免疫反応向上技術を用いた超高速ウェスタンブロット
Summary
超高速ウェスタンブロッティング技術は、免疫反応促進剤と組み合わせて、環状ドレインおよび補充(CDR)技術を介して抗原抗体結合の運動を改善することによって開発される。
Abstract
ウェスタンブロット(免疫ブロットとも呼ばれる)は、生物医学研究のための正規の方法です。これは、特定のタンパク質の相対的なサイズと存在量だけでなく、翻訳後のタンパク質修飾を決定するために一般的に使用されます。この技術は豊かな歴史を持ち、そのシンプルさのために広く使用されています。しかし、ウェスタンブロッティング手順は、スループットを制限する長いインキュベーション時間であるという重大なボトルネックで、完了までに数時間、さらには数日かかることで有名です。これらのインキュベーションステップは、バルク溶液から膜上の固定化された抗原への抗体の拡散が遅いために必要とされる:膜付近の抗体濃度はバルク濃度よりもはるかに低い。ここでは、抗体溶液の循環ドレインおよび補充(CDR)による抗原結合を改善することにより、これらのインキュベーション間隔を劇的に短縮するイノベーションを提示する。また、免疫反応増強技術を用いて、アッセイの感度を維持しました。市販の免疫反応増強剤とのCDR法の組合せは、出力シグナルを高め、抗体インキュベーション時間を実質的に短縮した。得られた超高速のウェスタンブロットは感受性の損失なしで20分で達成することができる。この方法は、化学発光と蛍光検出の両方を使用してウェスタンブロットに適用することができます。この簡単なプロトコルにより、研究者は多くのサンプルでタンパク質発現の分析をよりよく探求することができます。
Introduction
ウェスタンブロット(イムノブロットとも呼ばれる)は、幅広い科学的および臨床的分野にわたる強力で基本的な技術です。この技術は、タンパク質1の存在、相対的存在量、相対分子質量、および翻訳後修飾を調べるために使用される。デジタル画像解析と組み合わせることで、この方法はタンパク質およびタンパク質修飾の豊富さを確実に分析することができます2.ウェスタンブロットは日常的に行われますが、時間と労力を要する方法です。膜を有する抗体の長いインキュベーションが必要です。ここでは、感度を犠牲にすることなくこの制限を克服するインキュベーション法の改変について述べる。
膜のインキュベーション中、抗体は溶液中に浮遊し、抗原は膜上に固定化される。その高い親和性のために、抗体が抗原に結合する速度は、バルク溶液から膜への抗体の拡散よりも速い。これにより、低濃度の「枯渇層」が作成されます(図1)。この技術では、より遠い抗体が受動的拡散によって膜に到達するまでに数時間かかることがあります。この効果は、大量輸送制限(MTL)3と呼ばれます。抗体含有溶液の繰り返しの排水と補充は、枯渇層を破壊し、MTL4を克服する可能性が提案されている。ここでは、従来のウェスタンブロッティングプロトコルにおけるMTLの効果を減少させ、必要な潜伏期間を顕著に短縮するために、この循環ドレインおよび補充(CDR)概念を実装する独自の技術を考案しました。
短時間で検出感度を維持するために、抗原抗体反応を加速する免疫反応増強技術を用いて、シグナル対ノイズ比5を向上させた。市販の免疫反応増強剤(IRE)の多くは2成分から構成されている(溶液1および2、表の材料表参照)。IREの独自の組成または作用機序は明らかにされていないが、固相結合アッセイにおいてIREが抗原と抗体との間の解離定数を低下させることを以前に発見したが、少なくとも部分的には、IRE6の増強効果を担う親和性の増加を示す。CDRとIREの組み合わせは、感度を犠牲にすることなく、手順全体の時間を短縮する超高速ウェスタンブロッティングプロトコルを生み出します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ウェスタンブロットは、約40年前に開発された特定のタンパク質を検出するために広く使用されている分析技術です7,8.それ以来、技術は進化し続けており、その後の技術革新により、技術2、9、10、11、12、13の感度、速度?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所の国立心臓・肺・血液研究所の壁内研究部門によって支援されました。S.H.は日本の官民パートナーシップ学生留学プログラムの支援を受け、H.N.とK.Y.は武勇とVドラッグ海外研修奨学金を受けた。
Materials
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap | Falcon | 352059 | |
| Apollo Transparency Film for Laser Printers | N/A | N/A | Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection. |
| Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution | TOYOBO | NKB-101 | |
| CARNATION Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | N/A | |
| ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position. |
| Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| Mouse anti-ß actin antibody | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer for fluorescent detection |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear. |
| Parafilm Sealing Film | Bemis | Parafilm M PM996 | semi-transparent flexible film |
| Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube | N/A | N/A | Prepared in a machine shop |
| Rabbit anti-6X His tag antibody | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
Riferimenti
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