Questo protocollo descrive l'approccio tecnico per isolare sottopopolazioni di cellule stromali adipogeniche e fibro-infiammatorie da depositi di tessuto adiposo bianco (WAT) murino intra-addominale mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza o separazione di microsfere immunomagnetiche.
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Articolo metodologico
Isolamento di sottopopolazioni di cellule stromali adipogeniche e fibro-infiammatorie da depositi adiposi intra-addominali murini
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La frazione stromale-vascolare (SVF) del tessuto adiposo bianco (WAT) è notevolmente eterogenea ed è costituita da numerosi tipi cellulari che contribuiscono funzionalmente all'espansione e al rimodellamento del WAT in età adulta. Un enorme ostacolo allo studio delle implicazioni di questa eterogeneità cellulare è l'incapacità di isolare facilmente sottopopolazioni cellulari funzionalmente distinte da WAT SVF per analisi in vitro e in vivo. La tecnologia di sequenziamento a singola cellula ha recentemente identificato sottopopolazioni di cellule perivascolari PDGFRβ+ fibro-infiammatorie e adipogeniche funzionalmente distinte in depositi di WAT intra-addominali di topi adulti. I progenitori fibro-infiammatori (denominati "FIP") sono cellule produttrici di collagene non adipogenico che possono esercitare un fenotipo pro-infiammatorio. Le cellule precursori degli adipociti (APC) PDGFRβ+ sono altamente adipogeniche sia in vitro che in vivo dopo il trapianto di cellule. Qui, descriviamo diversi metodi per l'isolamento di queste sottopopolazioni di cellule stromali da depositi murini di WAT intra-addominali. FIP e APC possono essere isolati mediante smistamento cellulare attivato da fluorescenza (FACS) o sfruttando la tecnologia delle microsfere immunomagnetiche basate su anticorpi biotinilati. Le cellule isolate possono essere utilizzate per l'analisi molecolare e funzionale. Lo studio delle proprietà funzionali della sottopopolazione di cellule stromali in isolamento amplierà le nostre attuali conoscenze sul rimodellamento del tessuto adiposo in condizioni fisiologiche o patologiche a livello cellulare.
Introduzione
Il tessuto adiposo bianco (WAT) rappresenta il sito principale per l'accumulo di energia nei mammiferi. All'interno di questo tessuto, gli adipociti, o "cellule adipose", immagazzinano le calorie in eccesso sotto forma di trigliceridi, impacchettati in grandi goccioline lipidiche uniloculare. Inoltre, gli adipociti secernono una moltitudine di fattori che regolano vari aspetti dell'omeostasi energetica 1,2,3. Gli adipociti costituiscono la maggior parte del volume di WAT; tuttavia, gli adipociti rappresentano solo meno del 50% del totale delle cellule presenti in WAT
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Protocollo
Tutti i protocolli e le procedure per gli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per l'uso e la cura degli animali del Southwestern Medical Center dell'Università del Texas.
1. Isolamento della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo bianco gonadico
- Sezionare il tessuto adiposo bianco gonadico da topi di 6-8 settimane e posizionare i cuscinetti adiposi in 1x soluzione PBS.
- Combinare fino a 4 depositi di grasso (consigliati 2-4 depositi da 1-2 topi) e tritare il tessuto in un becher da 10 ml contenente 200 μl di tampone di digestione (1x HBSS, 1,5% BSA e 1 mg/mL di collagenasi D).
- ....
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Risultati
Questo protocollo descrive due strategie che consentono l'isolamento di popolazioni di cellule stromali distinte da depositi WAT intra-addominali di topi adulti. Le APC e le FIP possono essere isolate mediante FACS (Figura 1) o separazione immunomagnetica delle microsfere con anticorpi biotinilati (Figura 2). Entrambi gli approcci utilizzano reagenti e anticorpi tutti disponibili in commercio. La separazione immunomagnetica delle microsfere porta alla separazion.......
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Discussione
Il ceppo di topi C57BL/6 è il ceppo di topo più utilizzato negli studi sull'obesità indotta dalla dieta. I topi C57BL/6 aumentano rapidamente di peso quando vengono sottoposti a una dieta ricca di grassi (HFD) e sviluppano alcune delle caratteristiche principali della sindrome metabolica associata all'obesità (ad esempio, insulino-resistenza e iperlipidemia). In particolare, l'espansione del WAT che si verifica in associazione con l'alimentazione con dieta ricca di grassi (HFD) si verifica in modo specifico del deposito .......
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Dichiarazioni
T.A.P. è un dipendente e azionista di Novo Nordisk A/S
Ringraziamenti
Gli autori sono grati a Lisa Hansen e Kirsten Vestergaard per l'eccellente assistenza tecnica, e a P. Scherer, N. Joffin e C. Crewe per la lettura critica del manoscritto. Gli autori ringraziano l'UTSW Flow Cytometry Core per l'eccellente guida e assistenza nello sviluppo dei protocolli qui descritti. R.K.G. è supportato da NIH NIDDK R01 DK104789, NIDDK RC2 DK118620 e NIDDK R01 DK119163. J.P. è sponsorizzato da un premio pre-dottorato del Fondo per l'innovazione della Danimarca.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Preparazione meccanica dei tessuti e isolamento SVF | |||
| 40 e 100 µ filtri per cellule m | Fisher Scientific | 352340/352360 | |
| 1X Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Fisher Scientific | 21040CV | |
| Provette in polipropilene da 5 ml | Fisher Scientific | 352053 | |
| Digest Buffer (per 10mL) | |||
| 10 ml HBSS | Sigma | H8264 | |
| 10 mg Collagenasi D (1 mg/ml cc finale) | Roche | 11088882001 | |
| 0,15 g BSA (1,5 % cc finale) | Fisher Scientific | BP1605-100< | |
| strong>Separazione immunomagnetica di APC e non-APC | |||
| 5X MojoSort Buffer (tampone MS) | BioLegend | 480017 | |
| 5 ml MojoSort Magnet (MS magnete) | BioLegend | 480019 | |
| 100 &; L MojoSort Streptavidina Nanosfere BioLegend | 480015 | ||
| Purity Check e FACS | |||
| 10X Tampone per lisi di globuli rossi | eBioscience | 00-4300-54 | |
| Blocco Fc (Topo CD16/CD32) | eBioscience | 553141 | |
| Anticorpi | |||
| Biotina CD45 | BioLegend | 103103 | Concentrazione: ≤ 0,25 µ g per 10^6 cellule Specie: Topo Clone: 30-F11 |
| Biotina CD31 | BioLegend | 102503 | Concentrazione: ≤ 0,25 µ g per 10^6 cellule Specie: Topo Clone: MEC13.3 |
| Biotina CD9 | BioLegend | 124803 | Concentrazione: ≤ 0.25 µ g per 10^6 cellule Specie: Topo Clone: MZ3 |
| Biotina LY6C | BioLegend | 128003 | Concentrazione: ≤ 0.25 µ g per 10^6 cellule Specie: Topo Clone: HK1.4 |
| CD31-PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 102419 | Concentrazione: Diluizione 1:400 Specie: Topo Clone: 390 |
| CD45-PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 103131 | Concentrazione: Diluizione 1:400 Specie: Topo Clone: 30-F11 |
| CD140b PDGFRβ-PE | BioLegend | 136006 | Concentrazione: Diluizione 1:50 Specie: Topo Clone: APB5 |
| LY6C-APC | BioLegend | 128016 | Concentrazione: Diluizione 1:400 Specie: Topo Clone: HK1.4 |
| CD9-FITC | BioLegend | 124808 | Concentrazione: Diluizione 1:400 Specie: Topo Clone: MZ3 |
| Cell Culture e Terreno di coltura APC | |||
| Gonadal APC (per 500 ml) | |||
| 288 ml di DMEM con 1 g/L di glucosio | Corning | 10-014-CV | |
| 192 mL MCDB201 | Sigma | M6770 | |
| 10 ml di siero fetale bovino (FBS)** lotto#14E024 | Sigma | 12303C | |
| 5 ml 100% ITS premiscela | BD Bioscience | 354352 | |
| 5 mL 10 mM Acido L-ascorbico-2-2fosfato | Sigma | A8960-5G | |
| 50 &; L 100 g/ml FGF-base | R& D systems | 3139-FB-025/CF | |
| 5 mL Pen/Strep | Corning | 30-001-CI | |
| 500 &; L Gentamycin | Gibco | 15750-060 | |
| **NOTA: La capacità adipogenica degli APC primari può variare da lotto a lotto di FBS commerciali. Dovrebbero essere testati più lotti/fonti di FBS. |
Riferimenti
- Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (2), 85-97 (2011).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Funcke, J. B., Scherer, P. E.....
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Ristampe e permessi
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