Конструирование мутантов серотипа 1 Streptococcus pneumoniae штамма 519/43
Summary
Здесь мы описываем штамм S. pneumoniae серотипа 1 519/43, который может быть генетически модифицирован, используя его способность естественным образом приобретать ДНК и плазмиду самоубийства. В качестве доказательства принципа был получен изогенный мутант в гене пневмолизина (ply).
Abstract
Streptococcus pneumoniae серотипа 1 остается огромной проблемой в странах с низким и средним уровнем дохода, особенно в странах Африки к югу от Сахары. Несмотря на его важность, исследования этого серотипа были затруднены из-за отсутствия генетических инструментов для его модификации. В этом исследовании мы описываем метод генетической модификации клинического изолята серотипа 1 (штамм 519/43). Интересно, что это было достигнуто за счет использования способности пневмококка естественным образом приобретать ДНК. Однако, в отличие от большинства пневмококков, использование линейной ДНК не было успешным; Чтобы мутировать этот важный штамм, пришлось использовать плазмиду самоубийства. Эта методология предоставила средства для более глубокого понимания этого неуловимого серотипа, как с точки зрения его биологии, так и патогенности. Чтобы проверить метод, основной известный пневмококковый токсин, пневмолизин, был мутирован, потому что он имеет хорошо известный и простой для понимания фенотип. Мы показали, что мутант, как и ожидалось, утратил способность лизировать эритроциты. Имея возможность мутировать важный ген в интересующем серотипе, мы смогли наблюдать различные фенотипы мутантов потери функции при внутрибрюшинных и интраназальных инфекциях от тех, которые наблюдались для других серотипов. Таким образом, это исследование доказывает, что штамм 519/43 (серотип 1) может быть генетически модифицирован.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, пневмококк) является одной из основных причин заболеваемости и смертности во всем мире. До недавнего времени было обнаружено около 100 серотипов S. pneumoniae 1,2,3,4,5,6,7. Ежегодно инвазивная пневмококковая инфекция (ИПД) уносит около 700 000 смертей детей в возрасте до 5 лет8. S. pneumoniae является основной причиной бактериальной пневмонии, среднего отита, менингита и сепсиса во всем мире9.
В африканском менингитном поясе серотип 1 ответственен за вспышки менингита, где доминирует тип последовательности (ST) ST217, чрезвычайно вирулентный тип последовательности 10,11,12,13,14,15. Его значение в патологии менингита было сравнимо с значением Neisseria meningitidis в африканском менингитном поясе16. Серотип 1 часто является основной причиной ИПД; Однако он очень редко встречается в карете. Фактически, в Гамбии на этот серотип приходится 20% всех инвазивных заболеваний, но он был обнаружен только у 0,5% здоровых носителей14,17,18,19. Генетический обмен и рекомбинация у компетентных пневмококков происходит, как правило, при носительстве, а не при инвазивном заболевании20. Кроме того, было показано, что серотип 1 имеет одну из самых коротких частот носительства, описанных среди пневмококков (всего 9 дней). Поэтому было высказано предположение, что этот серотип может иметь гораздо более низкую скорость рекомбинации, чем другие21.
Необходимы углубленные исследования, чтобы понять причину низкой скорости носительства штаммов серотипа 1 и ее значение для инвазивных заболеваний в странах Африки к югу от Сахары.
Здесь мы сообщаем о протоколе, который позволяет проводить полногеномный мутагенез конкретного штамма серотипа 1, 519/43. Этот штамм может легко приобретать и рекомбинировать новую ДНК в свой геном. Этот метод еще не является межштаммовым, но он очень эффективен, когда выполняется в фоновом режиме 519/43 (другие мишени были мутированы, рукописи готовятся). Просто используя штамм 519/43 и используя его естественную компетенцию, а также заменяя способ обеспечения экзогенной ДНК, мы смогли мутировать ген пневмолизина (слой) в этом штамме серотипа 1. Этот метод представляет собой усовершенствование по сравнению с методом, представленным Harvey et al.22 , поскольку он выполняется в один этап без необходимости прохождения ДНК через другой серотип. Тем не менее, из-за межштаммовой изменчивости ни один метод не был стандартизирован для всех штаммов. Способность мутировать определенные гены и наблюдать за их эффектами позволит глубже понять штаммы S. pneumoniae серотипа 1 и даст ответы на вопросы о роли этих штаммов в менингите в странах Африки к югу от Сахары.
Protocol
Representative Results
Discussion
Streptococcus pneumoniae, в частности серотип 1, по-прежнему представляет собой глобальную угрозу, вызывающую инвазивную пневмококковую инфекцию и менингит. Несмотря на внедрение различных вакцин, которые должны защищать от серотипа 1, в Африке этот серотип все еще способен вызывать вспышки, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Фонд менингита и MRC за предоставление финансирования для этой работы.
Materials
| AccuPrime Pfx DNA polymerase | Invitrogen | 12344024 | Used for amplification of the fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Used for bacterial selection on stage 1(pSD1) |
| Blood Agar Base | Oxoid | CM0055 | Used to plate S. pneumoniae transformants |
| Bovine Serum Albumine | sigma | 55470 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Brain Heart Infusion | Oxoid | CM1135 | used to grow S. pneumoniae cells |
| Calcium Chloride Cacl2 | Sigma | 449709 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Competence stimulating peptide 1 | AnaSpec | AS-63779 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Luria Broth Agar | Gibco | 22700025 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Luria Broth Base (Miller's formulation) | Gibco | 12795027 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Monarch Gel Extraction Kit | NEB | T1020S | Used to extract the bands from the DNA gel |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Used to extract plasmid from the cells |
| pGEM T-easy | Promega | A1360 | used as suicide plasmid |
| S.O.C. | Invitrogen | 15544034 | used for recovery of cells after transformation |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S0899 | used for S.pneumoniae Transformation |
| Spectinomycin Hydrochloride | SigmaAldrich | PHR1426 | Used for bacterial selection |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265017 | used for the creation of pSD1 and pSD2 |
References
- Bentley, S. D., et al. Genetic Analysis of the Capsular Biosynthetic Locus from All 90 Pneumococcal Serotypes. PLoS Genetics. 2 (3), 31 (2006).
- Calix, J. J., Nahm, M. H. A new pneumococcal serotype, 11E, has a variably inactivated wcjE gene. The Journal of Infectious Diseases. 202 (1), 29-38 (2010).
- Park, I. H., Pritchard, D. G., Cartee, R., Brandao, A., Brandileone, M. C. C., Nahm, M. H. Discovery of a New Capsular Serotype (6C) within Serogroup 6 of Streptococcus pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 45 (4), 1225-1233 (2007).
- Jin, P., et al. First Report of Putative Streptococcus pneumoniae Serotype 6D among Nasopharyngeal Isolates from Fijian Children. The Journal of Infectious Diseases. 200 (9), 1375-1380 (2009).
- Oliver, M. B., vander Linden, M. P. G., Küntzel, S. A., Saad, J. S., Nahm, M. H. Discovery of Streptococcus pneumoniae Serotype 6 Variants with Glycosyltransferases Synthesizing Two Differing Repeating Units. Journal of Biological Chemistry. 288 (36), 25976-25985 (2013).
- Calix, J. J., et al. Serological Characterization of Two Capsule Subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 Strains. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27885-27894 (2012).
- Park, I. H., et al. and Serological Characterization of a New Pneumococcal Serotype, 6H, and Generation of a Pneumococcal Strain Producing Three Different Capsular Repeat Units. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (3), 313-318 (2015).
- O’Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. The Lancet. 374 (9693), 893-902 (2009).
- Henriques-Normark, B., Tuomanen, E. I. The Pneumococcus: Epidemiology, Microbiology, and Pathogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (7), 010215 (2013).
- Leimkugel, J., et al. An Outbreak of Serotype 1 Streptococcus pneumoniae Meningitis in Northern Ghana with Features That Are Characteristic of Neisseria meningitidis Meningitis Epidemics. The Journal of Infectious Diseases. 192 (2), 192-199 (2005).
- Yaro, S., et al. Epidemiological and Molecular Characteristics of a Highly Lethal Pneumococcal Meningitis Epidemic in Burkina Faso. Clinical Infectious Diseases. 43 (6), 693-700 (2006).
- Antonio, M., et al. Molecular epidemiology of pneumococci obtained from Gambian children aged 2-29 months with invasive pneumococcal disease during a trial of a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine. BMC Infectious Diseases. 8 (1), 81 (2008).
- Kwambana-Adams, B. A., et al. An outbreak of pneumococcal meningitis among older children (≥5 years) and adults after the implementation of an infant vaccination programme with the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in Ghana. BMC Infectious Diseases. 16 (1), 575 (2016).
- Antonio, M., et al. Seasonality and outbreak of a predominant Streptococcus pneumoniae serotype 1 clone from The Gambia: Expansion of ST217 hypervirulent clonal complex in West Africa. BMC Microbiology. 8 (1), 198 (2008).
- Staples, M., et al. Molecular characterization of an Australian serotype 1 Streptococcus pneumoniae outbreak. Epidemiology and Infection. 143 (2), 325-333 (2015).
- Gessner, B. D., Mueller, J. E., Yaro, S. African meningitis belt pneumococcal disease epidemiology indicates a need for an effective serotype 1 containing vaccine, including for older children and adults. BMC Infectious Diseases. 10 (1), 22 (2010).
- Hill, P. C., et al. Nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae in Gambian infants: a longitudinal study. Clinical Infectious Diseases. 46 (6), 807-814 (2008).
- Ebruke, C., et al. Temporal changes in nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae serotype 1 genotypes in healthy Gambians before and after the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine. PeerJ. 3, 90 (2015).
- Adegbola, R. A., et al. Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003. Tropical Medicine and International Health. 11 (7), 1128-1135 (2006).
- Marks, L. R., Reddinger, R. M., Hakansson, A. P. High Levels of Genetic Recombination during Nasopharyngeal Carriage and Biofilm Formation in Streptococcus pneumoniae. mBio. 3 (5), (2012).
- Ritchie, N. D., Mitchell, T. J., Evans, T. J. What is different about serotype 1 pneumococci. Future Microbiology. 7 (1), 33-46 (2012).
- Harvey, R. M., et al. The variable region of pneumococcal pathogenicity island 1 is responsible for unusually high virulence of a serotype 1 isolate. Infection and Immunity. 84 (3), 822-832 (2016).
- Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
- Alioing, G., Granadel, C., Morrison, D. A., Claverys, J. P. Competence pheromone, oligopeptide permease, and induction of competence in Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 21 (3), 471-478 (1996).
- Lund, E. . Enumeration and description of the strains belonging to the State Serum Institute, Copenhagen Denmark. , (1951).
- Barany, F., Tomasz, A. Genetic transformation of Streptococcus pneumoniae by heterologous plasmid deoxyribonucleic acid. Journal of Bacteriology. 144 (2), 698-709 (1980).
- Terra, V. S., Homer, K. A., Rao, S. G., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Characterization of novel β-galactosidase activity that contributes to glycoprotein degradation and virulence in Streptococcus pneumoniae. Infection and Immunity. 78 (1), (2010).
- Terra, V. S., Zhi, X., Kahya, H. F., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Pneumococcal 6-phospho-β-glucosidase (BglA3) is involved in virulence and nutrient metabolism. Infection and Immunity. 84 (1), (2015).
- Harvey, R. M., Ogunniyi, A. D., Chen, A. Y., Paton, J. C. Pneumolysin with Low Hemolytic Activity Confers an Early Growth Advantage to Streptococcus pneumoniae in the Blood. Infection and Immunity. 79 (10), 4122 (2011).
- Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, E. C., Brown, J. S., Wren, B. W. Construction of a pneumolysin deficient mutant in Streptococcus pneumoniae serotype 1 strain 519/43 and phenotypic characterisation. Microbial Pathogenesis. 141, 103999 (2020).
