In Vitro Evaluatie van Oncogene Transformatie in Human Mammary Epithelial Cells
Summary
Dit protocol biedt experimentele in vitro tools om de transformatie van menselijke borstcellen te evalueren. Gedetailleerde stappen naar de follow-up cel proliferatie tarief, verankering-onafhankelijke groeicapaciteit, en de distributie van cellijnen in 3D-culturen met kelder membraan matrix worden beschreven.
Abstract
Tumorigenese is een proces in meerdere stappen waarin cellen mogelijkheden verwerven die hun groei, overleving en verspreiding onder vijandige omstandigheden mogelijk maken. Verschillende tests zijn gericht op het identificeren en kwantificeren van deze kenmerken van kankercellen; echter, ze richten zich vaak op een enkel aspect van cellulaire transformatie en, in feite, meerdere tests nodig zijn voor hun juiste karakterisering. Het doel van dit werk is om onderzoekers te voorzien van een reeks instrumenten om cellulaire transformatie in vitro vanuit een breed perspectief te beoordelen, waardoor het mogelijk is om goede conclusies te trekken.
Een aanhoudende proliferative signaling activatie is het belangrijkste kenmerk van tumorweefsels en kan gemakkelijk worden gecontroleerd onder in vitro omstandigheden door het berekenen van het aantal populatieverdubbelingen bereikt in de tijd. Bovendien maakt de groei van cellen in 3D-culturen hun interactie met omringende cellen mogelijk, die lijkt op wat er in vivo gebeurt. Dit maakt de evaluatie van cellulaire aggregatie mogelijk en, samen met immunofluorescente etikettering van onderscheidende cellulaire markers, om informatie te verkrijgen over een ander relevant kenmerk van tumorale transformatie: het verlies van een goede organisatie. Een ander opmerkelijk kenmerk van getransformeerde cellen is hun vermogen om te groeien zonder gehechtheid aan andere cellen en aan de extracellulaire matrix, die kan worden geëvalueerd met de verankeringstest.
Gedetailleerde experimentele procedures om de groei van cellen te evalueren, om immunofluorescente etikettering van cellijnmarkers in 3D-culturen uit te voeren en om verankering-onafhankelijke celgroei in zachte agar te testen, worden verstrekt. Deze methoden zijn geoptimaliseerd voor borst primary epitheelcellen (BPEC) vanwege de relevantie ervan bij borstkanker; Na enkele aanpassingen kunnen echter procedures worden toegepast op andere celtypen.
Introduction
Meerdere opeenvolgende gebeurtenissen zijn vereist voor de ontwikkeling van het neoplasma. In 2011 beschreven Hanahan en Weinberg 10 vermogens die de groei, overleving en verspreiding van getransformeerde cellen mogelijk maken: de zogenaamde “Hallmarks of Cancer”1. De hier beschreven methodologie stelt drie verschillende instrumenten samen om in vitro cellulaire transformatie te evalueren door zich te concentreren op enkele onderscheidende kenmerken van de tumorcellen. Deze technieken beoordelen de celproliferatiesnelheid, het gedrag van cellen wanneer gekweekt in 3D en hun vermogen om kolonies met ankerveronafhankelijkheid te vormen.
Celmodellen zijn cruciaal om hypothese in vitro te testen. Er zijn verschillende benaderingen ontwikkeld om experimentele modellen van cellulaire transformatie te genereren voor de studie van kanker2,3,4. Aangezien borstkanker is de meest voorkomende kanker onder vrouwen wereldwijd en is verantwoordelijk voor ongeveer 15% van de sterfgevallen door kanker onder vrouwen5, het verstrekken van geschikte cellulaire modellen van borstepitheelcellen is van het grootste belang voor verder onderzoek. In dit artikel hebben we het potentieel van drie technieken geïllustreerd om cellulaire transformatie te evalueren met behulp van een experimenteel model van borstwerkelijke epitheelcellen (BPC’s) transformatie aanvankelijk beschreven door Ince en collega’s in 20076 en later geïmplementeerd in ons laboratorium7. Dit experimentele model is gebaseerd op de sequentiële wijziging van drie gerichte genen (SV40 Large T en kleine t-antigenen hierin aangeduid als Ttag, hTERTen HRAS) op het genoom van niet-getransformeerde BBC’s. Bovendien, de methode die wordt gebruikt voor BPECs afleiding bevordert het behoud van borstepileliale cellen met luminale of myoepithelial markers, wat resulteert in een heterogene celcultuur die een aantal van de borstklier fysiologische eigenschappen behoudt.
In de borstklier bevinden zich borstlichaamcellen, die verantwoordelijk zijn voor de melkproductie, in de buurt van het lumen, terwijl myoepitheliale cellen rond luminale cellen worden verwijderd en zorgen voor samentrekkingsbewegingen die de melk naar de tepel leiden. Het verlies van de juiste organisatie tussen deze cellijnen is een kenmerk van tumorale transformatie8 die in vitro kan worden beoordeeld na immunofluorescente detectie van onderscheidende afstammingmarkers in 3D-celculturen. Een ander belangrijk kenmerk van tumorcellen is hun vermogen om te groeien zonder gehechtheid aan andere cellen en aan de extracellulaire matrix1. Wanneer gezonde cellen worden gedwongen om te groeien in suspensie, mechanismen zoals anoikis \u2012 een soort celdood geïnduceerd in reactie op detachement van de extracellulaire matrix \u2012 worden geactiveerd9. De ontduiking van celdood is een van de kenmerkende kenmerken van kanker en dus zijn getransformeerde cellen in staat om anoikis te activeren en op een ankeronafhankelijke manier te overleven. Deze capaciteit kan in vitro worden geëvalueerd met de verankering-onafhankelijke test met behulp van zachte agar. Bovendien is een inherent kenmerk van tumorweefsels hun aanhoudende proliferative signaleringscapaciteit, die gemakkelijk kan worden gecontroleerd onder in vitro omstandigheden door de toename van het aantal cellen langs de tijd te meten, niet alleen in suspensietesten, maar ook door het toezicht op de groeisnelheid van monolaagaanhangende culturen.
Ondanks het beste model om tumorigenic potentieel te testen is de inenting van tumorcellen in murinemodellen en evaluatie van tumorontwikkeling in situ, is het belangrijk om het aantal dieren dat in experimentele procedures wordt aangewend zo veel mogelijk te minimaliseren. Daarom is het hebben van geschikte tests om transformatie in vitro te beoordelen een topprioriteit. Hier bieden we een reeks tools om het tumorigenic potentieel van gedeeltelijk en volledig getransformeerde borsteptropelial cellen te evalueren die gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd in de meeste laboratoria die werken met cellulaire transformatiemodellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De experimentele protocollen beschreven in dit document bieden nuttige instrumenten om de oncogene transformatie van in vitro gekweekte cellen te beoordelen. Elke techniek evalueert specifieke aspecten van het transformatieproces, en daarom moet bijzondere aandacht worden besteed aan het trekken van conclusies uit een enkele analyse. Groeicurven opbouw is een aanpak die informatie die al beschikbaar is bij het kweken van cellen voor andere doeleinden vereist. Dat maakt deze techniek goedkoper en gemakkelijker toe te pass…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het AG-laboratorium wordt gefinancierd door de Spaanse Raad voor nucleaire veiligheid. T.A. en A.G. zijn lid van een door Generalitat de Catalunya erkende onderzoeksgroep (2017-SGR-503). MT heeft een contract gefinancierd door de Wetenschappelijke Stichting Asociación Española Contra el Cáncer [AECC-INVES19022TERR]. G.F. contract wordt gefinancierd door een subsidie van Cellex Foundation.
Materials
| 1 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91001 | |
| 1.5 ml Eppendorfs | Thermo Fisher Scientific | 3451 | Dark eppendorfs are preferred for MTT long-term storage |
| 10 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-0010 | |
| 100 ml glass bottle | With cap, autoclavable | ||
| 1000 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | LAB1000ULFNL | |
| 1000 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-1000 | |
| 15 ml Conical tubes | VWR | 525-0400 | |
| 2 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91002 | |
| 200 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | FTR200-96 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91005 | |
| 50 ml Conical Tubes | VWR | 525-0304 | |
| Acetone | PanReac AppliChem | 211007 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Used for anchorage assay |
| Anti-Claudin 4 antibody | Abcam | 15104, RRID:AB_301650 | Working dilution 1:100, host: rabbit |
| Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antibody | Abcam | 9220, RRID:AB_307087 | Working dilution 1:100, host: mouse |
| Anti-mouse Cyanine Cy3 antibody | Jackson ImmunoResearch Inc. | 115-165-146, RRID:AB_2338690 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034, RRID:AB_2576217 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Autoclave | |||
| BioVoxxel Toolbox | RRID:SCR_015825 | ||
| Cell culture 24-well Plate | Labclinics | PLC30024 | Used for 3D cultures in Matrigel. Flat Bottom |
| Cell culture 6-well Plate | Labclinics | PLC30006 | Used for anchorage assay |
| Cell incubator (37 ºC and 5 % CO2) | |||
| Cell Strainers | Fisherbrand | 11587522 | Mesh size: 40 μm |
| CellSense software | Olympus | Used to image acquisition | |
| Centrifuge | |||
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Used to supplement cell culture medium |
| Class II Biological Safety Cabinet | Herasafe | HAEREUS HS12 | |
| Confocal inverted Microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Cover glasses | Witeg Labortechnik GmbH | 4600122 | 22 X 22 mm, thickness 0.13 – 0.17 mm |
| DAPI | 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine | ||
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1810 | Used to inactivate trypsine action |
| Fiji software (ImageJ) | National Institutes of Health | RRID:SCR_002285 | Free download, no license needed |
| Glass Pasteur Pipettes | |||
| Glass slides | Fisherbrand | 11844782 | |
| Goat Serum | Biowest | S2000 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Heat-Resistant Gloves | Used for agar manipulation after autoclave | ||
| Heater bath (37 ºC) | Used to temper solutions prior to cell subculture | ||
| Heater bath (42 ºC) | Used to keep agar warm | ||
| Heating plate | Used for Matrigel dehydration | ||
| Humid chamber | Used for the incubation of antibodies during immunofluorescence | ||
| Ice | Used during Matrigel manipulation | ||
| Ice-box | |||
| Inverted Optic Microscope | Olympus | IX71 | |
| Matrigel Matrix | Becton Dickinson | 354234 | Store at -20 ºC and keep cold when in use. Referred to as basement membrane matrix |
| Methanol | PanReac AppliChem | 131091 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Micropipette | p1000, p200 and p10 | ||
| Microsoft Office Excel | Microsoft | RRID:SCR_016137 | Used to calculate population doubling and to obtain growth rate equation |
| MilliQ water | Referred to as ultrapure water | ||
| Nail Polish | Used to seal samples after mounting | ||
| Parafilm M | Bemis | PM-999 | Used to cover antibody solution during incubation |
| PBS pH 7.4 (w/o calcium & magnesium) | Gibco | 10010-056 | Sterile. Used for cell subculture |
| PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | Dilute in milliQ water. No sterility required. Used for immunofluorescence |
| Pipette Aid | |||
| Primaria T25 flasks | Corning | 353808 | Used for BPEC culture |
| Scepter Automated Cell Counter | Millipore | PHCC20060 | Alternatively, use an haemocytometer |
| Scissors | Used to cut pipette tips and parafilm | ||
| Sterile filters 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | Used to filter MTT solution |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | Store at -20 ºC |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Trypsin-EDTA 10X | Biowest | X0930 | Dilute in PBS to obtain 3X solution |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| WIT-P-NC Culture Medium | Stemgent | 00-0051 | Used for primary BPEC culture |
| WIT-T Culture Medium | Stemgent | 00-0047 | Used for transformed BPEC culture |
Riferimenti
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Stampfer, M. R., Yaswen, P. Culture models of human mammary epithelial cell transformation. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 (2000).
- Schinzel, A. C., Hahn, W. C. Oncogenic transformation and experimental models of human cancer. Frontiers in Bioscience : A Journal and Virtual Library. 13 (13), 71 (2008).
- Balani, S., Nguyen, L. V., Eaves, C. J. Modeling the process of human tumorigenesis. Nature Communications. 8 (1), 15422 (2017).
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Ince, T. A., et al. Transformation of different human breast epithelial cell types leads to distinct tumor phenotypes. Cancer Cell. 12 (2), 160-170 (2007).
- Repullés, J., et al. Radiation-induced malignant transformation of preneoplastic and normal breast primary epithelial cells. Molecular Cancer Research. , 1-13 (2019).
- Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Seminars in Cancer Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Borowicz, S., et al. The soft agar colony formation assay. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Brocher, J. The BioVoxxel Image Processing and Analysis Toolbox. European BioImage Analysis Symposium. 8 (2), 67112 (2015).
- Torquato, S., Truskett, T. M., Debenedetti, P. G. Is random close packing of spheres well defined. Physical Review Letters. 84 (10), 2064-2067 (2000).
- LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Zubeldia-Plazaola, A., et al. Glucocorticoids promote transition of ductal carcinoma in situ to invasive ductal carcinoma by inducing myoepithelial cell apoptosis. Breast Cancer Research. 20 (1), 65 (2018).
