Este protocolo descreve a dissecção neonatal da calvária de camundongos dmp1-topázio e o isolamento de osteócitos expressando a proteína verde fluorescente através da digestão e fracionamento celular, além da preparação de osteócitos para triagem celular ativada por fluorescência (FACS).
O osteócito, antes considerado um residente passivo do osso, dada a função de bastidores de detectar a carga mecânica, agora é trazido à tona e tem sido demonstrado que tem múltiplas funções principais, como modificar ativamente a matriz extracelular e formar um órgão endócrino com o sistema lacunocanalicular que o encerra enviando mensagens para locais distantes. Devido aos métodos que tornaram possível testar o osteócito in vitro a partir do isolamento de osteócitos primários para linhagens celulares semelhantes a osteócitos, os osteócitos estão agora experimentando um interesse retumbante e uma onda de conhecimento sobre estrutura e função. Muitos aspectos da biologia dos osteócitos e da interação com outros componentes moleculares ainda precisam ser descobertos. Neste protocolo, descrevemos em detalhes o eficiente isolamento de osteócitos primários da calvária neonatal dmp1-topázio, que expressam a proteína verde fluorescente nos osteócitos, através do fracionamento celular e posterior aquisição de culturas de osteócitos primários por FACS.
Os osteócitos são células terminalmente diferenciadas dos progenitores osteoblásticos que se incorporaram em sua matrizsecretada1. São as células mais abundantes e de vida mais longa entre as populações de células ósseas. Residem em lacunas e apresentam morfologia estrelada característica, com dendritos que se estendem através de canais denominados canalículos, formando uma extensa rede de comunicação e trocas metabólicas com o meio circundante e a superfícieóssea2. Os osteócitos coreografam tanto os osteoblastos quanto os osteoclastos na remodelação óssea, são as principais células mecanossensoriais que conferem adaptação à cargamecânica3, estão envolvidos na homeostase dofosfato4 e namineralização da matriz óssea5 e, juntamente com o sistema lacunocanalicular, atuam como órgão endócrino sinalizando tecidosdistantes6.
Os osteócitos situam-se dentro de uma matriz mineralizada, o que limita a acessibilidade e torna seu isolamento desafiador, dificultando a investigação in vitro. Um dos primeiros métodos de isolamento descreveu osteócitos isolados da calvária de galinha usando um anticorpo monoclonal específico para osteócitos (OB7.3)7 que mais tarde foi conhecido por ser a variante aviária do PHEX (PHosphate-regulating gene with homology to Endopeptidases on the X chromosome)8. Outros pesquisadores usaram a digestão sequencial de ossos longos de ratos 9 oucamundongos 10 para obter frações ricas em osteócitos nas quais a pureza dos osteócitos foi relatada em torno de 70%9. As limitações desse procedimento incluem a pureza sub-ótima de culturas contaminadas com outros tipos celulares além dos osteócitos e que osteócitos poderiam ser potencialmente supercultivados por outras células em cultura, uma vez que os osteócitos perderam a capacidade de se dividir. Esses desafios restringem a usabilidade de culturas de longo prazo.
Para superar essas limitações, diferentes linhagens celulares de osteócitos foram desenvolvidas. A linhagem celular MLO-Y411 e a linhagem celular MLO-A512 são notavelmente as linhagens celulares mais estudadas que são úteis para o estudo dos osteócitos em estágio inicial; entretanto, são menos úteis para estudar a sinalização de osteócitos maduros, pois expressam baixos níveis de esclerostina e FGF2313, ambos marcadores de osteócitos maduros. Outras linhagens celulares, incluindo IDG-SW3 14 e Ocy45415, expressam altos níveis de esclerostina e FGF23 e são úteis no estudo do estágio tardio dos osteócitos. As linhagens celulares mostram-se ferramentas úteis de pesquisa; No entanto, eles não vêm sem limitações, pois não representam totalmente a biologia da célula primária. Diferentes linhagens celulares representam diferentes estágios de desenvolvimento do espectro de maturidade dos osteócitos, e as linhagens celulares não conseguem representar a heterogeneidade dos osteócitosprimários16,17.
Para obter culturas puras de osteócitos primários, os pesquisadores aproveitaram o modelo de camundongo cre, no qual o promotor dmp1 de 8 kb é usado para conduzir a expressão da proteína fluorescente verde (GFP) em osteócitos18,19. Camundongos transgênicos duplos (pOB-Col 2.3- GFP-ciano e DMP1-GFP-topázio) de Paic et al.19 e camundongos transgênicos dmp1-topázio de Nakashima et al.20 têm sido utilizados para obtenção de populações de osteócitos. Em que empregaram digestão sequencial e FACS de osteócitos expressando GFP para aquisição de culturas de osteócitos primários19,20. A direção do cre no camundongo repórter dmp1 Ai9 de 10 kb, que ativa a proteína tdTomato, mostrou-se presente em osteócitos, osteoblastos, músculos e células dentro da medula óssea. O promotor dmp1 de 8 kb apresentou o mesmo padrão de expressão, mas apenas uma proporção de osteoblastos e células da medula óssea expressou a proteína, o que indica que o promotor dmp1 de 8 kb é maisespecífico21. Apesar disso, os resultados obtidos com o promotor dmp1 de 8 kb devem ser interpretados com cautela, e os perfis de expressão gênica devem ser realizados rotineiramente usando marcadores específicos de osteócitos versus osteoblastos para garantir que a população obtida seja de pureza alta o suficiente.
Os marcadores osteoclastos OSCAR e Dcstamp foram encontrados em populações de osteócitos hematopoéticos não depletados vs. depletos, este achado levou os autores a concluir que os digestores obtidos a partir do fracionamento da calvária neonatal de 8 kb dmp1-topázio e da classificação da GFP estão contaminados com células hematopoéticas. A contaminação com células hematopoéticas poderia ter sido atenuada apertando a comporta de classificação da GFP, uma vez que as células hematopoéticas positivas para GFP apresentaram uma intensidade de GFP razoavelmente menor do que as células mesenquimais positivas para GFP (osteócitos)22.
Os métodos de estudo in vitro dos osteócitos têm contribuído para a riqueza recente de informações sobre a biologia dos osteócitos. No entanto, o isolamento de osteócitos continua sendo um procedimento trabalhoso e demorado, com baixo rendimento celular. O método descrito de digestão óssea utilizando colagenase e EDTA, muitas vezes até a fração 823, leva várias horas em que a viabilidade dos osteócitos é taxada. Pesquisadores relataram o uso de frações (2\u20125) para triagem celular20 e mostraram que o perfil de expressão de genes associados a osteócitos versus osteoblastos confirma o sucesso do isolamento de populações de osteócitos puros20. Neste artigo, descrevemos o processo de obtenção das frações (2\u20125) e comparamos o rendimento dos osteócitos de cada fração a partir da fração 1 a 8 para determinar o retorno dos osteócitos em cada fração. Descrevemos também a dissecção da calvária de camundongos dmp1-topázio e a digestão da calvária usando colagenase e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), bem como a preparação de células para FACS.
O primeiro osteócito isolado foi de uma galinhacalvária 7 isolada usando (OB7.3) ou a variante aviante de PHEX; no entanto, este método é limitado pela disponibilidade de anticorpos viáveis, uma vez que anticorpos osteocito-específicos que também são espécie-específicos têm de ser fabricados. Os pesquisadores usaram uma modificação diferente do processo enzimático sequencial para obter osteócitos de ossos longos de camundongos e ratos; A pureza relatada dessas culturas foi fixada em…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado em parte por uma bolsa JSPS KAKENHI da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (No. 19K10397 para H.K. e No. 18K09862 para I.M.).
BD FACSDiva software | BD Biosciences | Data aquisition and analysis | |
BD Falcon Tube | BD Biosciences | 352235 | 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh. |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, MO, USA | ||
Collagenase | Wako, Osaka, Japan | 034-22363 | 0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum. |
EDTA | Dojindo, Kumamoto, Japan | 5mM EDTA prepared with 0.1% BSA | |
FACSAriaTM II | BD Biosciences | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Biowest, Nuaillé, France | ||
Isolation buffer | 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES | ||
Millex Sterile Filter Unit | Merck Millipore, Ireland | SLGV033RS | 0.22μm |
Nylon cell strainer | FALCON, NY, USA | 40μm | |
Trypsin-EDTA | Life Technologies, NY, USA | 0.5% x10. diluted to x1 in PBS | |
α-MEM | Wako, Osaka, Japan | Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin |