FLIM-FRET Metingen van eiwit-eiwit interacties in levende bacteriën.
Summary
We beschrijven hier een protocol om eiwit-eiwit interacties te karakteriseren tussen twee zeer verschillend uitgedrukte eiwitten in levende Pseudomonas aeruginosa met behulp van FLIM-FRET metingen. Het protocol omvat bacteriën stam constructies, bacteriën immobilisatie, beeldvorming en post-imaging data-analyse routines.
Abstract
Eiwit-eiwit interacties (PPR’s) controleren verschillende belangrijke processen in cellen. Fluorescentie levensduur beeldvorming microscopie (FLIM) in combinatie met Förster resonantie energieoverdracht (FRET) bieden nauwkeurige informatie over PPR’s in levende cellen. FLIM-FRET vertrouwt op het meten van het fluorescentielevensverval van een FRET-donor op elke pixel van het FLIM-beeld, met kwantitatieve en nauwkeurige informatie over PPR’s en hun ruimtelijke cellulaire organisaties. We stellen hier een gedetailleerd protocol voor voor FLIM-FRET-metingen dat we hebben toegepast om PPR’s in levende Pseudomonas aeruginosa te monitoren in het specifieke geval van twee interagerende eiwitten uitgedrukt met zeer verschillende kopienummers om de kwaliteit en robuustheid van de techniek aan te tonen bij het onthullen van kritische kenmerken van PPR’s. Dit protocol beschrijft in detail alle noodzakelijke stappen voor PPI-karakterisering – van bacteriële mutantconstructies tot de eindanalyse met behulp van recent ontwikkelde tools die geavanceerde visualisatiemogelijkheden bieden voor een eenvoudige interpretatie van complexe FLIM-FRET-gegevens.
Introduction
Eiwit-eiwit interacties (PPR’s) controleren verschillende belangrijke processen in cellen1. De rollen van PPR’s verschillen op basis van eiwitsamenstelling, affiniteiten functies en locaties in cellen2. PPR’s kunnen worden onderzocht via verschillende technieken3. Co-immunoprecipitatie is bijvoorbeeld een relatief eenvoudige, robuuste en goedkope techniek die vaak wordt gebruikt om PPR’s te identificeren of te bevestigen. Het bestuderen van PPR’s kan echter een uitdaging zijn wanneer de interactieve eiwitten lage expressieniveaus hebben of wanneer de interacties van voorbijgaande aard zijn of alleen relevant zijn in specifieke omgevingen. Het bestuderen van PPR’s tussen de verschillende enzymen van het pyoverdinepad in P. aeruginosa vereist dat de onderdrukking van de algemene ijzer-co-factored repressor Fur wordt verlicht om de expressie van alle eiwitten van het pyoverdinepad in cel4,5,6te laten uitdrukken . Deze gemeenschappelijke regulatie voor alle eiwitten van het traject resulteert in tijdige expressies in de cel naar verwachting hun interacties te bevorderen. De diversiteit in termen van grootte, aard, expressieniveaus en het aantal eiwitten van deze metabole route maken het moeilijk om te bestuderen in gereconstitueerde systemen6. Het verkennen van PPR’s in hun cellulaire omgeving is daarom van cruciaal belang om de biologische functies van eiwitten in hun eigen context verder te begrijpen.
Slechts enkele methoden, waaronder fluorescentie, maken het verkennen van PPR’s in levende cellen7mogelijk. Onder de verschillende fluorescentie parameters die kunnen worden gemeten, de fluorescentie levensduur (dat wil zeggen, de gemiddelde tijd een fluoroforie blijft in zijn opgewonden toestand voor het uitzenden van een foton) is waarschijnlijk een van de meest interessante parameters te verkennen in levende cellen. De fluorescentieleven van een fluorofoër is zeer gevoelig voor zijn omgeving en FLIM kan daarom chemische of fysische informatie verstrekken over de fluorofoëromgeving8. Dit omvat de aanwezigheid van Förster resonantie energieoverdracht (FRET) die kan optreden in aanwezigheid van een “acceptor” van fluorescentie op korte afstand van een fluorescentie “donor”. Energieoverdracht resulteert in een aanzienlijke verkorting van de donorfluorescentieleven(figuur 1A),waardoor Fluorescentie Lifetime Imaging Microscopie (FLIM) een krachtige benadering is om eiwit-eiwitinteracties rechtstreeks in levende cellen te verkennen. FLIM kan bovendien ruimtelijke informatie verstrekken over waar de interacties plaatsvinden in de cellen7,8. Deze aanpak is zeer krachtig voor het onderzoeken van PPR’s in situaties waarin het labelen met fluoroforen van de twee interactiepartners mogelijk is.
Om fret te laten optreden – kritieke omstandigheden op de afstand tussen twee fluoroforen zijn vereist8,9. De twee fluoroforen mogen niet meer dan 10 nm van elkaar verwijderd zijn. Daarom moet worden gewaarschuwd bij het ontwerpen van FLIM-FRET-experimenten om ervoor te zorgen dat de donor en de acceptor van fluorescentie een kans hebben om zich dicht bij elkaar te bevinden in het interagerende complex. Hoewel dit lijkt misschien beperkend, het is in feite een echt voordeel als de afstand-afhankelijkheid van FRET zorgt ervoor dat twee geëtiketteerde eiwitten ondergaan FRET moeten fysiek interageren (Figuur 1A). De moeilijkheden bij het verkrijgen van duidelijke antwoorden over PPI in colocalisatie-experimenten (twee gekoloniseerde eiwitten kunnen niet noodzakelijkerwijs op elkaar inwerken) zijn daarom geen probleem met FLIM-FRET.
Figuur 1: FLIM-FRET-analyseprincipe. Elke pixel van de FLIM-FRET multidimensionale afbeelding bevat informatie over het fluorescentieverval dat op deze specifieke locatie is geregistreerd (#counts = aantal gedetecteerde fotonen in het kanaal t). (A) De klassieke weergave van de FLIM afbeelding is meestal een false-color levensduur gecodeerde 2D-afbeelding (links). Een afname van de gemiddelde fluorescentieleven van de donor – zoals blijkt uit een verandering in de kleurschaal – kan worden waargenomen in aanwezigheid van FRET en is informatief over de aanwezigheid van PPR’s in dit ruimtelijk gebied. (B) Overlap tussen het donoremissiespectrum en het acceptorabsorptiespectrum is noodzakelijk om FRET te kunnen voorkomen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Een tweede vereiste voor FRET is dat het emissiespectrum van de donor en de absorptiespectra van de acceptor elkaar overlappen8 (figuur 1B). De fluorescentie excitatie van de donor moet op golflengten die zeer weinig bijdragen aan de directe fluorescentie excitatie van de acceptor. Niet alle combinaties van fluoroforen zijn mogelijk en we raden bovendien aan om bij voorkeur donoren met monoexponentiele fluorescentieverval te gebruiken om FLIM-FRET interpretaties te vergemakkelijken10. Verschillende paren van fluorescentie eiwitten voldoen aan deze eisen, waaronder de populaire eGFP-mCherry paar11 (voor een overzicht van het palet van beschikbare fluorescerende eiwit FRET paren zie12,13).
FLIM-FRET maakt het meten van de fluorescentie levensduur verval van een FRET donor op elke pixel van een FLIM beeld(Figuur 1A). Er zijn twee belangrijke technieken om fluorescentieleven te bepalen die verschillen in acquisitie en analyse: frequency-domain (FD)14 en time-domain (TD). TD FLIM is meer verspreid en wordt uitgevoerd met behulp van een gepulseerde verlichting in combinatie met verschillende mogelijke detectie configuraties, waaronder gating methoden15, streak camera16 of time-gecorreleerd single photon tellen (TCSPC) technieken8. Voor zowel FD- als TD-technieken wordt de fluorescentieleven niet direct gemeten, maar vereist een analyse van de gemeten gegevens om de levensduur(en) of de aanwezigheid van interacties te schatten. Voor TCSPC-technieken is de meest gebruikte analyse gebaseerd op het aanbrengen van het verval met enkele of meerdere exponentiële functies met behulp van de minst vierkante iteratieve re-convolutions die de gewogen som van de resten minimaliseren.
Ten slotte kan FLIM-FRET zowel met behulp van enkele foton of multiphoton excitaties worden uitgevoerd. De nieuwste hebben verschillende voordelen, zoals het verminderen van autofluorescentie en fotodamage uit het brandpuntsvlak. Multiphoton excitaties maken ook een langere excitatie diepte mogelijk als het werken in dikke 3D-monsters8. Integendeel, enkele foton excitatie is meestal efficiënter als de twee-foton absorptie dwarsdoorsnedes van fluorescerende eiwitten zijn beperkt17.
Hier stellen we een protocol voor voor FLIM-FRET-metingen van PPR’s in levende P. aeruginosa in het specifieke geval van twee interagerende eiwitten (PvdA en PvdL) uitgedrukt met zeer verschillende aantallen kopieën om de kwaliteit en robuustheid van de techniek aan te tonen bij het onthullen van kritische kenmerken van PPR’s. PvdA en PvdL zijn betrokken bij de biosynthese van Pyoverdine. PvdA is een L-ornithine N5-oxygenase en synthetiseert de L-N5-formyl-N5-hydroxyornithine van L-ornithine door hydroxylation (PvdA) en vervorming (PvdF)18. PvdL is een niet-ribosomale peptide synthese (NRPS) enzym bestaande uit vier modules. De eerste module katalyseert de acyleratie van myristisch zuur. De tweede module katalyseert de activering van L-Glu en de condensatie ervan aan de myristische coA. Vervolgens condenseert de derde module een L-Tyr aminozuur dat vervolgens wordt geïsomeriseerd in D-Tyr. Ten slotte bindt de vierde module een L-Dab (Diaminobutyric acid) aminozuur om het geacyleerde tripeptide L-Glu/D-Tyr/L-Dab6te vormen. PvdL is dus verantwoordelijk voor de synthese van de drie eerste aminozuren van de voorloper van pyoverdine. De interactie van PvdA met PvdL is verrassend omdat PvdL, in tegenstelling tot PvdI en PvdJ, geen module specifiek voor de L-N5-formyl-N5-hydroxyornithine draagt. Deze interactie suggereert dat alle enzymen die verantwoordelijk zijn voor de pyoverdine precursor biosynthese zijn gerangschikt in grote voorbijgaande en dynamische multi-enzymatische complexen19,20.
In dit rapport leggen we in detail uit hoe we de bacteriestammen kunnen construeren die de twee interactie met eGFP en mCherry-geëtiketteerde eiwitten uitdrukken. We beschrijven ook de voorbereiding van monsters en de omstandigheden voor efficiënte FLIM-FRET-celbeeldvorming. Tot slot stellen we een stapsgewijze zelfstudie voor voor beeldanalyse voor, inclusief een recent ontwikkelde tool die geavanceerde visualisatiemogelijkheden biedt voor eenvoudige interpretatie van complexe FLIM-FRET-gegevens. Met dit rapport willen we niet alleen avontuurlijk, maar de meeste biologen ervan overtuigen dat FRET-FLIM een toegankelijke en krachtige techniek is die in staat is om hun vragen over PPR’s rechtstreeks in de inheemse cellulaire omgeving aan te pakken.
Protocol
Representative Results
Discussion
FLIM-FRET biedt een aantal belangrijke voordelen ten opzichte van op intensiteit gebaseerde FRET-beeldvorming. Fluorescentie leven is een intrinsieke parameter van de fluorofoër. Als gevolg hiervan is het niet afhankelijk van lokale concentraties fluoroforen, noch van de intensiteit van de lichte excitatie. De fluorescentieleven wordt bovendien ook slecht beïnvloed door foto-bleken. Het is vooral interessant om ppr’s te bewijzen in cellen waar de concentraties van lokale eiwitten zeer heterogeen kunnen zijn in de subce…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen Dr Ludovic Richert voor zijn waardevolle hulp bij het verwerven van FLIM data en voor het technisch onderhoud en de ontwikkeling van de FLIM setup. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van Fondation pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/). VN wordt gefinancierd door de Fondation pour la Recherche Médicale (FRM‐SPF201809006906). YM is het Institut Universitaire de France (IUF) dankbaar voor de ondersteuning en het verstrekken van extra tijd om te worden besteed aan onderzoek. IJS en JG erkennen het Instituut voor De Levering van de Drug van Straatsburg voor zijn financiële steun.
Materials
| 525/50 nm band-pass filter | F37-516, AHF, Germany | ||
| 680 nm short pass filter | F75-680, AHF, Germany | ||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| DreamTaq DNA polymerase 5U/μL | ThermoFisher Scientific | EP0714 | |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | C404010 | |
| Fiber-coupled avalanche photo-diode | SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer | ||
| Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20×20mm | Knitel glass | MS0011 | |
| High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/μL | ThermoFisher Scientific | F530S | |
| Lysogeny broth (LB) | Millipore | 1.10285 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O) | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | |
| Microscope slides (25×75mm) | Knitel glass | MS0057 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| NucleoSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 740588.10 | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | RES20765 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium Succinate (Disodium) | Sigma-Aldrich | 14160 | |
| SPCImage, SPCM software | Becker & Hickl | ||
| Sterile inoculating loop | Nunc | 7648-1PAK | |
| T4 DNA ligase 1U/μL | ThermoFisher Scientific | 15224017 | |
| TCSPC module | SPC830, Becker & Hickl, Germany | ||
| Ti:Sapphire laser | Insight DeepSee, Spectra Physics | ||
| Tubes 50mL | Falcon | 352070 |
Riferimenti
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 325, 991-1018 (2003).
- Hayes, S., Malacrida, B., Kiely, M., Kiely, P. A. Studying protein-protein interactions: Progress, pitfalls and solutions. Biochemical Society Transactions. 44, 994-1004 (2016).
- Guillon, L., Altenburger, S., Graumann, P. L., Schalk, I. J. Deciphering protein dynamics of the siderophore pyoverdine pathway in Pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 8, 1-9 (2013).
- Ringel, M. T., Brüser, T. The biosynthesis of pyoverdines. Microbial Cell. 5, 424-437 (2018).
- Schalk, I. J., Rigouin, C., Godet, J. An overview of siderophore biosynthesis among fluorescent Pseudomonads and new insights into their complex cellular organization. Environmental Microbiology. 22, 1447-1466 (2020).
- Cui, Y., et al. Techniques for detecting protein-protein interactions in living cells: principles, limitations, and recent progress. Science China Life Sciences. , (2019).
- Day, R. N., Mazumder, N., Sun, Y., Christopher, K. G. FRET microscopy: Basics, issues and advantages of FLIM-FRET imaging. Springer Series in Chemical Physics. 111, 249-276 (2015).
- Bastiaens, P. I. H., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: Spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends in Cell Biology. 9, 48-52 (1999).
- Yasuda, R. Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 16, 551-561 (2006).
- Tramier, M., Zahid, M., Mevel, J. -. C., Masse, M. -. J., Coppey-Moisan, M. Sensitivity of CFP/YFP and GFP/mCherry Pairs to Donor Photobleaching on FRET Determination by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy in Living Cells. Microscopy Research and Technique. 71, 146-157 (2008).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A guide to fluorescent protein FRET pairs. Sensors (Switzerland). 16, 1-24 (2016).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32, 407-414 (2007).
- Leray, A., et al. Optimized protocol of a frequency domain fluorescence lifetime imaging microscope for fret measurements. Microscopy Research and Technique. 72, 371-379 (2009).
- Elson, D. S., et al. Real-time time-domain fluorescence lifetime imaging including single-shot acquisition with a segmented optical image intensifier. New Journal of Physics. 6, 1-13 (2004).
- Rajoria, S., Zhao, L., Intes, X., Barroso, M. FLIM-FRET for Cancer Applications. Current Molecular Imaging. 3, 144-161 (2014).
- Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8, 393-399 (2011).
- Visca, P., Ciervo, A., Orsi, N. Cloning and nucleotide sequence of the pvdA gene encoding the pyoverdin biosynthetic enzyme L-ornithine N5-oxygenase in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 176, 1128-1140 (1994).
- Imperi, F., Visca, P. Subcellular localization of the pyoverdine biogenesis machinery of Pseudomonas aeruginosa: A membrane-associated ‘siderosome’. FEBS Letters. 587, 3387-3391 (2013).
- Gasser, V., et al. In cellulo FRET-FLIM and single molecule tracking reveal the supra-molecular organization of the pyoverdine bio-synthetic enzymes in Pseudomonas aeruginosa. Quarterly Reviews of Biophysics. , 1-11 (2019).
- Rietsch, A., Mekalanos, J. J. Metabolic regulation of type III secretion gene expression in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 59, 807-820 (2006).
- Herrero, M., De Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172, 6557-6567 (1990).
- Godet, J., Mély, Y. Exploring protein-protein interactions with large differences in protein expression levels using FLIM-FRET. Methods and Applications in Fluorescence. 8, 014007 (2019).
- El Meshri, S. E., et al. Role of the nucleocapsid domain in HIV-1 gag oligomerization and trafficking to the plasma membrane: A fluorescence lifetime imaging microscopy investigation. Journal of Molecular Biology. 427, 1480-1494 (2015).
- Becker, W. The bh TCSPC Handbook. Scanning. , 1 (2010).
- Richert, L., Didier, P., de Rocquigny, H., Mély, Y. Monitoring HIV-1 protein oligomerization by FLIM FRET microscopy. Springer Series in Chemical Physics. , 111 (2015).
- Fereidouni, F., Blab, G. A., Gerritsen, H. C. Phasor based analysis of FRET images recorded using spectrally resolved lifetime imaging. Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).
- Fereidouni, F., Gorpas, D., Ma, D., Fatakdawala, H., Marcu, L. Rapid fluorescence lifetime estimation with modified phasor approach and Laguerre deconvolution: a comparative study. Methods and Applications in Fluorescence. 5, 035003 (2017).
- Margineanu, A., et al. Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Scientific Reports. 6, (2016).
- Guzmán, C., Oetken-Lindholm, C., Abankwa, D. Automated High-Throughput Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy to Detect Protein-Protein Interactions. Journal of Laboratory Automation. 21, 238-245 (2016).
- Liu, W., Cui, Y., Ren, W., Irudayaraj, J. Epigenetic biomarker screening by FLIM-FRET for combination therapy in ER+ breast cancer. Clinical Epigenetics. 11, 1-9 (2019).
- Liu, X., et al. Fast fluorescence lifetime imaging techniques: A review on challenge and development. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12, 1-27 (2019).
- Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Non fitting based FRET-FLIM analysis approaches applied to quantify protein-protein interactions in live cells. Biophysical Reviews. 3, 63-70 (2011).
- Padilla-Parra, S., Audugé, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells. Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).
- Stringari, C., et al. Phasor approach to fluorescence lifetime microscopy distinguishes different metabolic states of germ cells in a live tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13582-13587 (2011).
- Digman, M. A., Caiolfa, V. R., Zamai, M., Gratton, E. The phasor approach to fluorescence lifetime imaging analysis. Biophysical Journal. 94, 14-16 (2008).
- Liang, Z., Lou, J., Scipioni, L., Gratton, E., Hinde, E. Quantifying nuclear wide chromatin compaction by phasor analysis of histone Förster resonance energy transfer (FRET) in frequency domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) data. Data in Brief. 30, 105401 (2020).
- Grimm, J. B., Heckman, L. M., Lavis, L. D. The chemistry of small-molecule fluorogenic probes. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 113, (2013).
- Li, L., Sun, H. Next Generation of Small-Molecule Fluorogenic Probes for Bioimaging. Biochimica. 59, 216-217 (2020).
- Yao, R., Ochoa, M., Yan, P., Intes, X. Net-FLICS: fast quantitative wide-field fluorescence lifetime imaging with compressed sensing – deep learning approach. Light: Science and Applications. 8, 1-7 (2019).
- Smith, J. T., et al. Fast fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging via deep learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 24019-24030 (2019).
- Yao, R., Ochoa, M., Intes, X., Yan, P. Deep compressive macroscopic fluorescence lifetime imaging. Proceedings – International Symposium on Biomedical Imaging. 2018, 908-911 (2018).
