Summary
Questo documento descrive un nuovo protocollo di dosimetria per le irradiazioni cellulari che utilizzano apparecchiature a raggi X a bassa energia. Le misurazioni vengono eseguite in condizioni che simulano il più possibile condizioni reali di irradiazione cellulare.
Abstract
L'importanza dei protocolli e delle norme dosimetriche per gli studi radiobiologici è evidente. Sono stati proposti diversi protocolli per la determinazione della dose utilizzando impianti a raggi X a bassa energia, ma a seconda delle configurazioni di irradiazione, dei campioni, dei materiali o della qualità del fascio, a volte è difficile sapere quale protocollo sia il più appropriato da utilizzare. Proponiamo pertanto un protocollo di dosimetria per le irradiazioni cellulari che utilizzano impianti a raggi X a bassa energia. Lo scopo di questo metodo è quello di eseguire la stima della dose a livello del monostrato cellulare per renderlo il più vicino possibile alle reali condizioni di irradiazione cellulare. Le diverse fasi del protocollo sono le seguenti: determinazione dei parametri di irradiazione (alta tensione, intensità, contenitore cellulare, ecc.), determinazione dell'indice di qualità del fascio (coppia di strati ad alta tensione-mezzo valore), misurazione dell'intensità di dose con camera di ionizzazione calibrata in condizioni di kerma dell'aria, quantificazione dell'attenuazione e dello scattering del mezzo di coltura cellulare con pellicole radiocromiche EBT3 e determinazione dell'intensità di dose a livello cellulare. Questa metodologia deve essere eseguita per ogni nuova configurazione di irradiazione cellulare in quanto la modifica di un solo parametro può avere un forte impatto sulla deposizione di dose reale a livello del monostrato cellulare, in particolare coinvolgendo raggi X a bassa energia.
Introduction
L'obiettivo della radiobiologia è quello di stabilire collegamenti tra la dose erogata e gli effetti biologici; la dosimetria è un aspetto cruciale nella progettazione di esperimenti radiobiologici. Da oltre 30 anni si sottolinea l'importanza delle norme dosimetriche e dell'armonizzazione delle pratiche1,2,3,4,5. Per stabilire un riferimento all'intensità di dose, esistonodiversi protocolli 6,7,8,9,10; tuttavia, come dimostrato da Peixoto e Andreo11 , possono esserci differenze fino al 7% a seconda della quantità dosimetrica utilizzata per la determinazione dell'intensità di dose. Inoltre, anche se esistono protocolli, a volte è difficile sapere quale protocollo sia il più adatto per una particolare applicazione, se presente, perché l'intensità di dose per le cellule dipende da parametri come il contenitore cellulare, la quantità di mezzi di coltura cellulare o la qualità del fascio, per esempio. Anche la dispersione e il backscattering per questo tipo di irradiazione sono un parametro molto importante da prendere in considerazione. Infatti, per i raggi X a bassa e media energia, nel protocollo di riferimento AAPM TG-6110, la dose assorbita nell'acqua viene misurata sulla superficie di un fantasma d'acqua. Tenendo conto delle condizioni molto specifiche di irradiazione cellulare, il piccolo volume di mezzi di coltura cellulare circondati dall'aria è più vicino alle condizioni del kerma rispetto a quelle definite per una dose assorbita con un grande fantasma equivalente all'acqua come nel protocollo TG-61. Pertanto, abbiamo scelto di utilizzare il kerma in acqua come quantità dosimetrica come riferimento piuttosto che la dose assorbita nell'acqua. Pertanto, proponiamo un nuovo approccio per fornire una migliore determinazione della dose effettiva erogata alle cellule.
Inoltre, un altro aspetto cruciale per gli studi radiobiologici è la completa comunicazione dei metodi e dei protocolli utilizzati per l'irradiazione per poter riprodurre, interpretare e confrontare i risultati sperimentali. Nel 2016, Pedersen etal. Un recente studio più ampio condotto da Draeger e altri13 ha evidenziato che, anche se sono riportati alcuni parametri dosimetrici come la dose, l'energia o il tipo di sorgente, manca gran parte dei parametri fisici e dosimetrici essenziali per replicare correttamente le condizioni di irradiazione. Questa rassegna su larga scala, di oltre 1.000 pubblicazioni riguardanti gli ultimi 20 anni, mostra una significativa mancanza di segnalazione delle condizioni fisiche e dosimetriche negli studi radiobiologici. Pertanto, una descrizione completa del protocollo e del metodo utilizzato negli studi radiobiologici è obbligatoria per avere esperimenti robusti e riproducibili.
Tenendo conto di questi diversi aspetti, per gli esperimenti radiobiologici effettuati presso l'IRSN (Istituto per la protezione dalle radiazioni e la sicurezza nucleare), è stato attuato un rigoroso protocollo per le irradiazioni cellulari in un impianto di ortotensione. Questo protocollo di dosimetria è stato progettato per simulare il più possibile le condizioni reali di irradiazione cellulare e quindi per determinare la dose effettiva erogata alle cellule. A tal fine, vengono elencati tutti i parametri di irradiazione e l'indice di qualità del fascio è stato valutato misurando lo strato di mezzo valore (HVL) per il quale sono stati effettuati alcuni adattamenti in quanto non è possibile seguire le raccomandazioni standard delprotocollo AAPM 10. La misurazione dell'intensità di dose assoluta è stata quindi eseguita con la camera di ionizzazione all'interno del contenitore cellulare utilizzato per le irradiazioni cellulari, e l'attenuazione e la dispersione del supporto di coltura cellulare sono state quantificate anche con pellicole radiocromatiche EBT3. Poiché la modifica di un solo parametro del protocollo può influire in modo significativo sulla stima della dose, viene eseguita una dosimetria dedicata per ogni configurazione di irradiazione cellulare. Inoltre, il valore HVL deve essere calcolato per ogni combinazione tensione-filtro. In questo lavoro attuale vengono utilizzate una tensione di 220 kV, un'intensità di 3 mA e una filtrazione intrinseca e aggiuntiva di 0,8 mm e 0,15 mm di berillio e rame. La configurazione di irradiazione cellulare scelta si trova su un pallone T25, in cui le cellule sono state irradiate con 5 ml di mezzi di coltura cellulare.
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Protocol
1. Piattaforma di irradiazione e determinazione dei parametri di irradiazione
- Utilizzare una piattaforma di irradiazione che fornisce raggi X a bassa e media energia. Determinare i parametri dell'esperimento per garantire la robustezza e la riproducibilità dell'esperimento radiobiologico: Alta tensione, Intensità, Filtrazione (inerente e aggiuntiva), Strato a metà valore (HVL), Energia effettiva, Rivelatore utilizzato per le misurazioni della dosimetria, Distanza del campione sorgente (SSD), Campo di irradiazione (forma, dimensione, geometria), Quantità dosimetrica, Metodo dosimetrico, Intensità di dose, Contenitore cellulare e Quantità di mezzi di coltura cellulare. Tutti i parametri utilizzati in questo protocollo sono riportati nella tabella 1.
2. Indice di qualità del fascio: determinazione dello strato di mezzo valore
NOTA: L'HVL è definito come lo spessore di un attenuatore (di solito rame o alluminio) per ridurre l'intensità della trave di un fattore due rispetto al valore originale.
- Impostare l'apparecchiatura (supporto, collimatore, diaframma, ionizzazione) all'interno dell'involucro di irradiazione seguendo le istruzioni della figura 1. Nessun materiale attenuatore viene utilizzato in questa fase.
- Assicurarsi che tutte le distanze riportate nella figura 1 siano corrette. Misurarli con un metro a nastro.
- Posizionare la camera di ionizzazione in posizione orizzontale. Per questo lavoro, abbiamo utilizzato una camera di ionizzazione cilindrica 31002 (equivalente a 31010) calibrata nel kerma dell'aria.
- Pre-irradiare la camera di ionizzazione per 5 minuti e misurare lo sfondo (questo passaggio può essere eseguito senza collimatore).
- Eseguire 10 misurazioni di 1 min ciascuna in modalità di raccolta della carica corrispondente alvalore grezzo M (in coulombs).
- Prendere la temperatura e la pressione con adeguate apparecchiature calibrate posizionate all'interno dell'involucro di irradiazione nel nostro caso (se non è possibile, posizionarlo vicino all'esperimento). Correggere la letturam grezza sull'elettrometro in base al fattore di correzione della temperatura e della pressione indicato come segue:
dove: T (°C) e P (hPa) sono rispettivamente la temperatura e la pressione effettive. Tref e Pref sono la temperatura e la pressione di riferimento quando la ionizzazione è stata calibrata dal laboratorio standard. La pressione e la temperatura devono essere misurate con strumenti calibrati. Il valore ottenuto in modalità carica è il valore medio di riferimento M (in coulombs).
NOTA: Questo passaggio non è strettamente necessario per la misurazione HVL, ma è raccomandato. - Posizionare un attenuatore di un certo spessore sopra il diaframma. Il set HVL è composto da fogli con diversi spessori (0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5 e 10 mm di rame) con una dimensione che consente di coprire l'intera trave (80 x 80 mm qui).
- Prendere una misura di 1 min (Mgrezzo corretto dal KT,P come descritto in precedenza).
- Se l'intensità di dose è divisa per un fattore 2 rispetto al valore iniziale, si trova il valore HVL. Effettuare 5 misurazioni di 1 minuto per stimare l'intensità media di dose.
- Se l'intensità di dose non è divisa per un fattore 2 rispetto al valore iniziale, aumentare o diminuire lo spessore dell'attenuatore e prendere un'altra misurazione. Regolare lo spessore dell'attenuatore in base alle esigenze.
- Una volta trovato lo spessore dell'attenuatore che diminuisce l'intensità della trave di un fattore due, prendere 5 misurazioni di 1 min per confermare l'HVL.
NOTA: Nella maggior parte dei casi, lo spessore esatto dell'attenuatore non può essere trovato dalle pellicole disponibili. In questo caso, procedere per bisezione e interpolare l'HVL.
3. Valutazione del campo di irradiazione (nessuna stima della dose)
- Posizionare una pellicola EBT3 sul supporto utilizzato per l'irradiazione.
- Irradiare questa pellicola per ottenere un campo di irradiazione ben marcato (almeno 2 Gy).
- Scansionare la pellicola EBT3 utilizzando uno scanner dedicato.
- Tracciate il profilo di dose utilizzando l'opzione Analizza (Image J) e quindi Traccia profilo (Plot Profile) (Figura 2).
- Determinare la dimensione dell'utilizzo del campo di irradiazione per l'irradiazione (area omogenea, escluse le regioni di penumbra, vedere figura 2).
- Fare segni sul supporto utilizzato per l'irradiazione per assicurarsi che il contenitore cellulare si trova nella posizione giusta.
NOTA: In questa fase viene determinata la dimensione del campo di irradiazione e la dose non è stimata. La procedura completa per la lettura e l'analisi del film è fornita nella sezione 5. Inoltre, prendere margini per evitare errori dovuti al posizionamento del contenitore di celle.
4. Misurazione dell'intensità di dose con camera di ionizzazione
- Prendere il contenitore della cella e rompere una piccola parte sul lato o sul fondo (a seconda del particolare contenitore e della camera di ionizzazione utilizzata) per poter posizionare la camera di ionizzazioneall'interno (Figura 3,sezione superiore) o sotto(Figura 3, sezione inferiore) del contenitore. Gli esempi sono riportati nella figura 3 con diverse camere di ionizzazione (cilindriche o parallele piane) e contenitori di celle. In questo caso è stato utilizzato un pallone T25(Figura 3, scatola rossa).
NOTA: un ferro da saldare o bisturi riscaldato è una buona alternativa per fare fori in articoli di plastica - Posizionare il contenitore all'interno dell'involucro sul supporto utilizzato per l'irradiazione (lastra di carbonio qui).
- Posizionare la camera di ionizzazione nel contenitore (Figura 3, casella rossa), nella posizione corretta e collegarla all'elettrometro.
- Assicurarsi che tutti i parametri di irradiazione elencati nella sezione 1 siano corretti (alta tensione, intensità, filtrazioni aggiuntive, distanza del campione sorgente, ecc.).
- Pre-irradiare la camera di ionizzazione per 5 minuti ed eseguire l'azzeramento dell'elettrometro.
- Effettuare 10 misurazioni di 1 min per determinare l'intensità media di dose nel kerma dell'aria (Gy.min-1). Calcolare la determinazione dell'intensità di dosenell'aria K come segue:
dove M è la lettura del dosimetro corretta per temperatura, pressione, effetto polarità, ricombinazione ionica e calibrazione elettrometrica. NKair e Kqsono i fattori di calibrazione e correzione per la qualità delle radiazioni, i cui valori sono specifici di ogni camera di ionizzazione.
5. Misurazione dell'attenuazione e dello scattering dei mezzi di coltura cellulare
NOTA: Maneggiare pellicole EBT3 con guanti durante tutta la procedura.
- Preparazione dell'esperimento
- Tagliare piccoli pezzi di pellicole EBT3 almeno 24 ore prima dell'irradiazione.
- Determinare la dimensione delle pellicole in funzione del contenitore di cellule utilizzato per esperimenti di radiobiologia (4 x 4 cm per un pallone T25, ad esempio).
Tagliare due serie di pellicole radiocromache: un insieme per le curve di taratura composto da tre pezzi di pellicola radiocromatica EBT3 per dose o punto di tempo (nove punti in totale per questo lavoro); e un insieme per la quantificazione dell'attenuazione dei mezzi di coltura cellulare, anche tre pezzi per punto. - Numera tutti i film per l'identificazione (angolo in alto a destra qui) e scansionali nella stessa posizione sullo scanner.
- Tenere i film lontani dalla luce.
- Preparare il contenitore di celle utilizzato per le misurazioni della pellicola EBT3 e, se necessario, tagliare una parte per inserire la pellicola all'interno (un esempio con un T25 è riportato nella figura 4).
- Stima dell'intensità di dose
- Misurare l'intensità di dose per la configurazione descritta nella sezione precedente.
- Mantenere questa configurazione in posizione per l'irradiazione delle pellicole radiocromiche EBT3 e utilizzare lo stesso tipo di contenitore di cellule.
- Costruzione della curva di taratura
- Prendi le pellicole EBT3 pretata per la curva di calibrazione.
- Non irradiare tre pezzi (0 Gy).
- Posizionare il primo film all'interno del contenitore di celle, nella stessa configurazione dell'irradiazione cellulare.
- Irradiarlo per ottenere i primi punti di dose.
- Ripetere questa operazione per ottenere tre pezzi di pellicole EBT3 irradiate con la stessa dose.
- Eseguire questa funzione per ciascun punto di dose (nove punti dose in questo lavoro (0, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 2,5 e 3 Gy) come illustrato nella figura 5).
- Valutazione dell'attenuazione dei mezzi di coltura cellulare e dello scattering.
- Scegliere lo stesso tempo di irradiazione per tutte le irradiazioni (60 s, ad esempio).
- Irradiare tre pezzi di pellicole EBT3 nel contenitore senza acqua.
- Irradiare tre pezzi di pellicole EBT3 nel contenitore con acqua come segue.
- Posizionare il film all'interno del contenitore.
- Riempire il contenitore con l'esatta quantità di acqua per rappresentare il supporto di coltura cellulare (5 mL qui). Utilizzare piccoli pezzi di nastro se le pellicole non rimangono sommerse correttamente.
- Posizionare il contenitore della cella all'interno dell'involucro e assicurarsi che la pellicola sia immersa correttamente.
- Una volta completata l'irradiazione, prendere le pellicole EBT3, asciugarle con carta assorbente e conservarle lontano dalla luce.
6. Lettura di pellicole radiocromache EBT3
- Leggere le pellicole EBT3 almeno 24 ore dopo l'irradiazione.
- Scansiona i film su uno scanner dedicato.
- Impostare i parametri dello scanner come: formato tiff rosso-verde-blu a 48 bit, 150 dpi in modalità di trasmissione e nessuna correzione dell'immagine.
- Eseguire un riscaldamento dello scanner come segue.
- Posizionare una pellicola non irradiata sullo scanner.
- Avviare un'anteprima della scansione.
- Avvia un timer e attendi 30 s.
- Avviare la scansione.
- Alla fine della scansione, avviare un timer e attendere 90 s.
- Allo stesso tempo, registra la scansione, apri l'immagine con ImageJ, traccia un ROI quadrato (sempre della stessa dimensione e nella stessa posizione) e prendi una misurazione del livello medio di pixel rossi dell'area.
- Alla fine degli anni '90, ripetere la procedura dal passaggio 2 (senza toccare la pellicola all'interno dello scanner).
- Ripetere questo problema almeno 30 volte per riscaldare e stabilizzare lo scanner (nessuna variazione del livello medio di pixel rossi dell'area selezionata sulle pellicole non irradiate). Se lo scanner, o cioè il valore medio dei pixel rossi, non è stabilizzato, continuare la procedura.
- Scansione dei film EBT3
- Posizionare il primo film al centro del letto dello scanner. Delimitare un'area per posizionare sempre il film nello stesso punto e nello stesso orientamento.
- Avviare un'anteprima della scansione.
- Avvia un timer e attendi 30 s.
- Avviare la scansione.
- Alla fine della scansione, avviare un timer e attendere 90 s. Durante questi anni '90 cambiare il film EBT3.
NOTA: Un'analisi delle pellicole radiocromache EBT3 è stata eseguita utilizzando un programma C ++ auto-programmato. È possibile utilizzare diversi metodi per l'analisi della pellicola EBT3, ad esempio il metodo del canale rosso o il metodoa tre canali 14,15. In questo caso, abbiamo usato il metodo del canale rosso senza sottrazione di fondo, e le immagini sono state convertite in densità ottiche e quindi alla dose utilizzando il nostro programma. Poiché questo metodo è già ben definito, il nostro programma C ++ non è stato incluso qui. Inoltre, il softwarededicato 16 può essere utilizzato anche per l'analisi della pellicola EBT3.
7. Determinazione dell'intensità di dose a livello del monostrato cellulare
- Convertire l'intensità media di dose ottenuta con la camera di ionizzazione corretta dall'attenuazione e dallo scattering del mezzo di coltura cellulare (K) nel kerma dell'acqua utilizzando il rapporto tra il coefficiente medio di assorbimento di energia di massa per l'acqua e l'aria valutato sullo spettro di fluenza fotone (μen/ρ).
Un software dedicato17 è stato utilizzato per calcolare lo spettro di energia dei fotoni nell'aria senza fantasma, e abbiamo usato la tabellaNIST 18 per calcolare il coefficiente medio di assorbimento dell'energia di massa.
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Representative Results
In questo lavoro abbiamo utilizzato una piattaforma dedicata all'irradiazione di piccoli animali19; tuttavia, questa piattaforma può essere utilizzata per irradiare altri tipi di campioni come le cellule. La sorgente di irradiazione è un tubo variano a raggi X (NDI-225-22) con una filtrazione intrinseca di 0,8 mm di berillio, una grande dimensione sportiva focale di 3 mm, un intervallo di alta tensione di circa 30-225 kV e un'intensità massima di 30 mA.
I parametri utilizzati per questo studio sono riportati nella tabella 1. Abbiamo scelto di mostrare un esempio dell'uso di questo protocollo per l'irradiazione cellulare in un pallone T25 con 5 ml di mezzi di coltura cellulare.
Livello a metà valore
La tabella 2 riporta le misurazioni effettuate per stimare lo spessore dell'attenuatore necessario per ridurre l'intensità della trave di un fattore due. Per questo, sono state effettuate 10 misurazioni di riferimento per stimarela lettura grezza M media sull'elettrometro (in Coulombs), corretta dal fattore di correzione della temperatura e della pressione (KT,P).
Diversi spessori di attenuatori sono stati quindi testati per trovare lo spessore che ha diminuito l'intensità del fascio di un fattore due. Quando è stato trovato questo spessore, sono state effettuate cinque misurazioni per valutare il valoregrezzo medio M corretto da KT,P.
Per questa configurazione è stato trovato uno strato di mezzo valore di 0,667 mm di rame. Dalla misurazione HVL, possiamo calcolare l'energia effettiva del fascio, che è di circa 69 keV nel nostro caso.
Misurazione dell'intensità di dose
Prima di queste misurazioni, una pellicola EBT3 è stata irradiata per determinare la superficie su cui il campo di irradiazione è omogeneo, permettendoci di posizionare correttamente il contenitore cellulare. Quest'area è di circa 10 x 10 cm² escludendo le regioni di penumbra mostrate da linee tratteggiate nella figura 2. Quindi, la misurazione dell'intensità di dose è stata eseguita utilizzando una camera di ionizzazione cilindrica 31002 (equivalente a 31010) calibrata nel kerma dell'aria. Per questa configurazione, con un campo di irradiazione a campo aperto a 35 cm dalla sorgente in un contenitore di cellule T25 posto su una piastra di carbonio, l'intensità di dose era di circa 0,626 Gy.min-1 inariaK.
Per determinare la dose esatta sulle cellule, l'aria K misurataè stata convertita in kerma d'acqua. La figura 5 mostra lo spettro energetico dei raggi X ottenuto con il softwarededicato 17. Da questo spettro energetico e dalla tabella NIST, possiamo convertire l'intensità di dose inaria K inacquaK , che era 0,659 Gy.min-1.
L'incertezza globale della misurazione dell'intensità di dose assoluta era di circa il 3% ad un livello di confidenza del 95%.
Attenuazione e dispersione dei mezzi di coltura cellulare
Per la quantificazione dell'attenuazione e dello scattering dei mezzi di coltura cellulare, sono state effettuate misurazioni dosimetriche con pellicole radiocromiche EBT3 a temperatura ambiente. Dalla misurazione con la camera di ionizzazione è stata determinata l'intensità di dose. Le pellicole di taratura sono state quindi irradiate nella stessa posizione. Le pellicole radiocromiche EBT3 sono state calibrate tra 0 e 3 Gy con passaggi di 0,25 Gy tra 0 e 1 gy e 0,5 gy passi tra 1 e 3 Gy (nove punti dose per costruire la curva di calibrazione) come mostrato nella figura 6. I punti di dose sonostati dotati di una curva polinomiale di 4° grado. Le pellicole EBT3 sono state poi irradiate con e senza l'esatta quantità di mezzi di coltura cellulare all'interno del contenitore cellulare per valutare l'attenuazione e lo scattering dovuto al supporto di coltura cellulare. Per questa configurazione, l'attenuazione del supporto di coltura cellulare è stata di circa l'1,5%.
L'incertezza generale delle misurazioni della pellicola EBT3 era di circa il 4% a un livello di confidenza del 95%.
Misurazioni di routine
Prima di eseguire le irradiazioni cellulari, l'intensità di dose è stata misurata ogni volta nello stesso contenitore utilizzato per l'irradiazione. Pertanto, abbiamo usato l'intensità di dose giornaliera per stimare il tempo di irradiazione. Se seguiamo da vicino il protocollo e non cambiamo alcun parametri, la misurazione HVL e l'attenuazione dovuta al supporto di coltura cellulare non devono essere ripetute. Ad esempio, la tabella utilizzata per la misurazione giornaliera è riportata nella tabella 3.
Figura 1: Schema della configurazione in atto sull'involucro SARRP per le misurazioni HVL. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Valutazione della dimensione del campo di irradiazione. Profilo di dose ottenuto a 35 cm alla fonte senza collimatore. Le linee tratteggiate mostrano l'area considerata per l'irradiazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Fotografie di contenitori di cellule con la camera di ionizzazione per la misurazione dell'intensità di dose. Parte superiore: ad esempio per la misurazione con una camera di ionizzazione cilindrica 31002. Parte inferiore: ad esempio per la misurazione con una camera di ionizzazione TM23342. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Fotografie del T25 utilizzato per la misurazione dell'attenuazione dei mezzi di coltura cellulare. La parte superiore del T25 è stata tagliata per poter posizionare il film all'interno del pallone. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Spettri di energia simulati per un'alta tensione di 220 kV con 0,8 mm di Be e 0,15 mm di filtrazioni17 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Pellicole EBT3 irradiate per costruire la curva di taratura e la corrispondente curva di taratura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Alta tensione (kV) | 220 |
| Intensità (mA) | 3 |
| Filtrazioni (intrinseche e aggiuntive) | 0,8 mm di Be + 0,15 mm Cu |
| Strato a metà valore (mm Cu) | Determinato di seguito |
| Energia efficace (keV) | Determinato di seguito |
| Rilevatore utilizzato | Camera di ionizzazione cilindrica + pellicole radiocromatiche EBT3 |
| Distanza del campione sorgente | 35 cm |
| Campo di irradiazione (forma, dimensioni, geometria) | Campo aperto (senza collimatore), quadrato, 20 x 20 cm |
| Quantità di dosimetria | Kair e Kwater |
| Metodo dosimetrico | Come descritto nella sezione del protocollo |
| Contenitore di celle | T25 |
| Quantità di supporti di coltura cellulare | 5 ml |
| Dose (Gy/min) | Determinato di seguito |
Tabella 1: Elenco dei parametri di configurazione.
| Attenuatore (mm Cu) | Misura IC (nC) | Temperatura (°C) | Pressione (hPa) | KT.P. | Misura IC corretta da kT.P (nC) | Valore medio corretto (nC) | Deviazione ST | Stima dell'attenuazione (M / Mref) | |
| misure di riferimento (Mref) | 0 | 10.480 | 21.6 | 993.2 | 1.026 | 10.752 | 10.761 | 0.005 | - |
| 10.480 | 21.6 | 993.1 | 1.026 | 10.752 | |||||
| 10.490 | 21.6 | 993.1 | 1.026 | 10.763 | |||||
| 10.490 | 21.6 | 993.1 | 1.026 | 10.763 | |||||
| 10.490 | 21.6 | 993.2 | 1.026 | 10.763 | |||||
| 10.490 | 21.6 | 993.2 | 1.026 | 10.763 | |||||
| 10.490 | 21.6 | 993.1 | 1.026 | 10.763 | |||||
| 10.490 | 21.6 | 993.2 | 1.026 | 10.763 | |||||
| 10.490 | 21.6 | 993.2 | 1.026 | 10.763 | |||||
| 10.490 | 21.6 | 993.1 | 1.026 | 10.763 | |||||
| Ritrovamento dello spessore dell'attenuatore (M) | 0.514 | 5.840 | 21.7 | 993.2 | 1.026 | 5.992 | - | - | 0.557 |
| 0.564 | 5.651 | 21.7 | 993.2 | 1.026 | 5.798 | - | - | 0.539 | |
| 0.584 | 5.569 | 21.7 | 993.2 | 1.026 | 5.714 | - | - | 0.531 | |
| 0.604 | 5.491 | 21.7 | 993.2 | 1.026 | 5.634 | - | - | 0.524 | |
| 0.615 | 5.441 | 21.7 | 993.2 | 1.026 | 5.582 | - | - | 0.519 | |
| 0.627 | 5.380 | 21.7 | 993.2 | 1.026 | 5.520 | - | - | 0.513 | |
| 0.647 | 5.307 | 21.7 | 993.2 | 1.026 | 5.445 | - | - | 0.506 | |
| 0.667 | 5.240 | 21.8 | 993.2 | 1.026 | 5.376 | - | - | 0.500 | |
| Misure con l'attenuatore destro (M) | 0.667 | 5.231 | 21.8 | 993.4 | 1.026 | 5.368 | 5.373 | 0.003 | 0.499 |
| 0.667 | 5.236 | 21.8 | 993.1 | 1.026 | 5.375 | ||||
| 0.667 | 5.235 | 21.8 | 993.2 | 1.026 | 5.373 | ||||
| 0.667 | 5.236 | 21.8 | 993.2 | 1.026 | 5.374 | ||||
| 0.667 | 5.235 | 21.8 | 993.3 | 1.026 | 5.373 |
Tabella 2: Misurazione per la determinazione del livello di mezzo valore.
| Misura IC (nC) | Temperatura (°C) | Pressione (hPa) | KT.P. | Misura IC corretta da kT.P (nC) | Valore medio corretto per kT.P (nC) | Deviazione ST | Valore medio corretto da tutti i fattori di correzione | Intensità di dose nel kerm dell'aria (Gy/min) | Dose a livello cellulare in Kwater (Gy/min) |
| 2.495 | 22.3 | 1001 | 1.020 | 2.545 | 2.546 | 0.001 | 2.536 | 0.626 | 0.659 |
| 2.496 | 22.3 | 1001 | 1.020 | 2.546 | |||||
| 2.497 | 22.3 | 1001 | 1.020 | 2.547 | |||||
| 2.498 | 22.3 | 1001 | 1.020 | 2.548 | |||||
| 2.496 | 22.3 | 1001 | 1.020 | 2.546 | |||||
| 2.495 | 22.3 | 1000.9 | 1.020 | 2.545 | |||||
| 2.494 | 22.3 | 1000.9 | 1.020 | 2.544 | |||||
| 2.495 | 22.3 | 1000.9 | 1.020 | 2.545 | |||||
| 2.496 | 22.3 | 1000.9 | 1.020 | 2.546 | |||||
| 2.496 | 22.3 | 1000.9 | 1.020 | 2.546 |
Tabella 3: Misurazioni giornaliere dell'intensità di dose per l'irradiazione cellulare.
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Discussion
Questo lavoro presenta il protocollo utilizzato e implementato per le irradiazioni cellulari utilizzando un impianto a raggi X a bassa energia. Al giorno d'oggi, molti esperimenti di radiobiologia vengono eseguiti con questo tipo di irradiatore in quanto sono facili da usare, convenienti e con pochissimi vincoli di radioprotezione, rispetto alla fonte di cobalto per esempio. Sebbene queste configurazioni abbiano molti vantaggi, in quanto utilizzano una fonte di energia a basso raggio X, una modifica di un solo parametro di irradiazione può avere un impatto significativo sulla dosimetria. Diversi studi hanno già evidenziato l'importanza degli standard e dei protocolli dosimetrici per gli studi di radiobiologia2,5,20,21. Anche se diversi protocolli sono già stati ben definiti nellaletteratura 1,5, abbiamo deciso di sviluppare un nuovo protocollo per eseguire misurazioni dosimetriche per simulare il più possibile le condizioni reali di irradiazione cellulare e tenere conto di tutti i parametri che possono influenzare la dose fisica, specialmente per i raggi X a bassa energia21,22. Pertanto, abbiamo scelto di implementare un protocollo rigoroso per ridurre al minimo le incertezze. A tal fine sono stati fissati parametri di irradiazione(tabella 1). Sono quindi necessari i seguenti tre passaggi: i) determinazione dell'indice di qualità del fascio, ii) misurazione dell'intensità di dose assoluta con una camera di ionizzazione e iii) misurazione dell'attenuazione e dello scattering dovuto al mezzo di coltura cellulare con pellicole radiocromiche EBT3.
L'indice di qualità del fascio corrispondeva alla coppia tensione-mezzo valore strato (HVL) utilizzata per caratterizzare i raggi X a bassa energia. L'HVL è un indicatore pratico per descrivere la radiazione poli energetica ed è definito come lo spessore di un attenuatore (di solito rame o alluminio) per ridurre l'intensità di dose di kerma dell'aria di un fattore due dal valore originale. Le misurazioni HVL sono state eseguite utilizzando le seguenti raccomandazioni del protocollo AAPM per un fascio di raggi X da 40-300 kV10. Tuttavia, è stato necessario a realizzare alcuni adattamenti perché nell'involucro dell'irradiatore non è possibile raggiungere una distanza di 1 metro tra la sorgente e la camera di ionizzazione. Pertanto, nel presente lavoro, abbiamo utilizzato una distanza di 58 cm tra la sorgente e il rivelatore per le misurazioni HVL, come illustrato nella figura 1. Abbiamo deciso di lasciare 25 cm dopo la camera di ionizzazione perché un sacco di materiale elettronico, supporto ed elementi metallici sono presenti nella parte inferiore dell'involucro per limitare l'effetto backscatter di questi elementi. La misurazione dell'HVL è uno degli aspetti critici di questo protocollo. In effetti, per molti irradiatori a raggi X, l'interno degli involucri è molto limitato e queste non sono le condizioni ottimali per eseguire le misurazioni o diventa impossibile. Sebbene le misurazioni sperimentali siano il modo migliore per valutare l'HVL, quando queste misurazioni sono troppo difficili o addirittura impossibili da eseguire, il softwarededicato 17 può essere utilizzato per fornire una buona stima per l'HVL, oppure una simulazione Monte Carlo puòessere utilizzata 23. Nel presente lavoro, abbiamo utilizzato un software dedicato per ottenere lo spettro energetico a raggi X (Figura 5). Siamo stati anche in grado di confrontare l'HVL misurato e calcolato, che era lo stesso, e di confrontare anche l'energia effettiva.
Per le misurazioni della dosimetria, abbiamo quindi scelto di simulare il più possibile le condizioni reali di irradiazione cellulare. Per questo, abbiamo eseguito direttamente le misurazioni dell'intensità di dose assoluta con la camera di ionizzazione all'interno del contenitore cellulare utilizzato per l'irradiazione delle cellule (Figura 3). Tuttavia, poiché abbiamo utilizzato una camera di ionizzazione cilindrica calibrata per travi oltre i 100 kV, non eravamo esattamente nella stessa posizione delle celle a causa dello spessore della camera di ionizzazione. Per i fasci inferiori (15-70 kV), dove è possibile utilizzare la camera parallela piana, possiamo essere ancora più vicini alle reali condizioni di irradiazione cellulare. Quindi, sono state eseguite misurazioni dosimetriche relative per valutare l'attenuazione e lo scattering dovuto al mezzo di coltura cellulare. I risultati presentati su questo lavoro non evidenziano una variazione significativa della dose depositata con o senza l'esatta quantità di mezzi di coltura cellulare in quanto abbiamo utilizzato una tensione di 220 kV, una filtrazione aggiuntiva di 0,15 mm di Cu e avevamo solo 5 mL di mezzo di coltura cellulare. Tuttavia, in un precedentestudio 21 condotto a 80 kV, abbiamo sottolineato che una variazione del supporto di coltura cellulare e della filtrazione influisce significativamente sulla dose fisica, fino al 40% rispetto alla configurazione di riferimento quando abbiamo utilizzato una filtrazione in alluminio da 1 mm. Questo impatto è stato dimostrato anche in termini di effetti biologici misurando la frazione cellulare sopravvissuta utilizzando un saggio clonogenico21,23. Pertanto, a seconda della tensione, della filtrazione aggiuntiva, del contenitore e della quantità di mezzi di coltura cellulare, la dose depositata sulle cellule può essere diversa se il protocollo non è seguito da vicino per tutte le irradiazioni.
Di conseguenza, dovrebbe essere istituita una dosimetria dedicata per tutte le configurazioni di irradiazione cellulare. Sebbene ciò sia restrittivo e la modifica di un solo parametro richieda l'implementazione di una nuova configurazione, abbiamo deciso di fare questa scelta per essere il più vicino possibile alle reali condizioni di irradiazione cellulare. Ciò richiede una stretta collaborazione tra i fisici e il radiobiologo al fine di impostare il miglior design per la configurazione. Nel nostro istituto, sulla nostra piattaforma sono stati stabiliti una dozzina di protocolli per un intervallo di tensione da 40 a 220 kV per il quale è possibile irradiare pozzi da T25, T75, pozzi da 6 a 96 piastre o piastre di Petri.
Sebbene questo protocollo sembri piuttosto lungo da attuare, una volta stabilita la configurazione, l'unica misura da prendere il giorno dell'irradiazione è la misurazione dell'intensità di dose con la camera di ionizzazione all'interno del contenitore cellulare. Questa misurazione è anche un controllo di qualità che ci consente di garantire che l'intensità di dose sia quella prevista.
Per garantire la riproducibilità degli studi radiobiologici e per poter confrontare e interpretare gli esperimenti, è importante seguire rigorosamente i protocolli stabiliti e segnalare tutti gli aspetti di dosimetria e configurazione, in particolare per gli impianti che utilizzano raggi X a bassa o media energia. Il nuovo protocollo qui proposto riguarda le irradiazioni cellulari, applicabili a molti impianti a raggi X, e tiene conto di tutti i parametri che influenzano la dosimetria e fornisce una migliore stima della dose effettiva erogata alle cellule.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
nessuno
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 31010 ionization chamber | PTW | ionization Radiation, Detectors including code of practice, catalog 2019/2020, page 14 | https://www.ptwdosimetry.com/fileadmin/user_upload/DETECTORS_Cat_en_16522900_12/blaetterkatalog/index.html?startpage=1#page_14 |
| EBT3 radiochromic films | Meditest | quote request | https://www.meditest.fr/produit/ebt3-8x10/ |
| electrometer UNIDOSEwebline | PTW | online catalog, quote request | https://www.ptwdosimetry.com/en/products/unidos-webline/?type=3451&downloadfile=1593& cHash= 6096ddc2949f8bafe5d556e931e6c865 |
| HVL material (filter, diaphragm) | PTW | online catalog, page 70, quote request | thickness foils: 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5 and 10 mm of copper, https://www.ptwdosimetry.com/fileadmin/user_upload/Online_Catalog/Radiation_Medicine_Cat_en_ 58721100_11/blaetterkatalog/index.html#page_70 |
| scanner for radiochromic films | Epson | quote request | Epson V700, seiko Epson corporation, Suwa, Japan |
| temperature and pressure measurements, Lufft OPUS20 | lufft | quote request | https://www.lufft.com/products/in-room-measurements-291/opus-20-thip-1983/ |
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