제노이식 모델의 혈액에서 순환 돼지 특이적 DNA의 정량화
Summary
이 프로토콜에서, 돼지 특이적 프라이머는 설계되었고, 플라스미드함유 돼지 특이적 DNA 단편이 시공되었고, 수량에 대한 표준 곡선이 확립되었다. cpsDNA는 종별 프라이머를 사용하여 돼지-마우스 세포 이식 모델 및 돼지-원숭이 동맥 패치 이식 모델에서 qPCR에 의해 정량화되었다.
Abstract
제노이식은 장기 부전을 치료하는 실현 가능한 방법입니다. 그러나, xeno이식의 면역 거부를 효과적으로 감시하는 방법은 의사와 연구원을 위한 문제입니다. 이 원고는 돼지 대 마우스 세포 이식 모델 및 돼지 – 투 – 원숭이 동맥 패치 이식 모델에서 면역 거부를 모니터링하는 간단하고 효과적인 방법을 설명합니다. 순환 DNA는 장기 손상을 위한 잠재적으로 비침습적인 바이오마커입니다. 이 연구에서는, 순환돼지 특이적 DNA(cpsDNA)는 정량적 실시간 PCR(qPCR)에 의해 제노이식 거부 중에 모니터링되었다. 이 프로토콜에서, 돼지 특이적 프라이머는 설계되었고, 플라스미드함유 돼지 특이적 DNA 단편이 시공되었고, 수량에 대한 표준 곡선이 확립되었다. 종별 프라이머는 돼지-마우스 세포 이식 모델 및 돼지-원숭이 동맥 패치 이식 모델에서 qPCR에 의해 cpsDNA를 정량화하는 데 사용되었다. 이 방법의 가치는 xeno이식의 면역 거부를 모니터링하기 위해 간단하고 편리하며 저렴한 비용 및 덜 침습적 인 방법으로 사용될 수 있음을 시사합니다.
Introduction
장기 실패는사망1의 주요 원인 중 하나입니다. 세포, 조직 및 장기의 이식은 장기 부전2를치료하는 효과적인 방법입니다. 그럼에도 불구하고, 기증자 기관의 부족은 이 방법의 임상 적용을제한3,4. 연구 결과에 따르면 돼지는 임상이식을위한 인간 장기의 잠재적 인 원천으로 사용될 수 있음을 보여 주었다5,6. 그러나, 종 간 장기 이식은 위험한 면역 거부에 직면. 따라서, xeno 이식의 면역 거부를 모니터링 하는 것이 중요 하다. 현재 면역 거부의 임상 모니터링은 주로 환자의 징후와 증상뿐만 아니라 실험실 테스트 (예를 들어, 생검, 면역 생화학 적 분석 및 초음파)7,8,9에의존한다. 그러나 이러한 모니터링 방법에는 많은 단점이 있습니다. 환자에 있는 면역 거부의 표시 그리고 현상은 일반적으로 조기 발견 및 조기 내정간섭에 도움이 되지 않는10의늦게 나타납니다; 생검은 환자가 받아들이기 쉽지 않은침습성 11의단점을 갖는다; 면역생화학적 분석은 민감성 또는 특이성이 부족하며 초음파는 보조적이고 비용이 많이 듭니다. 따라서 면역 거부를 모니터링하는 효과적이고 편리한 방법을 찾는 것이 시급하다.
순환 DNA는 혈액에서 찾아낸 DNA의 세포외 모형입니다. 만델과 메타이스12는 1948년에 말초 혈액에 있는 순환 DNA의 존재를 처음으로 보고했습니다. 정상적인 생리학적 조건하에서 건강한 사람들의 혈액에서 DNA를 순환하는 것은 기준선에서 상대적으로 낮습니다. 그러나, 종양, 심근 경색, 자가면역 질환 및 이식 거부와 같은 일부 병리학에서 혈액 내순환 DNA의 수준은 세포사멸 및 괴사증에 의한 순환 DNA의 대규모 방출로 인해13,14로 크게 증가할 수 있다. 순환 DNA의 기원은 자멸및괴사(15)와연관되며, 이는 이종이이식거부(16)의특징이다.
순환 DNA는 암 검출을 위한 최소침습바이오마커로 입증되었다17,18,19. 기증자 유래 순환 DNA의 높은 스루-풋 시퀀싱은 장기 이식 후 거부의 검출에 신뢰할 수있다(20,21). 그러나, 이 방법은 추출된 DNA의 고농도 및 질이 필요합니다. 높은 비용과 시간 소비 이외에 DNA 요구 사항은 이 방법을 일상적인 임상 사용을 위해 부적격하게 만듭니다. 기증자 유래 순환 DNA는 정량적 실시간 PCR(qPCR)에 의해 정확하게 정량화될 수 있으며, 이는 특이적이고 민감합니다. 따라서 qPCR에 의한 순환 하는 돼지 순환 DNA를 정량화하는 것은 xenotransplantation의 면역 거부를 모니터링하는 실현 가능한 방법입니다. 이것은 덜 침습적이고, 매우 민감하고, 구체적이고, 저렴한 비용 및 시간 절약입니다. 돼지와 인간은 유전적으로 아주 다른 게놈 서열(도1)으로분리된다. 따라서, 순환 하는 돼지 DNA 는 xeno 거부 때문에 수신자의 혈액 후 xeno이식으로 풀어 놓일 수 있다. CpsDNA는 수신자의 혈액에 있는 종 특정 프라이머로 qPCR에 의해 정확하게 정량화될 수 있었습니다. 이전에는, 우리는 xeno 이식에 대한 바이오 마커로서 cpsDNA의 근거및 타당성을 입증했다22,23. 여기에서 는 더 많은 실험적 팁과 세부 사항을 공개합니다. 실험은 다음 단계로 구성됩니다. 첫째, 돼지 특이적 프라이머가 설계되었고, 일반 PCR에 의해 프라이머의 특이성을 검증하는 데 사용되었던 게놈 DNA가 분리되었다. 둘째, cpsDNA의 표준 곡선을 구성하고 샘플 혈액으로부터 cpsDNA를 격리합니다. 마지막으로, 순환돼지 특이적 DNA는 qPCR을 사용하여 정량화되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
발신 순환 DNA를 정량화하는 것은 xenotransplantation의 면역 거부를 감시하는 실행 가능한 접근법을 나타냅니다. Gadi외. 24 급성 거부 환자의 혈액에서 기증자 유래 순환 DNA (ddcfDNA) 함량은 거부없이 환자의 함량이 상당히 높다는 것을 발견했다. 이 연구 결과는 ddcfDNA가 기관 이식 손상을 감시하기 위한 일반적인 biomarker일 지도 모르다는 것을 건의합니다. 최근에는 간단한 작동, 높은 수…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국 국립핵심R&D 프로그램(2017YFC103704), 심천과학기술재단(JCYJ20170817171116272), 광동성 고원병원 건립 특별기금(JCYJ2017171116272) 보조금으로 지원되었다. 2019), 심천의학의 산명 프로젝트(SZSM201412020), 심천 의 고수준 의료분야 건설 기금(2016031638), 심천보건가족기획위원회(SZXJ2017021) , SZXJ2018059).
Materials
| Agarose | Biowest, Barcelona, Spain | 111860 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | R3136S | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | MCT-150-C | |
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | PCR-02-C | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province, China | 8~10 weeks | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA | Micro 21R | |
| 2-Log DNA Ladder | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | N3200S | 0.1–10.0 kb |
| Marker I | Tiangen, Beijing, China | MD101-02 | 0.1–0.6 kb |
| DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | DNACOL-01 | |
| DNA loading buffer | Solarbio, Beijing, China | D1010 | |
| E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | Takara Bio, Shiga, Japan | 1040S | |
| Female Bama mini pigs | BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China | 2~4 months | |
| Genomic DNA Extraction Kit Ⅰ | Tiangen, Beijing, China | DP304-02 | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Toyobo, Osaka, Japan | QPK-201 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad, Hercules, USA | ||
| Male cynomolgus monkeys | Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China | 8 years | |
| Nucleic acid dye(Gelred) | Biotium, Fremont, USA | 42003 | |
| polymerase(Premix Taq) | Takara Bio, Shiga, Japan | RR901A | |
| pMD19-T plasmid | Takara Bio, Shiga, Japan | D102A | |
| qPCR machine | Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA | ||
| Serum/Circulating DNA Extraction Kit | Tiangen, Beijing, China | DP339 | |
| TAE | sangon Biotech, Shanghai, China | B548101 |
Riferimenti
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