Fingerprinting cromatografico per corrispondenza dei modelli per i dati raccolti dalla gascromatografia bidimensionale completa

Summary

Questo protocollo presenta un approccio alle impronte digitali ed esplora i dati multidimensionali raccolti dalla gascromatografia bidimensionale completa accoppiata alla spettrometria di massa. Algoritmi di riconoscimento dei modelli dedicati (corrispondenza dei modelli) vengono applicati per esplorare le informazioni chimiche crittografate nella frazione volatile dell’olio extravergine di oliva (cioè volatilome).

Abstract

L’elaborazione e la valutazione dei dati sono fasi critiche della gascromatografia bidimensionale completa (GCxGC), in particolare se accoppiate alla spettrometria di massa. Le informazioni dettagliate crittografate nei dati possono essere molto preziose ma di difficile accesso in modo efficiente. La densità e la complessità dei dati possono portare a lunghi tempi di elaborazione e richiedere procedure laboriose e dipendenti dagli analisti. Strumenti efficaci ma accessibili per l’elaborazione dei dati sono quindi fondamentali per consentire la diffusione e l’accettazione di questa tecnica multidimensionale avanzata nei laboratori per l’uso quotidiano. Il protocollo di analisi dei dati presentato in questo lavoro utilizza il rilevamento cromatografico delle impronte digitali e la corrispondenza dei modelli per raggiungere l’obiettivo di decostruzione altamente automatizzata di cromatogrammi bidimensionali complessi in singole caratteristiche chimiche per il riconoscimento avanzato di modelli informativi all’interno di singoli cromatogrammi e attraverso insiemi di cromatogrammi. Il protocollo offre elevata coerenza e affidabilità con poco intervento. Allo stesso tempo, la supervisione degli analisti è possibile in una varietà di impostazioni e funzioni di vincolo che possono essere personalizzate per fornire flessibilità e capacità di adattarsi alle diverse esigenze e obiettivi. La corrispondenza dei modelli è mostrata qui come un potente approccio per esplorare l’olio extravergine di oliva volatilome. Il cross-alignment dei picchi viene eseguito non solo per obiettivi noti, ma anche per composti non bersaglio, il che aumenta significativamente la potenza di caratterizzazione per una vasta gamma di applicazioni. Esempi sono presentati per la prova delle prestazioni per la classificazione e il confronto di modelli cromatografici da set di campioni analizzati in condizioni simili.

Introduction

La gascromatografia bidimensionale completa combinata con il rilevamento spettrometrico di massa a tempo di volo (GC×GC-TOF MS) è oggi l’approccio analitico più informativo per la caratterizzazione^{chimica di campioni complessi 1,2,3,4,5}. In GC×GC, le colonne sono collegate in serie e interfacciate da un modulatore (ad esempio, un’interfaccia di messa a fuoco termica o basata su valvole) che intrappola i componenti di eluizione dalla prima colonna di dimensione⁽¹D) prima della loro reiezione nella colonna della seconda dimensione⁽²D). Questa operazione viene eseguita entro un periodo di tempo di modulazione fisso (P_M), generalmente compreso tra 0,5 e 8 s. Con la modulazione termica, il processo include la crio-intrappolamento e la messa a fuoco della banda di eluizione con alcuni vantaggi per la potenza di separazione complessiva.

Sebbene GC×GC sia una tecnica di separazione bidimensionale, il processo produce valori di dati sequenziali. Il convertitore analogico-digitale (A/D) del rivelatore ottiene l’uscita del segnale cromatografico ad una certa frequenza. Quindi, i dati vengono memorizzati in specifici formati proprietari che non solo contengono i dati digitalizzati ma anche i metadati correlati (informazioni sui dati). Il convertitore A/D impiegato nei sistemi GC×GC aiuta a mappare l’intensità del segnale cromatografico a un numero digitale (DN) in funzione del tempo nelle due dimensioni analitiche. I rivelatori a canale singolo (ad esempio, rivelatore di ionizzazione di fiamma (FID), rivelatore di cattura elettronica (ECD), rivelatore di chemiluminescenza dello zolfo (SCD), ecc.) producono valori singoli per tempo di campionamento, mentre i rivelatori multicanale (ad esempio, rivelatore spettrometrico di massa (MS)) producono valori multipli (tipicamente, su un intervallo spettrale) per tempo di campionamento lungo la corsa analitica.

Per visualizzare i ^{dati 2D,}l’elaborazione inizia con la rasterizzazione di un singolo periodo di modulazione (o ciclo) dei valori di dati come colonna di pixel (elementi immagine corrispondenti agli eventi del rivelatore). Lungo l’ordinata (asse Y, dal basso verso l’alto) viene visualizzato il tempo di separazione ^2D. Le colonne pixel vengono elaborate in sequenza in modo che l’ascissa (asse X, da sinistra a destra) rapporti ^{1 tempo}di separazione D. Questo ordinamento presenta i ^{dati 2D}in un sistema di coordinate cartesiano destrorso, ^{con l’ordinale di}conservazione 1 D come primo indice nell’array.

L’elaborazione dei dati dei cromatogrammi ^2Dconsente di accedere a un livello di informazioni più elevato rispetto ai dati grezzi, ^{consentendo il rilevamento dei picchi 2D,}l’identificazione dei picchi, l’estrazione dei dati di risposta per l’analisi quantitativa e l’analisi comparativa incrociata.

I ^{modelli di picco 2D}possono essere trattati come l’impronta digitale unica del campione e i composti rilevati come caratteristiche minuzie per un’efficace analisi comparativa incrociata. Questo approccio, noto come fingerprinting basato su modelli⁶,^7,è stato ispirato dal rilevamento biometrico delle impronte^{digitali 6}. I sistemi automatici di verifica biometrica delle impronte digitali, infatti, si basano su caratteristiche uniche della punta delle dita: biforcazioni e finali di cresta, localizzate ed estratte da impressioni inchiostrate o immagini dettagliate. Queste caratteristiche, denominate funzionalità delle minuzie, vengono quindi abbinate ai modelli memorizzati^{disponibili 8,9}.

Come accennato in precedenza, ogni modello di × GC×GC è ^{composto da picchi 2}D distribuiti razionalmente su un piano bidimensionale. Ogni picco corrisponde a un singolo alyte, ha il suo potenziale informativo e può essere trattato come una singola caratteristica per l’analisi comparativa dei modelli.

Qui presentiamo un approccio efficace per il rilevamento delle impronte digitali chimiche da parte di GC×GC-TOF MS con ionizzazione tandem. L’obiettivo è catalogare in modo completo e quantitativo le funzionalità da un set di cromatogrammi.

Rispetto al software commerciale esistente o alle routine internamente^{10,11 che}utilizzano un approccio basato sulle funzionalità di picco, il fingerprinting basato su modelli è caratterizzato da un’elevata specificità, efficienza e tempo computazionale limitato. Inoltre, ha una flessibilità intrinseca che consente il cross-alignment delle caratteristiche di minuzia (cioè ^{picchi 2}D) tra cromatogrammi gravemente disallineati come quelli acquisiti da diversa strumentazione o in studi a lungo termine^12,13,14.

Le operazioni di base del metodo proposto sono descritte brevemente per guidare il lettore verso una buona comprensione della ^{complessità e del potere informativo}del modello 2D. Quindi, esplorando la matrice di dati di uscita dello strumento, viene eseguita l’identificazione chimica e vengono conosciuti gli aliti mirati situati nello spazio bidimensionale. Il modello di picchi mirati viene quindi costruito e applicato a una serie di cromatogrammi acquisiti all’interno dello stesso lotto analitico. I metadati relativi ai tempi di conservazione, alle firme spettrali e alle risposte (assoluti e relativi) vengono estratti da modelli di picchi mirati ri-allineati e adottati per rivelare differenze compositive nel set di campioni.

Come ulteriore fase unica del processo, un rilevamento combinato delle impronte digitali non mirato e mirato (UT) viene eseguito anche su cromatogrammi pre-mirati per estendere il potenziale di rilevamento delle impronte digitali ad aaliti noti e sconosciuti. Il processo produce un modello UT per un’analisi comparativa davvero completa che può essere ampiamente automatizzata.

Come fase finale, il metodo esegue il cross-alignment delle caratteristiche in due segnali rivelatori paralleli prodotti con alte e basse energie di ionizzazione elettronica (70 e 12 eV).

Il protocollo è abbastanza flessibile nel supportare le analisi di un singolo cromatogramma o di un insieme di cromatogrammi e con cromatografia variabile e /o rivelatori multipli. Qui, il protocollo viene dimostrato con una suite software GC×GC disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali) combinata con una libreria MS e un software di ricerca (vedere Table of Materials). Alcuni degli strumenti necessari sono disponibili in altri software e strumenti simili potrebbero essere implementati indipendentemente dalle descrizioni in letteratura di Reichenbach e colleghi^{15,16,17,18,19}. I dati grezzi per la dimostrazione derivano da uno studio di ricerca sull’olio extravergine di oliva (EVO) condotto nel laboratorio degli autori¹⁴. In particolare, la frazione volatile (cioè volatilome) degli oli EVO italiani viene campiozzata per microesezione in fase solida headspace (HS-SPME) e analizzata da GC×GC-TOF MS per acquisire impronte diagnostiche per la qualità e la qualificazione sensoriale dei campioni. I dettagli sui campioni, le condizioni di campionamento e l’insieme analitico sono forniti nella tabella dei materiali.

I passaggi da 1 a 6 descrivono la pre-elaborazione dei cromatogrammi. I passaggi da 7 a 9 descrivono l’elaborazione e l’analisi dei singoli cromatogrammi. I passaggi da 10 a 12 descrivono la creazione e la corrispondenza dei modelli, che sono la base per l’analisi tra campioni. I passaggi da 13 a 16 descrivono l’applicazione del protocollo su un insieme di cromatogrammi, con i passaggi da 14 a 16 per l’analisi UT.

Protocol

1. Importazione di dati grezzi NOTA: in questo modo viene creata una matrice raster bidimensionale per la visualizzazione e l’elaborazione. Avviare il software di immagine. Selezionare File | Importazioni; passare al file di dati grezzi acquisito dal sistema GC×GC-TOF MS denominato “VIOLIN 101.lsc” (File aggiuntivo 1); quindi, fare clic su Apri. Il cromatogramma si apre in questo software.NOTA: il formato del file di dati grezzi dipende dal produttore dello strumento. Il software importa una varietà di formati di file elencati nella guida dell’utente. Nella finestra di dialogo Importa impostare il periodo di modulazione (PM) su 3,5 s; quindi fare clic su OK.NOTA: alcuni software di acquisizione potrebbero non registrare il periodo di modulazione. Selezionare File | Salvare l’immagine con nome; passare alla cartella desiderata; immettere il nome “Olio 1 RAW.gci” (File complementare 2); quindi fare clic su Salva. 2. Spostare la fase di modulazione NOTA: in questo modo tutti i picchi di ogni ciclo di modulazione entrano nella stessa colonna di immagine, inclusi i picchi che avvolgono intorno alla fine del periodo di modulazione nel tempo vuoto del successivo periodo dimodulazione 20. Selezionare Elaborazione | Fase di spostamento. Nella finestra di dialogo Fase di spostamento impostare l’importo del turno su -0,8 s; quindi fare clic su OK. 3. Correzione di base21 Selezionare grafica | Disegnare rettangolo. Fare clic e trascinare per disegnare un rettangolo nell’immagine in cui non vengono rilevati picchi. Selezionare Strumenti | Visualizzare i dati; notare la deviazione media e standard del segnale del rivelatore, qui, 21.850 ± 1.455 SD numero digitale senza unità (DN); quindi, chiudere lo strumento. Selezionare Elaborazione | Previsione corretta. 4. Colorare l’immagine cromatografica utilizzando una mappa dei valori e una mappa dei colori20 Selezionare Visualizza | Colorizzare. Nella finestra di dialogo Colorizza selezionare la scheda Importa/Esporta; selezionare la #AAAA di coloripersonalizzata (File complementare 3)fornita come materiale supplementare; quindi fare clic su Importa. Nei controlli Mapping valori impostare l’intervallo di valori sui valori minimo e massimo; quindi fare clic su OK. 5. 2picchi D (ad esempio, blob) rilevamento per aliti18 Selezionare Elaborazione | Rilevare blob con le impostazioni predefinite; quindi, osservare che alcuni picchi sono divisi e ci sono rilevamenti spuri. Selezionare Configura | Impostazioni | Rilevamento BLOB; quindi impostate Smussatura su 0,1 per la prima quota e 2,0 per la seconda dimensione e impostate volume minimo (cioè soglia per i valori sommati) su 1,00 E6; quindi fare clic su OK. Selezionare Elaborazione | Rilevare blob con le nuove impostazioni; quindi, osservare i miglioramenti. 6. Filtrazione dei picchi 2D NOTA: Questo viene fatto per rimuovere automaticamente i rilevamenti senza senso a causa di sanguinamenti di colonna lungo l’1D e colpi o code lungo il 2D. Selezionare Elaborazione | Rilevamento blob interattivo. Prendere nota delle impostazioni di rilevamento BLOB; quindi, fare clic su Rileva. Nel generatore di filtri avanzati fare clic su Aggiungi; Nella finestra di dialogo Nuovo vincolo selezionare Conservazione II; quindi fare clic su OK. Nei dispositivi di scorrimento Vincolo impostare i tempi di conservazione minimo e massimo 2D per il filtro per ridurre il numero di falsi picchi senza perdere picchi veri. Fare clic su Applica; quindi, fare clic su Sì per salvare le impostazioni di rilevamento con il nuovo filtro.NOTA: Potrebbero essere necessari strumenti più avanzati per affrontare particolari problemi di rilevamento, come il rilevamento dei picchi ionico o la deconvoluzione per le co-eluizioni19. 7. Calibrazione lineare degli indici di ritenzione NOTA: eseguire questo passaggio22 (IT) per i tempi di conservazione specifici nell’insieme di standard ri (retention index) (in genere n-alcani). Selezionare Configura | Tabella RI | Indice di conservazione (Col I). Nella finestra di dialogo Configurazione tabella RI fare clic su Importa; selezionare quindi il file di calibrazione RI (in formato CSV con nome, tempo di conservazione e indice di conservazione) denominato “Tabella LRI.csv” – (File aggiuntivo 4). Selezionare File | Salvare l’immagine A. Passare alla cartella desiderata; immettere il nome “Olio 1 LRI CALIBRATO.gci” (File complementare 5); quindi fare clic su Salva. 8. Ricerca degli spettri di picco nella libreria MS NIST1723 Selezionare Configura | Impostazioni | Libreria di ricerca. Nella finestra di dialogo Libreria di ricerca impostare Type of Spectrum su Peak MS, Intensity Threshold su 100, NIST Search Type su Simple (Similarity), NIST RI Column Type su Standard Polar e NIST RI Tolerance su 10; quindi fare clic su OK. NIST MS Search offre molte altre impostazioni impostate sulle impostazioni predefinite qui. Selezionare Elaborazione | Libreria di ricerca per tutti i BLOB. 9. Rivedere e correggere le identificazioni degli aliti Nella tavolozza degli strumenti impostare la modalità cursore su Blob | Selezionare Blob. Nella visualizzazione Immagine fare clic con il pulsante destro del mouse sul picco desiderato. Nella finestra di dialogo Proprietà BLOB esaminare le proprietà BLOB; quindi, fare clic su Hit List. Ispezionare la hit list; quindi, se l’identificazione non è corretta, selezionare il segno di spunta accanto all’identificazione corretta. Nella finestra di dialogo Proprietà BLOB immettere il nome del gruppo per designare la classe chimica e tutti gli altri metadati desiderati; quindi fare clic su OK. Selezionare File | Salvare l’immagine con nome; passare alla cartella desiderata; immettere il nome “Olio 1 COLORIZZATO per Template construction.gci” (File complementare 6); quindi fare clic su Salva.NOTA: Questo file è incluso nell’archivio supplementare, che può essere aperto per il passaggio 10. 10. Creare un modello con picchi mirati15 Nella visualizzazione Immagine (ancora in modalità Seleziona BLOB dal passaggio 9.1), selezionare i picchi desiderati con un clic sul primo picco e CTRL + fare clic sui picchi aggiuntivi. Nella tavolozza degli strumenti fare clic sul pulsante Aggiungi a modello. Al termine del modello, selezionare File | Salva modello; specificare la cartella e il nome del file; quindi fare clic su Salva. Selezionare File | Chiudi immagine.NOTA: a questo punto, queste istruzioni continuano con il modello creato per includere i picchi di destinazione desiderati, disponibili come “Targeted tamplate.bt” (File aggiuntivo 7). 11. Abbinare e applicare il modello NOTA: la corrispondenza riconosce il modello di modello nei picchi rilevati di un nuovo cromatogramma. Applicazione delle identificazioni dei set corrispondenti e di altri metadati nel nuovo cromatogramma dal modello. Selezionare File | Apri immagine; passare al file cromatogramma “Oil 2 COLORIZED.gci” (File supplementare 8), che viene pre-elaborato; quindi, fare clic su Apri. Nella tavolozza degli strumenti impostare la modalità cursore su Template | Selezionare Oggetti. Selezionare Modello | Modello di caricamento. Nella finestra di dialogo Carica modello fare clic su Sfoglia; passare al modello di picchi di destinazione “Targeted template.bt” ( SupplementaryFile 7); quindi, fare clic su Apri. Nella finestra di dialogo Carica modello fare clic su Caricae quindi su Ignora. Nella visualizzazione Immagine fare clic con il pulsante destro del mouse su un picco di modello; quindi, ispezionare le relative proprietà dell’oggetto, incluso il qCLIC e l’MS di riferimento. Selezionare Modello | Modello interattivo di corrispondenza e trasformazione. Nell’interfaccia Corrispondenza interattiva fare clic su Corrispondenza tutto; quindi, esaminare i risultati corrispondenti sia nella tabella che nell’immagine, in cui ogni picco del modello è contrassegnato da cerchi non riempiti e, se viene effettuata una corrispondenza, esiste un collegamento a un cerchio riempito per il picco rilevato. Modificate le corrispondenze come desiderato; una volta soddisfatti, fare clic su Applica per trasferire metadati dal modello al cromatogramma.NOTA: i vincoli corrispondenti, ad esempio qCLIC, aiutano a corrispondere al modello corretto tra i picchi rilevati del nuovo cromatogramma. I parametri di vincolo includono il tipo di firma MS utilizzata come riferimento al modello (MS di picco o MS BLOB) e i valori di soglia per la somiglianza spettrale (DMF (Direct Match Factor) e Reverse Match Factor (RMF)). Qui, i parametri sono impostati sulla base distudi precedenti 13,14 per limitare le corrispondenze false negative: picco MS e DMF e soglia di somiglianza RMF 700. 12. Trasforma il modello per una cromatografia sostanzialmente diversa NOTA: Questo passaggio non è necessario a meno che le condizioni cromatografiche non varino sostanzialmente causando un disallineamento del modello con un nuovo cromatogramma, come può essere il caso negli studi a lungo termine o dopo l’installazione di una nuova colonna. In questi casi, il modello può essere trasformato geometricamente nel piano cromatografico dei tempi di ritenzione per adattarsi meglio al nuovo cromatogramma12,13. In questo esempio, i modelli di picco del modello e del cromatogramma sono simili, ma differiscono nella geometria dei tempi di ritenzione, ad esempio per condizioni cromatografiche diverse. Ripetere i passaggi da 11.2 a 11.5, ad eccezione di passare a, selezionare e caricare il modello di destinazione 2.bt ( Fileaggiuntivo 9). Selezionare Modello | Modello di corrispondenza interattivo; quindi, fare clic su Modifica trasformazione. Nell’interfaccia Trasforma modello variare le scale, le traduzioni e le cesoie 1D e 2D per allineare meglio il modello ai picchi rilevati; quindi fare clic su Trasforma modello. Con il modello trasformato, fare clic su Modifica corrispondenza; quindi, ripetere i passaggi 11.8–11.9. 13. Eseguire analisi combinate non mirate e mirate su una serie di cromatogrammi NOTA: un modello combinato non mirato e mirato (UT), noto anche come modello di funzionalità 24,25,se abbinato a ciascuno di un insieme di cromatogrammi, stabilisce corrispondenze tra alyti non mirati e mirati, quindi vengono estratte funzionalità di campionamento incrociato coerenti per il riconoscimento dei pattern. Eseguire la pre-elaborazione (passaggi da 1 a 6) e la corrispondenza dei modelli UT (passaggi 11.1-11.9) per tutti i cromatogrammi nel set (ad esempio, cromatogrammi 2D di oli). In alternativa, automatizzare questo passaggio con software di progetto o software simile, non descritto qui. Avviare il software Investigator. Selezionare File | Analisi aperta; quindi, selezionare e aprire “Feature Jove su 70 eV.gca” (File supplementare 10). Fare clic su OK per aprire ed esaminare i risultati. Fare clic sulla scheda Composti per esaminare i valori metrici e le statistiche per aaliti specifici (ad esempio, aliti mirati con nomi chimici associati) o aaliti non mirati con identificatori (#) allineati su tutti i cromatogrammi, quindi eseguire i passaggi seguenti. Fare clic sulla scheda Attributi per esaminare i valori e le statistiche per metriche specifiche tra i cromatogrammi. Fare clic sulla scheda Riepilogo per esaminare le statistiche di riepilogo sia per i composti che per le funzionalità. Se i cromatogrammi provengono da classi diverse, come in questo caso gli oli prodotti da olive raccolte in due diverse regioni d’Italia, la scheda Riepilogo elenca le statistiche del rapporto Fisher (F e FDR), che forniscono approfondimenti sulle caratteristiche per discriminare tra le classi. Visualizzare vari grafici in tutte le schede e, se lo si desidera, eseguire Analisi componenti principali (PCA) nella scheda Attributi. 14. Modificare il modello UT per l’analisi MS parallela NOTA: L’analisi è stata eseguita con energie di ionizzazione elettronica sia 70 eV che 12 eV (cioè alte e basse) energie di ionizzazioneelettronica 26,27. Aprire uno dei 12 cromatogrammi eV, ad esempio “Olio 1 12 eV RAW.gci” (File supplementare 11),eseguire la pre-elaborazione (passaggi da 1 a 6) e caricare il modello UT “modello UT 70 relaxed.bt” (File supplementare 12) come descritto nei passaggi 11.1-11.6. I file sono forniti come materiale supplementare. Se necessario, regolare il modello in base ai 12 picchi di eV rilevati come descritto nel passaggio 12. Qui, non c’è un disallineamento significativo perché i segnali tandem sono multiplexati. Tuttavia, va notato che poiché le diverse impostazioni di ionizzazione producono diverse frammentazioni, è necessario allentare i vincoli per i vincoli qCLIC sulla somiglianza spettrale DMF e RMF (non dimostrata qui). Selezionare File | Salva modello; specificare la cartella e il nome del file, ad esempio “Modello UT 12.bt” (File complementare 13); quindi fare clic su Salva. 15. Eseguire analisi combinate non mirate e mirate su 12 cromatogrammi eV Selezionare File | Analisi aperta; quindi selezionare e aprire “Feature Jove su 12 eV.gca” – File supplementare 14 fornito. Fare clic su OK per aprire ed esaminare i risultati. Fare clic sulla scheda Composti per esaminare i valori metrici, fare riferimento a 12 risposte eV e statistiche per aaliti specifici (ad esempio, aliti mirati con nomi chimici associati) o aaliti non mirati con identificatori (#) allineati su tutti i cromatogrammi, quindi eseguire i passaggi seguenti. Fare clic sulla scheda Attributi per esaminare i valori e le statistiche per metriche specifiche tra i cromatogrammi. Fare clic sulla scheda Riepilogo per esaminare le statistiche di riepilogo sia per i composti che per le funzionalità a 12 eV. Se i cromatogrammi provengono da classi diverse, come in questo caso gli oli prodotti da olive raccolte in due diverse regioni d’Italia, la scheda Riepilogo elenca le statistiche del rapporto Fisher (F e FDR), che forniscono approfondimenti sulle caratteristiche per discriminare tra le classi. Visualizzare i vari grafici disponibili in tutte le schede e, se lo si desidera, eseguire Analisi componenti principali (PCA) nella scheda Attributi.

Representative Results

I modelli GC×GC-TOF MS di volatilome di olio extravergine di oliva di alta qualità mostrano circa 500 picchi 2D al di sopra di una soglia di rapporto segnale/rumore (SNR) di 100. Tale soglia è stata definita da precedenti indagini sulle sostanze alimentari volatili14,27 come il segnale relativo minimo oltre la soglia per ottenere spettri affidabili per l’analisi comparativa incrociata. I componenti sono distribuiti sullo spazio cromatografico in base alla loro relativa ritenzione nelle due dimensioni cromatografiche, e specificamente in base alla loro volatilità /polarità nell’1D e alla volatilità nel 2D. Qui, la combinazione di colonne è × semipolare (cioè Carbowax 20M × OV1701). Il modello 2Dmostra un alto grado di ordine. I modelli di ritenzione relativa per serie e classi omologhe sono mostrati nella figura 1A con annotazioni (grafica per gruppi e bolle per picchi) per idrocarburi saturi lineari (nero), idrocarburi insaturi (giallo), aldeidi sature lineari (blu), aldeidi monoinsaturi (rosso), aldeidi polinsaturi (salmone), alcoli primari (verde) e acidi grassi a catena corta (cyano). I picchi 2Drilevati possono quindi essere identificati confrontando lo spettro MS medio estratto dall’intero picco 2D(spettro blob) o dallo spettro più grande(spettro apice). La figura 2 illustra l’output della ricerca dello spettro apice per blob 5 e restituisce una corrispondenza ad alta somiglianza (primi 10 colpi) per (E)-2-exenal. I database esplorati sono quelli preselezione dall’analista nel passaggio 8 del metodo. L’identificazione viene convalidata dall’indicizzazione della conservazione attiva. Il valore sperimentale IT è stato calcolato per i picchi 2D,in modo che in questa fase la ricerca della libreria dia la priorità ai risultati con valori coerenti di ITtabulato. Le finestre di tolleranza possono essere personalizzate in base all’esperienza degli analisti, all’affidabilità dei valori di database di riferimento in base alla fase stazionaria e alle condizioni analitiche applicate. Nuovi strumenti per la calibrazione intelligente degli indici di ritenzione lineare senza calibrazione sperimentale con n-alcani, sono stati recentemente sviluppati e discussi in uno studio di Reichenbach et al19. La raccolta dei picchi identificati 2D(cioè picchi mirati) può essere adottata per costruire un modello di picchi mirati per stabilire prontamente corrispondenze affidabili tra lo stesso composto in tutti i cromatogrammi campione. L’insieme dei picchi di modelli di destinazione viene visualizzato nella figura 1B. I cerchi rossi corrispondono ai 196 composti mirati, inclusi due standard interni (IS) collegati ai picchi dei modelli con linee di connessione. L’IS viene utilizzato per la normalizzazione delle risposta e le linee di connessione consentono di visualizzare quale dell’IS incluso verrà adottato per normalizzare ogni risposta di picco/BLOB 2D. Nella figura 1B, i cerchi riempiti indicano corrispondenze positive tra il picco del modello e il modello effettivo, mentre i cerchi vuoti sono per i picchi dei modelli per i quali la corrispondenza non è stata verificata. Le corrispondenze false negative possono essere limitate da un’appropriata selezione di parametri di soglia, spettri di riferimento e funzioni divincolo 13,14,18,19. Per modelli complessi con co-eluizioni multiple, le funzioni di rilevamento del picco ionico basate sulla deconvoluzione spettrale sono consigliabile e potrebbero essere un’opzionevalida 19. I metadati di picco del modello vengono visualizzati nel pannello ingrandito della figura 1B per (E)-2-exenal. La specificità della corrispondenza dei modelli si basa sulla possibilità di applicare funzioni di vincolo che limitano la corrispondenza positiva a quei picchi candidati che, rientrando nella finestra di ricerca dell’algoritmo, hanno somiglianza spettrale MS al di sopra di una certa soglia. In questo caso, nella fase 11, le soglie di somiglianza23 sono state fissate a 700 secondo precedenti esperimenti volti a definire parametri ottimali che limitavano le corrispondenze false negative14. Le aree evidenziate delle proprietà di picco del modello nella figura 1B mostrano le informazioni sulla stringa di spettro MS di riferimento e sulla funzione di vincolo qCLIC (ad esempio, (Match(“”) >= 700.0) e (RMatch(“”) >= 700.0)). Applicando il modello a tutti i cromatogrammi di un insieme, si potrebbero incontrare situazioni impegnative come nel caso di disallineamento parziale dei modelli. Ciò può essere dovuto a incongruenze di temperatura del forno, instabilità del flusso/pressione del gas portante o a causa di un intervento manuale sul sistema come nel caso della sostituzione della colonna o della sostituzione del loop-capillaremodulatore 14,28. La figura 3 mostra una situazione di disallineamento parziale tra il modello di destinazione e il cromatogramma effettivo. Per disallineamenti minimi, le trasformazioni interattive dei modelli (Figura 3, pannello di controllo) possono riposizionare i picchi dei modelli per una migliore vestibilità. Una volta riposizionato, il modello può essere abbinato per stabilire corrispondenze. Nell’esempio, i picchi del modello (Figura 3, passaggio 12 ) corrispondono correttamente al modello 2Deffettivo. In caso di gravi disallineamenti, non discussi qui, la ripetizione delle azioni di aggiornamento della trasformazione della corrispondenza può adattare iterativamente la posizione dei picchi del modello al modello di piccoeffettivo 12,13,14. Qui, i picchi mirati (cioè gli aliti noti) forniscono circa il 40% del risultato cromatografico (196 picchi mirati di circa 500 picchi rilevabili in media). L’altro 60% dei composti, insieme alle informazioni che portano, non viene preso in considerazione in un’analisi mirata. Per rendere l’indagine davvero completa e coerente, dovrebbe essere stabilito anche un allineamento incrociato dei picchi 2Dnon mirati. La prima applicazione in cui la corrispondenza dei modelli è stata estesa a tutti gli aliti rilevabili ha affrontato il complesso volatilome di caffè tostato7. Questo processo è automatizzato con un software (ad esempio, Investigator), mostrato qui nei passaggi 14-15. In questo processo, le immagini pre-mirate appartenenti al set di campioni in esame (20 campioni) vengono utilizzate per definire picchi affidabili incrociando tutti i modelli di immagine29. Successivamente, viene creato un cromatogramma composito da cui è possibile identificare picchi affidabili UT e regioni di picco (ad esempio, ingombro di picchi 2D) nel cosiddetto modello di funzionalità17. Per le analisi acquisite a 70 eV, il processo ha determinato 144 picchi affidabili con affidabilitàrilassata 29,76 dei quali appartengono all’elenco dei picchi mirati. Sulla base di questi 144 picchi affidabili, il processo allinea tutti i cromatogrammi in modo coerente con i tempi medi di ritenzione dei picchi affidabili e quindi li combina per creare un cromatogramma composito. La figura 4 mostra un elenco di tutti i campioni etichettati in base alla regione di produzione dell’olio (a sinistra) e l’elenco dei picchi/volumi blob affidabili in ciascun campione (a destra). Il modello di funzionalità non mirato è composto da picchi 2Dda aliti rilevati nel cromatogramma composito, mostrato nella figura 5A, che corrispondono al modello dei picchi affidabili (n = 168 – cerchi rossi per picchi mirati e cerchi verdi per picchi non mirati). Gli spettri di massa dei picchi compositi, così come i loro tempi di ritenzione, sono registrati nel modello di feature come mostrato per l’acetato di (Z)-3-exenolo nell’area allargata. Le regioni di picco sono mostrate nella figura 5B come grafica di colore rosso; sono invece definiti dai contorni di tutti i picchi 2Drilevati nel cromatogramma composito (n = 3578). Quando il riconoscimento non supervisionato del modello da parte di Principal Component Analysis viene applicato alla distribuzione mirata dei picchi all’interno dei 20 campioni analizzati, gli oli siciliani e toscani si raggruppano separatamente suggerendo che le condizioni pedoclimatiche e il terroir hanno un impatto sulla prevalenza relativa delle sostanze volatili. I risultati sono riportati nella figura 6A e i risultati dell’APC derivanti dalla distribuzione affidabile dei picchi sono riportati nella figura 6B. I due approcci convalidano incrociatamente che gli oli provenienti da diverse aree geografiche hanno firme chimiche diverse, mentre sono mappate firme chimiche coerenti, siano essi composti mirati o non mirati, o entrambi. Infine, il software consente un rapido ed efficace riabilitazione dei modelli attraverso canali di rilevamento paralleli. In questa applicazione, il rilineamento viene proposto per i segnali di ionizzazione tandem. La sorgente ioniche dei multiplex MS tra due energie di ionizzazione (cioè 70 e 12 eV) ad una frequenza di acquisizione di 50 Hz per canale30. I due modelli cromatografici risultanti sono strettamente allineati, mentre i dati spettrali (cioè le firme spettrali e le risposte) portano informazioni complementari con diversi intervallidinamici di risposta 26,27. I modelli allineati consentono di estrarrele feature (picchi 2D e regioni di picco) con ID univoci (ad esempio, nomi chimici per picchi mirati e numero di numerazione univoco per picchi non mirati e regioni di picco). La corrispondenza dei modelli consente un allineamento incrociato efficace. In questa situazione, non c’è molto disallineamento, ma i vincoli MS devono essere allentati per consentire corrispondenze per i picchi UT. D’altra parte, le regioni di picco UT in primo piano, che non hanno vincoli MS, vengono prontamente abbinate senza false corrispondenze negative. La figura 5C mostra un’area ingrandita di un cromatogramma da 12 eV in cui viene abbinato il modello di funzionalità creato da 70 dati eV. I picchi UT affidabili sono positivamente abbinati a causa dei vincoli qCLIC abbassati (ad esempio, soglia DMF a 600). Da notare, a 12 eV, ci sono meno picchi rilevati a causa della limitata frammentazione indotta da una bassa energia di ionizzazione. Figura 1: Plot di contorno bidimensionale e modello di destinazione. (A) Appezzamento di contorno della frazione volatile di un olio extravergine di oliva toscano. I modelli ordinati di serie e classi omologhe sono evidenziati con diversi colori e linee: idrocarburi saturi lineari (linea nera e contorni 2D) idrocarburi insaturi (giallo), aldeidi sature lineari (blu) aldeidi monoinsaturi (rosso), aldeidi polinsaturi (salmone), alcoli primari (verde) e acidi grassi a catena corta (ciano). (B) Modello mirato sovrapposto di aaliti noti (cerchi di colore rosso) con linee di connessione che collegano gli standard interni (IS). I pannelli mostrano i metadati delle proprietà di picco/BLOB 2D (Decanal) o le proprietà di picco del modello. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Ricerca Apex MS. Output della ricerca MS apice per BLOB 5. Elenco delle voci del database con la corrispondenza di somiglianza più elevata e dei metadati correlati disponibili nella raccolta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Riallineamento dei modelli. Flusso di lavoro che illustra i passaggi che consentono il riabilitamento del modello per trasformazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Interfaccia gc investigator. Pannello di ricerca con tutte le immagini selezionate etichettate in base alla regione di produzione dell’olio (a sinistra) e l’elenco dei picchi/volumi blob affidabili in ogni campione (a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Modello mirato e UT. (A) Picchi affidabili derivanti dall’elaborazione automatizzata nella fase 11; i cerchi rossi corrispondono agli aaliti noti mentre i cerchi verdi sono sconosciuti. Nel pannello sovrapposto, le proprietà dell’oggetto modello vengono visualizzate per il (Z)-3-hexenal. (B) Area allargata che mostra i picchi UT (cerchi rossi e verdi) e le regioni di picco (grafica rossa) del modello UT abbinati su un olio campione acquisito a 70 energia di ionizzazione eV. (C) Modello UT abbinato ad un olio campione acquisito a 12 eV di ionizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Grafici di carico PCA. Essi mostrano la conformazione naturale dei campioni (oli provenienti dalla Toscana e dalla Sicilia) come risultato della distribuzione mirata dei picchi(A)o della distribuzione dei picchi UT (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. File supplementari. Clicca qui per scaricare questi file.

Discussion

La visualizzazione dei dati GC×GC-TOF MS è un passaggio fondamentale per un’adeguata comprensione dei risultati ottenuti da separazioni bidimensionali complete. I grafici di immagini con colorazione personalizzata consentono agli analisti di apprezzare le differenze di risposta del rivelatore e quindi la distribuzione differenziale dei componenti del campione. Questo approccio visivo cambia completamente la prospettiva degli analisti sull’interpretazione e l’elaborazione dei cromatogrammi. Questo primo passo, una volta compreso e utilizzato con sicurezza dai cromatografi, apre una nuova prospettiva nell’ulteriore elaborazione.

Un altro aspetto fondamentale dell’elaborazione dei dati è l’accessibilità alla matrice di dati completa (cioè dati spettrali MS e risposte) per tutti i punti campione, ognuno dei quali corrisponde a un singolo evento rivelatore. A questo ^{proposito, 2}D raggiunge il picco di integrazione, in modo che la raccolta di eventi rivelatori corrispondenti a un singolo alita rappresenti un passo critico. Nel protocollo attuale, il rilevamento dei picchi ^2Dsi basa sull’algoritmo^{spartiacque 18} con alcuni adattamenti inclusi per migliorare la sensibilità di rilevamento in caso di composti co-eluizzanti parziali. Per rendere questo processo più specifico, è necessario effettuare la deconvoluzione e adottare procedure più sofisticate. Ciò è possibile eseguendo un rilevamento del picco ionici per i dati MS; l’algoritmo elabora la matrice di dati e isola la risposta da singoli aliti in base ai profili^{spettrali 19,31}.

Un passaggio importante ma critico del protocollo e di qualsiasi processo di interpretazione dei dati GC×GC-MS, riguarda l’identificazione degli aaliti. Questa procedura, proposta nelle fasi 8 e 9, in assenza di un’analisi di conferma con standard autentici, deve essere condotta con attenzione dall’analista. Le azioni automatizzate sono disponibili in qualsiasi software commerciale; includono la valutazione della somiglianza della firma spettrale MS rispetto agli spettri di riferimento raccolti (cioè le librerie spettrali) e la valutazione dei rapporti caratteristici tra gli ioni qualificatore/quantificatore. Tuttavia, sono necessari ulteriori criteri di conferma per disambiguare l’identificazione degli isomeri. Il protocollo propone l’adozione di indici di conservazione lineare per dare priorità all’elenco dei candidati; il limite qui riguarda la disponibilità dei dati di conservazione e la loro coerenza.

La caratteristica principale che rende unico questo approccio è la corrispondenza dei^{modelli 12,13,15,29}. La corrispondenza dei modelli consente il riconoscimento del modello ^2Din modo molto efficace, specifico e intuitivo. Può essere impostato, in termini di sensibilità e specificità, applicando valori soglia personalizzati e/o funzioni di vincolo mentre l’analista può supervisionare la procedura interagendo attivamente con i parametri della funzione di trasformazione. La particolarità di questo processo si basa sulla possibilità di incrociare le informazioni sui picchi mirati e non mirati tra campioni di un lotto uniforme ma anche tra campioni acquisiti con le stesse condizioni nominali nonostante il disallineamento medio-grave. I vantaggi di questa operazione riguardano la possibilità di preservare tutte le identificazioni degli aaliti mirati, che è un’attività dispendiosa in termini di tempo per l’analista, e tutti i metadati salvati per picchi mirati e non mirati dalle sessioni di elaborazione precedenti.

La corrispondenza dei modelli è anche molto efficace in termini di tempo computazionale; I file di dati MS a bassa risoluzione sono costituiti da circa 1-2 Gb di dati imballati, mentre le analisi MS ad alta risoluzione possono raggiungere i 10-15 Gb per singola esecuzione analitica. La corrispondenza dei modelli non elabora ogni volta la matrice di dati completa, ma, all’inizio, esegue l’allineamento del tempo di conservazione tra i cromatogrammi utilizzando i picchi dei modelli, quindi elabora i picchi dei candidati all’interno della finestra di ricerca per la corrispondenza di somiglianza con il riferimento nel modello. In caso di grave disallineamento, la situazione più impegnativa, le trasformazioni polinomiali globali di secondo ordine hanno funzionato meglio dei metodi locali riducendo al contempo il tempo computazionale¹³.

Affinché la tecnica GC×GC si diffonda ampiamente oltre il mondo accademico e i laboratori di ricerca, gli strumenti di elaborazione dei dati devono facilitare le operazioni di base per la visualizzazione e l’ispezione dei cromatogrammi; l’identificazione degli aaliti dovrebbe offrire la possibilità di adottare algoritmi e procedure standardizzati (ad esempio, algoritmo di ricerca NIST e calibrazione I^T); e l’analisi comparativa dovrebbe essere intuitiva, efficace e supportata da strumenti interattivi. L’approccio proposto risponde a queste esigenze offrendo al contempo opzioni e strumenti avanzati per affrontare situazioni complesse come la co-eluizione degli aliti, la calibrazione di aliti multipli, l’analisi di tipo gruppo e l’allineamento del rilevamento parallelo.

La letteratura referenziata copre bene molti possibili scenari in cui GC×GC e, più in generale, cromatografia bidimensionale completa, offrono soluzioni uniche e risultati affidabili che non possono essere raggiunti ^{da 1}cromatografia D nell’analisi a esecuzione singola. ^{5,32,33 Sebbene} GC×GC sia lo strumento più potente che aumenta la capacità di separazione e la sensibilità, ci sono sempre limitazioni alla potenza di separazione, alla sensibilità e ad altre capacità sistemiche. Con l’avvicinarsi di questi limiti sistemici, l’analisi dei dati diventa progressivamente più difficile. Pertanto, la ricerca e lo sviluppo devono continuare a migliorare gli strumenti analitici a nostra disposizione.

Materials

1D SolGel-Wax column (100% polyethylene glycol; 30 m × 0.25 mm dc × 0.25 μm df). Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min.	Trajan SGE Analytical Science, Ringwood, Australia	PN 054796	Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. Oven temperature programming set as follows: 40°C (2 min) to 240°C (10 min) at 3.5°C/min.
2D OV1701 column (86% polydimethylsiloxane, 7% phenyl, 7% cyanopropyl; 1 m × 0.1 mm dc × 0.10 μm df) from .	Mega, Legnano, Milan, Italy	PN MEGA-1701
Automated system for sample preparation: SPR Autosampler for GC	SepSolve-Analytical, Llantrisant, UK
Extra Virgin Olive oils: Sicily and Tuscany, Italy	Project VIOLIN (Ager – Fondazioni in rete per la ricerca agroalimentare)		Samples (n=10) were collected during the production year 2018 within the "Violin" project sampling campaign. Oils were submitted to HS-SPME to sample volatiles according to a reference protocol validated in a previous study of Stilo et al.14
Gas chromatograph: Model 7890B GC	Agilent Technologies Wilmington DE, USA
GC Image GC×GC edition V 2.9	GC Image LLC, Lincoln, Nebraska		https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html
Image processing software	GC Image LLC, Lincoln, Nebraska		https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html
Mass spectrometer: BenchTOF-Select	Markes International Llantrisant, UK
Methyl-2-octynoate (CAS 111-12-6)	Merck-Millipore/Supelco	PN: 68982
Modulator controller: Optimode v2.0	SRA Intruments, Cernusco sul Naviglio, Milan, Italy
Modulator: KT 2004 loop type	Zoex Corporation Houston, TX, USA
MS library and search software: NIST Library V 2017, Software V 2.3	National Institute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg MD		https://www.nist.gov/srd/nist-standard-reference-database-1a-v17
n-alkanes C8-C40 for retention indexing	Merck-Millipore/Supelco	PN: 40147-U
n-hexane (CAS 110-54-3) gas chromatography MS SupraSolv	Merck-Millipore/Supelco	PN: 100795
Solid Phase Microextraction fiber	Merck-Millipore/Supelco	PN 57914-U
α- /β-thujone (CAS 546-80-5)	Merck-Millipore/Sigma Aldrich	PN: 04314