Vitrificazione del volume minimo degli ovociti felini immaturi
Summary
Questo manoscritto descrive un protocollo per la vetrificazione del volume minimo di ovociti di gatto immaturi con supporti fatti in laboratorio su supporti commerciali. Copre ogni passo dall’isolamento degli ovociti dalle gonadi ex vivo alla vetrificazione e al riscaldamento.
Abstract
Nei programmi di conservazione degli animali selvatici, la gamete banking è fondamentale per salvaguardare le risorse genetiche di individui di valore e specie rare e per promuovere la conservazione della biodiversità. Nei felini, la maggior parte delle specie sono minacciate di estinzione, e le razze domestiche sono utilizzate come modello per aumentare l’efficienza dei protocolli per il germoplasma bancario. Tra le tecniche di crioconservazione degli ovociti, la vetrificazione è sempre più popolare nella riproduzione assistita umana e veterinaria. La vetrificazione criotopica, che è stata inizialmente sviluppata per gli ovociti umani e gli embrioni, ha dimostrato di essere adatta per gli ovociti di gatto. Questo metodo offre diversi vantaggi, come la fattibilità delle condizioni di campo e la velocità della procedura, che può essere utile quando è necessario elaborare più campioni. Tuttavia, l’efficienza dipende fortemente dalle competenze dell’operatore e sono necessarie una standardizzazione intra-laboratorio e interlaboratorio, nonché la formazione del personale. Questo protocollo descrive la vitrificazione del volume minimo degli ovociti felini immaturi su un supporto commerciale in un protocollo passo dopo passo, favorevole al campo, dalla raccolta degli ovociti al riscaldamento. Seguendo il protocollo, la conservazione dell’integrità e della vitalità degli ovociti al riscaldamento (fino al 90%) ci si può aspettare, anche se c’è ancora spazio per migliorare la maturazione post-riscaldamento e i risultati dello sviluppo embrionale.
Introduction
La crioconservazione è diventata un passo fondamentale delle tecniche di riproduzione assistita (ART). Nell’uomo, permette la conservazione della fertilità o il rinvio della genitorialità per motivi medici o personali. Negli animali, è necessario superare la distanza e il tempo negli accoppiamenti pianificati, in particolare negli animali da allevamento e negli animali domestici, o per preservare il materiale genetico di soggetti di valore in programmi di conservazione, in particolare nelle specie selvatiche a rischio di estinzione. La crioconservazione del gamet è la scelta migliore quando gli individui da allevare non sono ancora stati scelti o per evitare problemi etici associati al congelamento degli embrioni, soprattutto nella medicina umana1. Gli spermatozoi sono relativamente facili da preservare e dare risultati soddisfacenti dopo lo scongelamento, ma gli ovociti, a causa delle loro caratteristiche strutturali, potrebbero essere più complessi da conservare. Infatti, il basso rapporto superficie/volume, così come la presenza della zona pellucida che circonda l’ooplasma, limita il movimento dei crioprotettori e dell’acqua attraverso la cella2. Inoltre, negli animali domestici compresi i felidi, sono caratterizzati da un citoplasma ricco di lipidi, che si pensa li renda più sensibili alla crioconservazione3.
La maggior parte dei felidi sono minacciati, e il gatto domestico è usato come modello per sviluppare protocolli per la conservazione del germoplasma grazie alla disponibilità di gonadi da ovariectomia di routine. Negli animali selvatici, le gonadi possono essere ottenute dopo interventi chirurgici elettivi o (più frequentemente) post-mortem, e immaturi (vescicole germinale) gameti possono essere recuperati. La stimolazione ormonale mirata a ottenere ovociti maturi (metafase II) non è così comune come negli ART umani a causa delle questioni etiche e della risposta specifica delle specie e dell’individuo ai trattamenti4.
Pertanto, lo sviluppo di strategie di crioconservazione si è concentrato su gameti immaturi, che di solito possono essere recuperati dopo la morte inaspettata o improvvisa di individui rari. Da un punto di vista biologico, ci sono alcune differenze nella crioconservazione di gameti immaturi o maturi, ognuno con i suoi vantaggi. In primo luogo, il DNA è più protetto negli ovociti immaturi, la cui vescicolo germinale contiene cromosomi circondati da una membrana nucleare, mentre il mandrino meiotico degli ovociti metafase II potrebbe essere più vulnerabile alle criolesioni5. In secondo luogo, i danni da citoscheletro indotti dal freddo potrebbero influenzare la rotazione del mandrino, l’estrusione polare del corpo, la migrazione pronucleare e la citocinesi, che potrebbero avere impatti diversi a seconda della fase di sviluppo degli ovociti, influenzando la progressione della meiosi o gli eventi post-fecondazione. Infine, e forse la cosa più importante, mentre gli ovociti maturi sono pronti per essere fecondati, i gameti immaturi si basano sul supporto delle cellule cumuli che circondano per passare attraverso la maturazione nucleare e citoplastica6, e questo è il motivo per cui tutti i complessi cumulo-oocyte (COC) sono crioconservati. Tuttavia, la perdita di cellule cumuli e/o la perdita di connessione funzionale tra il gamete e le cellule somatiche circostanti sono probabilmente l’effetto più dannoso della crioconservazione dei COC immaturi.
Tra le tecniche di crioconservazione, la vetrificazione è una che può essere applicata più facilmente in condizioni di campo. Rispetto al congelamento lento (o a velocità controllata), la vetrificazione è più veloce e non richiede attrezzature specifiche, come un congelatore programmabile. Al fine di soddisfare i tre principi fondamentali della vetrificazione (cioè un’elevata viscosità, collegata ad alta concentrazione crioprotettrice, piccoli volumi e diminuzione ultra-rapida della temperatura), sono stati sviluppati e utilizzati in particolare diversi supporti e supporti nei gatti sia per gli ovociti immaturi che per quelli maturi. A partire da semplici cannucce7, sono stati poi sviluppati dispositivi per raggiungere l’obiettivo “Volume minimo”. Cryoloop8, cannucce tirate aperte (OPS)9, grondaie di plastica (paglia modificata)10 e criotubi11 sono stati utilizzati, fino a quando un dispositivo più efficiente (cioè, Cryotop) è stato impiegato11, migliorando la sopravvivenza e meiosis ripresa. Cryotop (Figura supplementare 1) è un supporto disponibile in commercio che è diventato il sistema aperto elettivo per la vetrificazione. Sviluppato per la vetrificazione di ovociti ed embrioni umani, è costituito da una piccola striscia di pellicola attaccata a un supporto di plastica dura, protetta da un tappo di plastica durante lo stoccaggio12. Grazie alla sua usabilità e all’estrema riduzione del volume di vetrificazione (appena 0,1 l), che porta anche a tassi di raffreddamento e riscaldamento estremamente rapidi, questo supporto di vetrificazione è stato sempre più applicato in diverse specie, tra cui il gatto domestico, in cui è stato utilizzato con una varietà di media13,14,15,1616,17.
Lo scopo di questo manoscritto è quello di descrivere un protocollo di raccolta-vitrificazione-riscaldamento, con piccole modifiche da quello originariamente sviluppato per gli ovociti umani, che impiega supporti multimediali e commerciali fatti in laboratorio per la vitrificazione del volume minimo e può essere facilmente applicato in condizioni di campo per la crioconservazione dei COC felini immaturini.
Protocol
Representative Results
Discussion
La crioconservazione degli ovociti è una tecnica cruciale di conservazione del germoplasma, specialmente nei taxa dove molte specie sono in pericolo, come la famiglia Felidae. In questo manoscritto è stato presentato un protocollo semplice e rispettoso del campo per la vetrificazione degli ovociti di gatto immaturi. I supporti di laboratorio, i supporti per la vitrificazione del volume minimo e il personale addestrato sono i fattori chiave per il successo di questo metodo, che consente di ottenere ovociti vitali in mod…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato in parte sostenuto da EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 e dall’Università della Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Ringraziamo anche la Dott.ssa MariaGiorgia Morselli per il suo contributo agli esperimenti descritti e all’acquisizione di immagini.
Materials
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
Riferimenti
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