异种移植模型中循环猪特异性DNA的定量

Summary

在该协议中，设计了猪特异性底剂，构建了含质粒的猪特异性DNA片段，并建立了定量标准曲线。使用物种特异性底法，cpsDNA在猪对小鼠细胞移植模型和猪对猴子动脉贴片移植模型中通过qPCR进行量化。

Abstract

异种移植是治疗器官衰竭的可行方法。然而，如何有效地监测异种移植的免疫排斥是医生和研究人员面临的一个问题。本手稿介绍了一种简单有效的方法来监测猪对老鼠细胞移植模型和猪对猴子动脉贴片移植模型中的免疫排斥。循环DNA是一种潜在的非侵入性生物标志物，用于器官损伤。在这项研究中，通过定量实时PCR（qPCR）监测猪特异性DNA（cpsDNA） 在异种移植排斥过程中。在该协议中，设计了猪特异性底剂，构建了含质粒的猪特异性DNA片段，并建立了定量标准曲线。然后，在猪对小鼠细胞移植模型和猪对猴子动脉贴片移植模型中，使用物种特异性底剂通过 qPCR 对 cpsDNA 进行量化。该方法的价值表明，它可以作为一种简单、方便、低成本、侵入性较小的方法来监测异种移植的免疫排斥。

Introduction

器官衰竭是导致1人死亡^{的主要原因之一}。细胞、组织和器官移植是治疗器官衰竭^{的有效方法}。然而，捐赠器官的短缺限制了这种方法的临床应用^3，4。研究表明，猪可以作为人体器官的潜在来源进行临床^{移植5，6。}然而，跨物种器官移植面临危险的免疫排斥。因此，监测异种移植的免疫排斥至关重要。目前，免疫排斥的临床监测主要取决于患者的体征和症状，以及实验室测试（如活检、免疫生化分析和超声波）7、8、9。但是，这些监视方法有许多缺点。患者免疫排斥的体征和症状通常^晚10晚出现，不利于早期发现和早期干预;活检有侵入性^11的缺点，患者不容易接受;免疫生物化学分析缺乏敏感性或特异性，超声波是辅助的，而且价格昂贵。因此，寻找一种有效、方便的方法来监测免疫排斥是当务之急。

循环DNA是一种在血液中发现的细胞外DNA。曼德尔和梅^泰斯12号在1948年首次报告了周围血液中存在循环DNA。在正常的生理条件下，健康人血液中的循环DNA在基线上相对较低。然而，在一些病理，如肿瘤，心肌梗死，自身免疫性疾病，移植排斥，循环DNA水平在血液中可以显著增加^13，14由于大量释放循环DNA引起的凋亡和坏死因子。循环DNA的起源与凋亡和坏死¹⁵有关，这是异种移植排斥^16的特征。

循环DNA已被证明是一种微创生物标志物，用于检测^{癌症17，18，19。}供体衍生循环DNA的高直通测序是检测器官移植^{20、21后排斥的可靠方法}。然而，这种方法要求高浓度和中提取的DNA质量。除了高昂的成本和时间消耗外，DNA要求使这种方法没有资格用于常规临床应用。供体衍生的循环DNA可以通过定量实时PCR（qPCR）精确量化，它既具体又敏感。因此，通过qPCR量化猪循环DNA是监测异种移植免疫排斥的可行方法。这具有较少的侵入性、高度敏感和特异性、低成本和节省时间。猪和人类在基因上是分开的，基因组序列完全不同（图1）。因此，循环的猪DNA可以释放到接受者的血液后异种移植由于异种排斥。CpsDNA 可以通过 qPCR 精确量化，在接受者血液中使用物种特异性底剂。此前，我们已经论证了cpsDNA作为异种移植^{22，23的生物标志物的理由和可行性}。在这里，我们披露更多的实验技巧和细节。实验由以下步骤组成。首先，设计了猪特异性底剂，分离了基因组DNA，用于通过常规PCR验证底源剂的特异性。其次，构建cpsDNA的标准曲线，将cpsDNA与样本血隔离。最后，使用qPCR对循环猪特异性DNA进行量化。

Protocol

所有实验都是按照深圳市第二人民医院、深圳市第一附属医院机构审查委员会的有关指导意见和规定进行的。 1. 设计猪专用底剂 使用软件NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）进行全基因组爆炸分析，以识别与人类、猴子或小鼠不同的www.ncbi.nlm.nih.gov。 使用底像5的软件根据19个猪特异性基因（表1）设计底像。 2. 隔离基因组DNA <p class="jo…

Representative Results

在该协议中，设计了猪特异性底剂，构建了含有质粒的猪特异性DNA片段，并建立了定量标准曲线（图4）。19种底数的物种特异性得到PCR的确认。然后，在猪对小鼠细胞移植模型和猪对猴子动脉贴片移植模型中，使用物种特异性底像（底像#4和底像#11）通过qPCR对cpDNA进行量化。 Agarose电泳用于从上述样品中分离放大的DNA片段，然后在紫外线成像器中可视化?…

Discussion

量化猪循环DNA是监测异种移植的免疫排斥的可行方法。Gadi等人²⁴ 日发现，急性排斥患者血液中的供体衍生循环DNA（ddcfDNA）含量明显高于无排斥患者的血液中。这些研究表明，ddcfDNA可能是监测器官移植损伤的常见生物标志物。近年来，qPCR由于操作简单、自动化程度高、灵敏度高、特异性好、成本低，在核酸分析中应用日益深入。

本研究中，根据生物信息学?…

Materials

Agarose	Biowest, Barcelona, Spain	111860
BamHI-HF	New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA	R3136S
1.5 mL microcentrifuge tube	Axygen Biosciences, Union City, CA, USA	MCT-150-C
0.2 mL PCR tube	Axygen Biosciences, Union City, CA, USA	PCR-02-C
C57BL/6 Mice	Medical Animal Center of Guangdong Province,  China		8~10 weeks
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA	Micro 21R
2-Log DNA Ladder	New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA	N3200S	0.1–10.0 kb
Marker I	Tiangen, Beijing, China	MD101-02	0.1–0.6 kb
DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns)	Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA	DNACOL-01
DNA loading buffer	Solarbio, Beijing, China	D1010
E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II	Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA	D6942
		D6943
EcoR I	Takara Bio, Shiga, Japan	1040S
Female Bama mini pigs	BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China		2~4 months
Genomic DNA Extraction Kit Ⅰ	Tiangen, Beijing, China	DP304-02
SYBR Green Realtime PCR Master Mix	Toyobo, Osaka, Japan	QPK-201
Gel Doc XR	Bio-Rad, Hercules, USA
Male cynomolgus monkeys	Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China		8 years
Nucleic acid dye(Gelred)	Biotium, Fremont, USA	42003
polymerase(Premix Taq)	Takara Bio, Shiga, Japan	RR901A
pMD19-T plasmid	Takara Bio, Shiga, Japan	D102A
qPCR machine	Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA
Serum/Circulating DNA Extraction Kit	Tiangen, Beijing, China	DP339
TAE	sangon Biotech, Shanghai, China	B548101