Presentato qui è un protocollo per microiniettare e contemporaneamente immaginire più embrioni di Drosophila durante lo sviluppo embrionale utilizzando un imager a base di piastre e ad alto contenuto.
I moderni approcci nell’imaging quantitativo di cellule vive sono diventati uno strumento essenziale per esplorare la biologia cellulare, consentendo l’uso di statistiche e modelli computazionali per classificare e confrontare i processi biologici. Sebbene i sistemi modello di coltura cellulare siano ottimi per l’imaging ad alto contenuto, studi ad alta produttività della morfologia cellulare suggeriscono che le colture ex vivo sono limitate nel riassumere la complessità morfologica che si trova nelle cellule all’interno di organismi viventi. Come tale, è necessario un sistema scalabile di modelli ad alta produttività per immagini le cellule viventi all’interno di un organismo intatto. Descritto qui è un protocollo per l’utilizzo di un analizzatore di immagini ad alto contenuto per acquisire contemporaneamente più video time-lapse di sviluppo embrionale drosophila melanogaster durante lo stadio blastoderma sinciteale. Il blastoderma sincreziale è tradizionalmente servito come un grande modello in vivo per l’imaging di eventi biologici; tuttavia, ottenere un numero significativo di repliche sperimentali per approcci quantitativi e ad alta produttività è stato laborioso e limitato dall’imaging di un singolo embrione per ripetizione sperimentale. Presentato qui è un metodo per adattare gli approcci di imaging e microiniezione per adattarsi a un sistema di imaging ad alto contenuto o a qualsiasi microscopio invertito in grado di acquisizione multipunto automatizzata. Questo approccio consente l’acquisizione simultanea di 6-12 embrioni, a seconda dei fattori di acquisizione desiderati, all’interno di una singola sessione di imaging.
Negli ultimi 30 anni, i progressi nelle tecnologie di imaging e nelle sonde molecolari per l’imaging di cellule vive hanno fatto progredire la nostra comprensione della complessità e del funzionamento interno della cellula. Ad accompagnare questo progresso tecnologico c’è una maggiore dipendenza dall’uso di modelli di coltura cellulare ex vivo per l’acquisizione di dati di imaging ad alta produttività. I modelli di coltura cellulare offrono diversi vantaggi, tra cui il controllo del microambiente attraverso sistemi microfluidici e la capacità di immagini simultanee di più cellule, consentendo l’uso di approcci quantitativi necessari per lo screening adalta produttività 1,2. Tuttavia, ci sono anche svantaggi significativi associati ai modelli di coltura cellulare nel contesto di studi morfologici, come superfici bidimensionali in vetro o plastica che producono effetti confondenti sulla morfologia cellulare e la suaregolazione 3,4,5. Questi effetti possono fornire dati falsi o fuorvianti per quanto riguarda lo studio dei processi biologici che regolano la morfologia cellulare.
Sebbene l’alternativa sia stata studiare la morfologia cellulare nel contesto di un organismo intatto6, pochi organismi intatti adatti facilitano l’imaging quantitativo di cellule vive ad alta produttività a causa delle difficoltà nel mantenere in vita interi organismi attraverso l’imaging e delle sfide associate all’imaging all’interno di un grande organismo multicellulare. Di conseguenza, gli studi biologici cellulari su organismi intatti si sono generalmente concentrati sull’osservazione di un singolo organismo nel tempo, il che limita notevolmente la dimensione del campione. Inoltre, questa limitazione di un animale alla volta rende l’imaging dal vivo difficile e costoso da impiegare sotto forma di schermo e limita la capacità di applicare strumenti analitici quantitativi poiché il numero di campioni è generalmente troppo piccolo. Pertanto, sorge la necessità di un organismo modello multicellulare che può essere utilizzato per approcci quantitativi basati su alto contenuto.
Questo protocollo adatta l’embrione Drosophila per l’imaging ad alto contenuto a base di lastre per generare campioni sperimentali abbastanza grandi da essere analisi quantitative. Drosophila melanogaster è comunemente noto come il primo organismo modello. La ricerca sulla Drosophila ha portato a progressi nella biologia cellulare e molecolare, tra cui la trasmissione di informazioni genetiche, l’identificazione delle vie di segnalazione cellulare e i requisiti genetici dello sviluppo embrionale7,8,9. Inoltre, l’embrione di Drosophila è stato utilizzato per esplorare la dinamica dei microtubuli in vivo durante la divisionecellulare 10,11,12. L’uso della microiniezione per fornire piccole molecole e sonde molecolari fornisce un controllo temporale che rende lo sviluppo embrionale di Drosophila particolarmente potente per sondare i processi cellulari in vivo13,14. Tuttavia, generare un numero significativo di ripetizioni sperimentali con un approccio di imaging tradizionale è estremamente laborioso e ha un uso limitato negli schermi di imaging ad alta produttività e nell’analisi quantitativa. Il nostro approccio si avvale di un analizzatore ad alto contenuto tipicamente riservato all’analisi a singola cella e adatta l’analisi di imaging in vivo nel sincrezio della prima Drosophila embryo.
Questo protocollo è stato utilizzato per raccogliere, stadio e microiniettare embrioni di Drosophila per esplorare i meccanismi che guidano i cambiamenti morfologici nel Reticolo Endoplasmatico (ER) durante la mitosi15. Sebbene molti studi abbiano delineato la natura dinamica del TI durante il ciclocellulare 16,17,18,19, è stato difficile confrontare gli effetti delle perturbazioni multiple nel tempo sulla morfologia ER. Per identificare i componenti che guidano i cambiamenti nella morfologia ER attraverso la divisione cellulare, i metodi elencati in questo protocollo sono stati utilizzati per sondare il ruolo dei microtubuli e di altri fattori citoscheletrici sulla riorganizzazione mitotica dell’ER usando la divisione sincrite corticale nel primo embrione di Drosophila. Nel complesso, la disponibilità di perturbazioni genetiche all’interno della comunità Drosophila, la capacità di microiniettare farmaci e sonde molecolari in momenti precisi durante lo sviluppo e il costo economico di lavorare con Drosophila rendono questo approccio altamente suscettibile allo screening basato su immagini ad alta produttività. I metodi qui descritti sono applicabili per lo studio di un’ampia varietà di processi cellulari e di sviluppo in vivo utilizzando l’embrione Drosophila 20. In particolare, questo protocollo è ben adattato per studiare gli eventi biologici che si verificano per un lungo periodo e entro 100 micron dalla corteccia embrionale drosophila.
Il protocollo qui descritto è altamente versatile e facilmente adattabile per lo studio di eventi biologici in una varietà di fasi dello sviluppo embrionale di Drosophila. Questo protocollo è adatto per lo studio di processi biologici che si verificano per lunghi periodi di tempo. Ad esempio, gli studi sulla cellularizzazione29,30 o sulla formazione di domini di eterocromatina in Drosophila31,32 potrebbero trarre vantaggio dall’utilizzo dei metodi descritti in questo protocollo poiché questi processi si verificano per un lungo periodo di tempo. Inoltre, la dimensione del campione può essere aumentata diminuendo l’ingrandimento per studiare domande che richiedono meno risoluzione ottica, come la tempistica tra le divisioni sinciziali33 o la durata della gastrulazione34. Allo stesso modo, un obiettivo 20x consente di immaginare due embrioni all’interno di un piano di imaging. I metodi di questo protocollo forniscono una piattaforma dinamica per porre domande biologiche utilizzando lo sviluppo embrionale come sistema modello per l’analisi quantitativa.
Ci sono 3 passaggi critici in questo protocollo. Dopo la dechorionation nella candeggina al 50% è imperativo che gli embrioni siano risciacquati e asciugati vigorosamente 5 volte (2.3.4). Questo passaggio rimuove tutti i piccoli pezzi rimanenti di chorion. Il chorion avanzi ostacolerà il campo visivo quando si imaging l’embrione. Quando si montano gli embrioni sul coperchio del vetro (3.5), è importante premere gli embrioni sulla colla con pressione uniforme. Questo posizionerà gli embrioni sullo stesso piano z. Quando si apre l’ago di microiniezione, è importante ritrarre immediatamente lo stantuffo per regolare la portata dell’ago o si perderà tutto l’iniettore.
Il nostro studio è stato limitato da due fattori. Il primo fattore non era avere un processo di segmentazione automatizzato. Tuttavia, abbiamo progettato uno script di segmentazione manuale utilizzando MATLAB; con un marcatore del mandrino geneticamente codificato questo processo potrebbe essere automatizzato. In futuro vorremmo produrre CNN-RFP21, Rtln1-GFP e CNN-RFP; Linee transgeniche ReepB-GFP per consentire la segmentazione automatica del mandrino. Per ulteriori informazioni sulla nostra pipeline di script e analisi MATLAB, fare riferimento ai materiali supplementari di Diaz etal. In secondo luogo, siamo stati limitati anche dal nostro intervallo di acquisizione di 35 s, che ci ha permesso di immagine di 6 embrioni solo contemporaneamente. Un intervallo di acquisizione più lungo ci permetterebbe di immagine di più embrioni contemporaneamente. Sebbene la produttività della somministrazione di farmaci possa essere incrementata sostituendo la microiniezione con una fase di permeazione, abbiamo riscontrato che ciò non era necessario poiché la nostra dimensione del campione era già limitata dall’intervallo di acquisizione.
Mentre questo protocollo è stato utilizzato per immaginare lo sviluppo embrionale di Drosophila, l’approccio generale è adattabile per studiare lo sviluppo embrionale in altri sistemi modello multicellulari, come C. elegans,Sea Urchins e Xenopus. Gli embrioni sono estremamente utili per l’analisi quantitativa poiché sono facilmente sincronizzati tramite raccolta o fecondazione. Inoltre, gli embrioni non si allontanano o nuotano lontano da un campo visivo, consentendo l’uso di un semplice software in grado di acquisizione multipunto per produrre più video time lapse per l’analisi quantitativa. Sebbene abbiamo utilizzato un analizzatore ad alto contenuto nel nostro studio, qualsiasi sistema di microscopio invertito in grado di acquisizione multipunto può essere abbinato ai metodi di cui al presente documento.
Risultati simili possono essere ottenuti utilizzando un microscopio confocale invertito in grado di acquisizione multipunto; tuttavia, i vantaggi di un analizzatore ad alto contenuto emergono man mano che si aumentano le dimensioni del campione per studiare domande che richiedono meno risoluzione nel tempo. Un ovvio vantaggio nell’utilizzo di un analizzatore ad alto contenuto è la possibilità di immagini di 4 diapositive separate contemporaneamente rispetto a 1 diapositiva su sistemi tradizionali. Con un set completo di 4 diapositive e 40 embrioni su ogni diapositiva, 160 embrioni possono essere imageati in diverse ore, purché l’intervallo di acquisizione sia di almeno 15 minuti tra i fotogrammi. Un altro importante vantaggio dell’utilizzo di un analizzatore ad alto contenuto è che i campioni sono completamente sigillati da qualsiasi fonte di luce esterna, necessaria per misurazioni basate sull’intensità della fluorescenza. Infine, l’analizzatore ad alto contenuto utilizzato nel nostro studio ha una fotocamera CMOS da 5,5 megapixel che fornisce un generoso campo visivo di 221,87 μm con ingrandimento 60x. Questo campo visivo più ampio ci ha permesso di immagine di mezzo embrione per punto di acquisizione.
The authors have nothing to disclose.
UD, WFM e BR sono supportati dal Center for Cellular Construction, un Centro scientifico e tecnologico della National Science Foundation (NSF), in base alla licenza di sovvenzione DBI-1548297. BR è anche supportato attraverso un premio NSF CAREER, 1553695.
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