In Vivo CRISPR/Cas9 Screening zur gleichzeitigen Bewertung der Genfunktion in Maushaut und Oralhöhle
Summary
Hier beschreiben wir eine schnelle und direkte in vivo CRISPR/Cas9 Screening-Methodik mit Ultraschall-geführten in utero embryonalen lentiviralen Injektionen, um gleichzeitig die Funktionen mehrerer Gene in der Haut und Mundhöhle von immunkompetenten Mäusen zu bewerten.
Abstract
Genetisch veränderte Mausmodelle (GEMM) waren maßgeblich an der Beurteilung der Genfunktion, der Modellierung menschlicher Krankheiten und als präklinisches Modell zur Bewertung therapeutischer Wege beteiligt. Ihre zeit-, arbeits- und kostenintensive Natur schränkt jedoch ihren Nutzen für die systematische Analyse der Genfunktion ein. Jüngste Fortschritte in den Genom-Editing-Technologien überwinden diese Einschränkungen und ermöglichen die schnelle Generierung spezifischer Genstörungen direkt in bestimmten Mausorganen in multiplexierter und schneller Weise. Hier beschreiben wir eine CRISPR/Cas9-basierte Methode (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), um Tausende von Gen-Knock-out-Klonen innerhalb des Epithels der Haut und der Mundhöhle von Mäusen zu erzeugen, und liefern ein Protokoll, das die Schritte beschreibt, die notwendig sind, um einen direkten in vivo CRISPR-Bildschirm für Tumorsuppressorgene durchzuführen. Dieser Ansatz kann auf andere Organe oder andere CRISPR/Cas9-Technologien wie CRISPR-Aktivierung oder CRISPR-Inaktivierung angewendet werden, um die biologische Funktion von Genen während der Gewebehomöostase oder in verschiedenen Krankheitssituationen zu untersuchen.
Introduction
Eine der Herausforderungen für die Krebsforschung in der postgenomischen Ära besteht darin, die riesige Menge an Genomdaten für kausale Genmutationen zu abbauen und Knoten im Gennetzwerk zu identifizieren, die therapeutisch anvisiert werden können. Während bioinformatische Analysen enorm dazu beigetragen haben, diese Ziele zu erreichen, ist die Etablierung effizienter In-vitro- und In-vivo-Modelle eine Voraussetzung, um die Komplexität biologischer Systeme und Krankheitszustände zu entschlüsseln und die Entwicklung von Arzneimitteln zu ermöglichen. Während herkömmliche transgene Mausmodelle ausgiebig für in vivo Krebsgenetik-Studien verwendet wurden, hat ihre kosten-, zeit- und arbeitsintensive Natur die systematische Analyse der Hunderte von vermeintlichen Krebsgenen, die durch die moderne Genomik entwirrt wurden, weitgehend verboten. Um diesen Engpass zu überwinden, kombinierten wir eine zuvor etablierte Ultraschall-geführte in der Utero-Injektionsmethodik1,2 mit einer CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) Gen-Editing-Technologie3, um gleichzeitig Funktionsverlustmutationen von Hunderten von Genen in Haut und Mundhöhle einer einzelnen Maus zu induzieren und zu untersuchen.
Die hier beschriebene Methodik nutzt Ultraschall-geführte Injektionen von technisch hergestellten Lentiviren in die Fruchtwasserhöhle lebender Mausembryonen am Embryonaltag E9.5. Die lentivirale Ladung, die CRISPR/Cas9-Komponenten enthält, transduciert das einschichtige Oberflächenektoderm, das später das Epithel der Haut und der Mundhöhle hervorruft. Die Haut besteht aus einer äußeren Epidermis, gefolgt von Kellermembran und Dermis. Epidermis ist ein geschichtetes Epithel, das aus einer inneren Basalschicht besteht, die den Kontakt mit der Kellermembran aufrechterhält und eine proliferative und Stammzellkapazität hat. Die Basalschicht führt zu den differenzierten Schichten oben wie z.B. stachelförmigen, körnigen und stratum corneum Schichten2,4. Lineage-Tracing-Studien zeigen, dass diese direkte in vivo CRISPR/Cas9-Methode geweberesidente Stammzellen innerhalb der Basalschicht genetisch manipuliert, die während des gesamten Erwachsenenalters fortbestehen. Da lentivirus titriert werden kann, um das E9.5-Oberflächenektoderm bei klonaler Dichte zu transduzieren, kann diese Methode verwendet werden, um Mosaikmäuse zu erzeugen, die Tausende von diskreten Gen-Knock-out-Klonen beherbergen. Die Sequenzierung der nächsten Generation kann dann verwendet werden, um die Wirkung der CRISPR/Cas9-vermittelten Genablation innerhalb dieser Klone in multiplexisierter Weise zu analysieren5.
Wir haben diese Methode vor kurzem verwendet, um die Funktion von 484 Genen zu bewerten, die wiederkehrende Mutationen im menschlichen Kopf- und Hals-Squamous-Zell-Karzinom (HNSCC)5zeigen. HNSCC ist eine verheerende Krebserkrankung mit einer hohen Sterblichkeitsrate von 40–50% und sie ist die6. häufigste Krebsart weltweit6. HNSCC entstehen in Schleimhautauskleidungen der oberen Atemwege oder Mundhöhle und sind mit Tabak- und Alkoholkonsum oder einer Infektion mit dem humanen Papillomavirus (HPV) in Verbindung gebracht. Kutanes Plattenepithelkarzinom (SCC) sind Hauttumoren und stellen die zweithäufigste Krebsart beim Menschendar 7. Kutane SCC und HNSCC sind histologisch und molekular sehr ähnlich, mit einem hohen Prozentsatz von Fällen, die Veränderungen in TP53, PIK3CA, NOTCH1 und HRAS8aufweisen. Während es nur eine Handvoll Gene gibt, die mit hoher Frequenz mutiert sind, gibt es Hunderte von Genen, die mit niedriger Frequenz mutiert sind (< 5%), ein Phänomen, das gemeinhin als Long-tail-Verteilung bezeichnet wird. Da die Mehrheit der Longtail-Gene keine biologische oder klinische Validierung haben, haben wir diese in vivo CRISPR-Screening-Technologie verwendet, um Funktionsverlust dieser Gene bei tumorgefährdeten Mäusen mit sensibilisierenden Mutationen in p53, Pik3ca oder Hras zu modellieren und identifizierten mehrere neuartige Tumorsuppressorgene, die mit p53, Pik3ca oder Hras zusammenarbeiten, um die Tumorentwicklung auszulösen5.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Generierung von multiplexed sgRNA lentiviral CRISPR sgRNA Bibliotheken und führen CRISPR/Cas9 Gen Knock-out-Screens in der MausOberfläche Ektoderm. Bemerkenswert ist, dass diese Methode angepasst werden kann, um andere Genmanipulationstechnologien wie CRISPR-Aktivierung (CRISPRa) und CRISPR-Inaktivierung (CRISPRi) zu integrieren oder modifiziert werden, um andere Organsysteme in der Maus zu zielen, um Genfunktionen zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die CRISPR/Cas9-Genombearbeitung wurde in In-vitro- und In-vivo-Studien häufig zur Untersuchung von Genfunktionen und zellulären Prozessen eingesetzt. Die meisten In-vivo-Studien verwenden CRISPR/Cas9-Gen-editierte Zellen, die in ein Tiermodell (Allograft oder Xenograft) eingepfropft wurden. Während dies ein leistungsfähiges Werkzeug ist, um Krebsgenetik und zelluläre Funktionen zu studieren, fehlt es immer noch an der einheimischen Gewebemikroumgebung und könnte Wund- und/oder Immunreaktionen hervorrufen.
<p c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Projektstipendium des Canadian Institute of Health Research (CIHR 365252), der Krembil Foundation und des Ontario Research Fund Research Excellence Round 8 (RE08-065) unterstützt. Sampath Kumar Loganathan ist Träger eines Stipendiums der Canadian Cancer Society (BC-F-16-31919).
Materials
| 0.45 micron filter | Sigma | S2HVU02RE | |
| 12k or 92k oligo chip | Customarray Inc. (Genscript) | ||
| 15 cm cell culture plates | Corning | ||
| 293FT | Invitrogen | R70007 | |
| 293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
| Alkaline phosphatase | NEB | M0290L | |
| Amplicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| ATP | NEB | 9804S | |
| BsmBI | NEB | R0580L | |
| Chromic gut suture | Covidien | ||
| Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) | Illumina | ||
| DNA-cleanup kit | Zymo Research | D4008 | |
| DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit | Qiagen | 69506 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 60242-1 | |
| Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High-Speed Centrifuge | Beckman Coulter | MLS-50 | |
| LB Agar | Wisent Technologies | 800-011-LG | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Mini-prep plasmid Kit | Frogga Bio | PDH300 | |
| Mouse oxygen anaesthesia system | Visual Sonics | ||
| Nanoject II micromanipulator | Drummond | ||
| NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) | NEB | R0580L | |
| Needle sharpener | Sutter Instrument | BV-10 | |
| Oligo cleanup kit | Zymo research | D4060 | |
| PAGE purified illumina sequencing primer | IDT DNA | ||
| PEI (polyethyleneimine) | Sigma | 408727-100ML | |
| Permoplast modeling clay | |||
| Petridish with central opening | Visual Sonics | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| Q5 Polymerase 2x Master mix | NEB | M0494L | |
| Qubit Fluorometric Quantification | Invitrogen | Q33327 | |
| Semicircular Silicone plug | Corning | ||
| Silicone membrane | Visual Sonics | ||
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| Ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Vevo2000 ultrasound system | Visual Sonics |
References
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