielt auch eine Rolle in der Autophagie, die entsteht, wenn durch das Löschen mehrerer Gene gestört, einschließlich des Transkriptionsfaktors ATG1. Als Beweis des Prinzips klonen wir das SIR2-Gen, um einen Suppressor-Bildschirm auf dem verkürzten Lebensdauer-Phänotyp, der für den autophagie-Mangel-Atg1-Mutant charakteristisch ist, durchzuführen und es mit einem ansonsten isogenen, wilden genetischen Hintergrund zu vergleichen. atg1Δ

Introduction

Altern ist der zeitabhängige Verlust der Integrität in unzähligen biologischen Prozessen, der letztlich die Wahrscheinlichkeit eines Organismustodes erhöht. Das Altern ist für alle Arten fast unvermeidlich. Auf zellulärer Ebene gibt es mehrere gut charakterisierte Kennzeichen, die mit dem Altern verbunden sind, einschließlich: genomische Instabilität, epigenetische Veränderungen, Verlust der Proteostase, mitochondriale Dysfunktion, deregulierte Nährstoffsensorik, zelluläre Seneszenz und Telomerat^1,2. Bei einzelligen Organismen, wie Hefen, führt dies zu einer Verringerung des reproduktiven Potentials und der chronologischen Lebensdauer^3,4. Diese zellulären Veränderungen manifestieren sich in komplexeren Organismen, wie Menschen, als Pathologien, die Krebs, Herzinsuffizienz, Neurodegeneration, Diabetes, und Osteoporose^{gehören 5,6,7}. Trotz der vielen Komplexitäten, die den Prozess des Alterns charakterisieren, gibt es die Erhaltung dieser molekularen Kennzeichen, die diesem Prozess über sehr unterschiedliche Organismen^8,9,10zugrunde liegen. Die Identifizierung von Veränderungen dieser Wege während des Alterns führte zu der Erkenntnis, dass sie durch Lebensstiländerungen manipuliert werden können – Diät-Einschränkung wird gezeigt, dass die Lebensdauer in vielen Organismen wesentlich verlängert¹¹. Diese Wege konvergieren und schneiden sich auf komplexe Weise untereinander und vielen anderen Pfaden. Die Aufklärung und Charakterisierung dieser Wechselwirkungen bietet Potenzial für therapeutische Interventionen zur Verlängerung der Lebensdauer und Der Gesundheitsspanne^12,13,14.

Die Erhaltung der molekularen Grundlagen des Alterns ermöglicht eine funktionelle Zerlegung genetischer Wechselwirkungen, die dem Prozess durch den Einsatz einfacherer Modellorganismen zugrunde liegen – einschließlich der angehenden Hefe, Saccharomyces cerevisiae^15,16. Es gibt zwei etablierte Arten von Alterung, die durch aufkeimende Hefe modelliert werden: chronologische Alterung (die chronologische Lebensdauer, CLS) und replizierende Alterung (die replizierische Lebensdauer, RLS)¹⁷. Die chronologische Alterung misst die Zeit, die eine Zelle in einem nicht dividierenden Zustand überleben kann. Dies ist analog zu der Alterung, die in Zellen gesehen wird, die den Großteil ihres Lebens in G₀verbringen, wie Neuronen⁴. Alternativ ist die replizierende Lebensdauer die Anzahl der Male, die eine Zelle vor Erschöpfung teilen kann, und ist ein Modell für mitotisch aktive Zelltypen (z. B. die Anzahl der Tochterzellen, die eine Zelle haben kann)¹⁸.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein Protokoll zu präsentieren, das die funktionelle Zerlegung der Genetik des Alterns mit S. cerevisiaeermöglicht. Während es viele ausgezeichnete Studien von vielen Forschern durchgeführt haben, die zu unserem aktuellen Verständnis geführt haben, gibt es noch viele Möglichkeiten für angehende Forscher, um zum Alterungsfeld von Anfang an in ihrer akademischen Karriere beizutragen. Wir stellen eine klare Methodik vor, die es Forschern ermöglicht, den Bereich des Alterns weiter voranzutreiben. Dieses Protokoll ist so konzipiert, dass es für alle Forscher unabhängig von der Phase ihrer akademischen Laufbahn zugänglich ist, indem es die notwendigen Werkzeuge bereitstellt, um ihre eigenen neuen Hypothesen zu formulieren und zu testen. Der Vorteil unseres Ansatzes ist, dass dies eine kostengünstige Methode ist, die für alle Forscher unabhängig von der Institution leicht zugänglich ist – und keine teure, spezialisierte Ausrüstung erfordert, die für einige Protokolle erforderlich ist¹⁹. Es gibt mehrere verschiedene Möglichkeiten, diese Art von Bildschirm zu entwerfen, der in dieser Arbeit skizzierte Ansatz ist besonders geeignet, Nullmutanten von nicht-essentiellen Genen zu untersuchen, die eine starke Verringerung der chronologischen Lebensdauer im Vergleich zu einem isogenen Wildstamm von Hefe aufweisen.

Als Beweis des Prinzips klonen wir SIR2, eine Lysin-Deacetylase, die sowohl eine verlängerte als auch eine verkürzte CLS aufweist, wenn sie überexprimiert wird. SIR2 Überexpression wurde vor kurzem festgestellt, CLS in der Weinbereitung Hefen zu erhöhen; Mehrere Gruppen haben jedoch keine Verbindung zwischen SIR2 und CLS-Erweiterung gemeldet, so dass ihre Rolle unter den Merkmalen^20,21,22bleibt. Aufgrund dieser widersprüchlichen Berichte in der Literatur haben wir dieses Gen ausgewählt, um unabhängige Forschung hinzuzufügen, um die Rolle von SIR2 in der chronologischen Alterung zu klären, falls vorhanden. Darüber hinaus verlängert das Erhöhen der Kopierzahl eines SIR2-Homologen die Lebensdauer in einem Nematoden-Wurmmodellsystem²³.

Autophagie ist ein intrazelluläres Abbausystem, um zytosolische Produkte, wie Proteine und Organellen, an das Lysom²⁴zu liefern. Autophagie ist eng mit Langlebigkeit durch seine Rolle bei der Erniedrigung beschädigter Proteine und Organellen verbunden, um zelluläre Homöostase zu erhalten²⁵. Die Induktion der Autophagie hängt von der Orchestrierung der Expression vieler Gene ab, und die Deletion des ATG1-Gens führt zu einem ungewöhnlich kurzen CLS in angehender Hefe²⁶. ATG1-Codes für eine Proteinserin/Threoninkinase, die für die Vesikelbildung in der Autophagie und den Zytoplasma-zu-Vakuole(das Pilzlysosomale Äquivalent) erforderlich ist^27,28. Hier stellen wir unsere Methode für einen erhöhten Kopiernummernbildschirm vor und testen den Effekt einer erhöhten SIR2-Kopie auf dem CLS in einem Wild-Typ und einem atg1-null-Hintergrund. Diese Methode ist besonders für junge Forscher und Forschungsgruppen an vorwiegend studentisch untersuchten Einrichtungen zugänglich, von denen viele Gemeinschaften dienen, die in den Wissenschaften unterrepräsentiert sind und über begrenzte Ressourcen verfügen.

Protocol

1. Identifizieren potenzieller genetischer Wechselwirkungen für das Screening Identifizieren Sie den genetischen Hintergrund(e) für die Charakterisierung, was zu einer ungewöhnlich verkürzten chronologischen Lebensdauer (CLS) in Saccharomyces cerevisiae mit der Saccharomyces Genome Database (der SGD, https://www.yeastgenome.org29,30) führt, die bekannte phänotypische Informationen für diesen Organismus zusammenstellt. W?…

Representative Results

Da es widersprüchliche Berichte über die Rolle von SIR2 während des Alterns gibt, haben wir dieses Gen für die Studie als potentiellen Suppressor des shorten CLS-Phänotyps26des atg1-Mutanten gewählt. Die Rolle von SIR2 ist etwas kontrovers, mit widersprüchlichen Berichten über seine Rolle bei der Erweiterung von CLS, aber es wurde eindeutig mit erhöhter CLS in mindestens einem Hefe-Hintergrund verbunden, mit einer Rolle in der Autophagie und Mitophagie<sup class…

Discussion

Die Entschlüsselung der Genetik des Alterns ist eine schwierige Herausforderung, mit vielen Möglichkeiten für weitere Studien, die potenziell signifikante Einblicke in die komplexen Wechselwirkungen liefern können, die existieren. Es gibt viele Methoden, die die schnelle Erzeugung von Funktionsverlustmutanten für die Untersuchung von Nullstämmen von Hefe^{ermöglichen 45,46}. Diese Methode bietet einen einfachen Ansatz, um Gene für Überexpressionssuppressors…

Materials

Fungal/Bacterial DNA kit	Zymo Research	D6005
HindIIIHF enzyme	New England Biolabs	R3104S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Plasmid miniprep kit	Qiagen	12123
SacII enzyme	New England Biolabs	R0157S
Salmon sperm DNA	Thermofisher	AM9680
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S