In Vivo CRISPR/Cas9 Screening for samtidig å evaluere genfunksjon i musehud og munnhule
Summary
Her beskriver vi en rask og direkte in vivo CRISPR/Cas9 screeningmetodikk ved hjelp av ultralydstyrte i utero embryonale lentivirale injeksjoner for samtidig å vurdere funksjoner av flere gener i huden og munnhulen til immunokokkmus.
Abstract
Genmodifiserte musemodeller (GEMM) har vært medvirkende til å vurdere genfunksjon, modellere menneskelige sykdommer og fungere som preklinisk modell for å vurdere terapeutiske veier. Men deres tids-, arbeids- og kostnadsintensive natur begrenser deres nytte for systematisk analyse av genfunksjon. Nylige fremskritt innen genomredigeringsteknologier overvinner disse begrensningene og tillater rask generering av spesifikke genperturbasjoner direkte innenfor spesifikke museorganer på en multiplekset og rask måte. Her beskriver vi en CRISPR/Cas9-basert metode (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) for å generere tusenvis av gen-knock-out kloner i epitelet i huden og munnhulen til mus, og gi en protokoll som beskriver trinnene som er nødvendige for å utføre en direkte in vivo CRISPR-skjerm for tumordempergener. Denne tilnærmingen kan brukes på andre organer eller andre CRISPR/Cas9-teknologier som CRISPR-aktivering eller CRISPR-inaktivering for å studere geners biologiske funksjon under vevs homeostase eller i ulike sykdomsmiljøer.
Introduction
En av utfordringene for kreftforskning i postgenomisk tid er å utvinne den enorme mengden genomdata for årsakssammenhenger og identifisere noder i gennettverket som kan målrettes terapeutisk. Mens bioinformatiske analyser har bidratt enormt til disse målene, er etablering av effektive in vitro- og in vivo-modeller en forutsetning for å tyde kompleksiteten i biologiske systemer og sykdomstilstander og for å muliggjøre narkotikautvikling. Mens konvensjonelle transgene musemodeller har blitt brukt mye til in vivo kreftgenetikkstudier, har deres kostnads-, tids- og arbeidsintensive natur i stor grad forbudt systematisk analyse av hundrevis av putative kreftgener unraveled av moderne genomikk. For å overvinne denne flaskehalsen kombinerte vi en tidligere etablert ultralydstyrt i utero injeksjonsmetodikk1,2 med en CRISPR / Cas9 (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) genredigeringsteknologi3 for samtidig å indusere og studere tap av funksjonsmutasjoner av hundrevis av gener i huden og munnhulen til en enkelt mus.
Metodikken som er beskrevet her, benytter ultralydstyrte injeksjoner av konstruerte lentivirus i fosterhulen til levende museembryoer på embryonal dag E9.5. Den lentivirale lasten som inneholder CRISPR/Cas9-komponenter, transduserer det enkeltlags overflateektoddermet, som senere gir opphav til epitelet i huden og munnhulen. Huden består av en ytre epidermis, etterfulgt av kjellermembran og dermis. Epidermis er et stratifisert epitel som består av et indre, basalt lag, som opprettholder kontakt med kjellermembranen og har proliferativ og stamcellekapasitet. Basallaget gir opphav til de differensierte lagene ovenfor, for eksempel spinøse, granulære og stratum corneum lag2,4. Lineage tracing studier viser at denne direkte in vivo CRISPR / Cas9 metoden genetisk manipulerer vev-bosatte stamceller i basallaget som vedvarer gjennom hele voksen alder. Siden lentivirus kan titreres for å transdusere E9,5 overflateeklatmen ved klonisk tetthet, kan denne metoden brukes til å generere mosaikkmus som huser tusenvis av diskrete gen-knock-out kloner. Neste generasjons sekvensering kan deretter brukes til å analysere effekten av CRISPR / Cas9-mediert genablasjon i disse klonene på en multiplekset måte5.
Vi brukte nylig denne metoden for å vurdere funksjonen til 484 gener som viser tilbakevendende mutasjoner i humant hode og nakke Squamous Cell Carcinoma (HNSCC)5. HNSCC er en ødeleggende kreft med en høy dødelighet på 40-50% og det er den sjette vanligste kreften over hele verden6. HNSCC oppstår i slimhinner i øvre luftvei eller munnhule og er forbundet med tobakk og alkoholforbruk eller human papillomavirus (HPV) infeksjon. Kutan Squamous Cell Carcinoma (SCC) er hudsvulster og representerer den nest vanligste kreftformen hos mennesker7. Kutan SCC og HNSCC er histologisk og molekylært svært like, med en høy prosentandel tilfeller som viser endring i TP53, PIK3CA, NOTCH1 og HRAS8. Mens det bare er en håndfull gener mutert ved høy frekvens, er det hundrevis av gener som finnes mutert ved lav frekvens (< 5%), et fenomen som ofte kalles langhalefordelingen. Ettersom flertallet av langhalegenene mangler biologisk eller klinisk validering, brukte vi denne in vivo CRISPR-screeningteknologien til å modellere funksjonstap av disse genene hos tumorutsatte mus med sensibiliserende mutasjoner i p53, Pik3ca eller Hras og identifiserte flere nye tumordempergener som samarbeider med p53, Pik3ca eller Hras for å utløse tumorutvikling5.
Her beskriver vi en detaljert protokoll for å generere multipleksede sgRNA lentivirale CRISPR sgRNA-biblioteker og utføre CRISPR / Cas9 gen knock-out skjermer i museoverflaten ectoderm. Vær oppmerksom på at denne metoden kan tilpasses for å innlemme andre genmanipuleringsteknologier som CRISPR-aktivering (CRISPRa) og CRISPR-inaktivering (CRISPRi) eller modifiseres for å målrette mot andre organsystemer i mus for å studere genfunksjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR/Cas9 genomredigering har blitt mye brukt i in vitro- og in vivo-studier for å undersøke genfunksjoner og cellulære prosesser. De fleste in vivo-studier bruker CRISPR/Cas9 genredigerte celler podet inn i en dyremodell (allograft eller xenograft). Selv om dette er et kraftig verktøy for å studere kreftgenetikk og cellulære funksjoner, mangler det fortsatt det innfødte vevsmikromiljøet og kan fremkalle sår og / eller immunresponser.
For å overvinne disse utfordringene har flere g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av et prosjektstipend fra Canadian Institute of Health Research (CIHR 365252), Krembil Foundation og Ontario Research Fund Research Excellence Round 8 (RE08-065). Sampath Kumar Loganathan er mottaker av et kanadisk kreftforeningsstipend (BC-F-16#31919).
Materials
| 0.45 micron filter | Sigma | S2HVU02RE | |
| 12k or 92k oligo chip | Customarray Inc. (Genscript) | ||
| 15 cm cell culture plates | Corning | ||
| 293FT | Invitrogen | R70007 | |
| 293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
| Alkaline phosphatase | NEB | M0290L | |
| Amplicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| ATP | NEB | 9804S | |
| BsmBI | NEB | R0580L | |
| Chromic gut suture | Covidien | ||
| Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) | Illumina | ||
| DNA-cleanup kit | Zymo Research | D4008 | |
| DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit | Qiagen | 69506 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 60242-1 | |
| Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High-Speed Centrifuge | Beckman Coulter | MLS-50 | |
| LB Agar | Wisent Technologies | 800-011-LG | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Mini-prep plasmid Kit | Frogga Bio | PDH300 | |
| Mouse oxygen anaesthesia system | Visual Sonics | ||
| Nanoject II micromanipulator | Drummond | ||
| NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) | NEB | R0580L | |
| Needle sharpener | Sutter Instrument | BV-10 | |
| Oligo cleanup kit | Zymo research | D4060 | |
| PAGE purified illumina sequencing primer | IDT DNA | ||
| PEI (polyethyleneimine) | Sigma | 408727-100ML | |
| Permoplast modeling clay | |||
| Petridish with central opening | Visual Sonics | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| Q5 Polymerase 2x Master mix | NEB | M0494L | |
| Qubit Fluorometric Quantification | Invitrogen | Q33327 | |
| Semicircular Silicone plug | Corning | ||
| Silicone membrane | Visual Sonics | ||
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| Ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Vevo2000 ultrasound system | Visual Sonics |
References
- Beronja, S., Fuchs, E. RNAi-mediated gene function analysis in skin. Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).
- Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
- Beronja, S., et al. RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth. Nature. 501, 185-190 (2013).
- Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367, 1264-1269 (2020).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).
- Green, A. C., Olsen, C. M. Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review. British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).
- Campbell, J. D., et al. pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas. Cell Reports. 23, 194-212 (2018).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11, 783-784 (2014).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
- Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343, 309-313 (2014).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biology. 15, 554 (2014).
- Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics. Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).
- Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).
- Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).
- Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Science Advances. 4, 5508 (2018).
- Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (151), e59780 (2019).
- Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163, 1515-1526 (2015).
