In Vitro evaluering av onkogen transformasjon i humane pattedyr epitelceller
Summary
Denne protokollen gir eksperimentelle in vitro verktøy for å evaluere transformasjonen av menneskelige brystceller. Detaljerte trinn for oppfølging av cellespredningshastighet, forankringsuavhengig vekstkapasitet og distribusjon av cellelinje i 3D-kulturer med kjellermembranmatrise er beskrevet.
Abstract
Tumorigenesis er en flertrinnsprosess der celler får evner som tillater vekst, overlevelse og spredning under fiendtlige forhold. Ulike tester søker å identifisere og kvantifisere disse kjennetegnene på kreftceller; Imidlertid fokuserer de ofte på et enkelt aspekt av cellulær transformasjon, og faktisk kreves flere tester for riktig karakterisering. Formålet med dette arbeidet er å gi forskerne et sett med verktøy for å vurdere cellulær transformasjon in vitro fra et bredt perspektiv, og dermed gjøre det mulig å trekke gode konklusjoner.
En vedvarende proliferativ signalaktivering er det viktigste trekk ved tumorvev og kan lett overvåkes under in vitro forhold ved å beregne antall befolkningsdoblinger oppnådd over tid. Dessuten tillater veksten av celler i 3D-kulturer deres interaksjon med omkringliggende celler, som ligner hva som skjer in vivo. Dette gjør det mulig å evaluering av cellulær aggregering og, sammen med immunofluorescent merking av karakteristiske cellulære markører, å få informasjon om et annet relevant trekk ved tumortransformasjon: tap av riktig organisering. En annen bemerkelsesverdig egenskap ved forvandlede celler er deres evne til å vokse uten tilknytning til andre celler og til den ekstracellulære matrisen, som kan evalueres med forankringsanalysen.
Detaljerte eksperimentelle prosedyrer for å evaluere cellevekst, for å utføre immunofluorescent merking av cellelinjemarkører i 3D-kulturer, og for å teste anchorage-uavhengig cellevekst i myk agar er gitt. Disse metodene er optimalisert for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) på grunn av sin relevans i brystkreft; Prosedyrer kan imidlertid brukes på andre celletyper etter noen justeringer.
Introduction
Flere påfølgende hendelser er nødvendig for neoplasmautvikling. I 2011 beskrev Hanahan og Weinberg 10 evner som muliggjør transformerte cellers vekst, overlevelse og formidling: den såkalte “Hallmarks of Cancer”1. Metodikken som er beskrevet her, utarbeider tre forskjellige verktøy for å evaluere in vitro cellulær transformasjon ved å fokusere på noen av tumorcellenes særegne egenskaper. Disse teknikkene vurderer cellespredningsraten, oppførselen til celler når de dyrkes i 3D og deres evne til å danne kolonier med forankringsuavhengighet.
Cellemodeller er avgjørende for å teste hypotese in vitro. Ulike tilnærminger er utviklet for å generere eksperimentelle modeller av cellulær transformasjon for studiet avkreft 2,3,4. Siden brystkreft er den vanligste kreften blant kvinner over hele verden og er ansvarlig for ca 15% av kreftdødsfall blantkvinner 5, gir egnede cellulære modeller av pattedyr epitelceller er av største betydning for videre undersøkelse. I denne artikkelen har vi illustrert potensialet i tre teknikker for å evaluere cellulær transformasjon ved hjelp av en eksperimentell modell av Breast Primary Epithelial Cells (BPECs) transformasjon opprinnelig beskrevet av Ince og kolleger i 20076 og senere implementert i vårtlaboratorium 7. Denne eksperimentelle modellen er basert på sekvensiell endring av tre målrettede gener (SV40 Large T og små t antigener heri referert til som Ttag, hTERTog HRAS)til genomet av ikke-transformerte BPECer. Videre favoriserer metoden som brukes for BPECs avledning vedlikehold av pattedyr epitelceller med luminal eller myoepithelial markører, noe som resulterer i en heterogen cellekultur som beholder noen av brystkjertelen fysiologiske egenskaper.
I brystkjertelen er luminalpattedyrepitelceller, som er ansvarlige for melkeproduksjon, plassert i nærheten av lumen, mens myoepithelialceller kastes rundt luminalceller og tar vare på sammentrekningsbevegelser som fører melken til brystvorten. Tapet av riktig organisering mellom disse cellelinjene er et trekk ved tumortransformasjon8 som kan vurderes in vitro etter immunofluorescent påvisning av karakteristiske avstamning markører i 3D cellekulturer. En annen viktig egenskap ved tumorceller er deres evne til å vokse uten vedlegg til andre celler og til den ekstracellulærematrisen 1. Når friske celler er tvunget til å vokse i suspensjon, mekanismer som anoikis \u2012 en type celledød indusert som svar på løsrivelse fra den ekstracellulære matrisen \u2012 er aktivert9. Unndragelse av celledød er et av de karakteristiske kjennetegnene på kreft, og dermed er forvandlede celler i stand til å inaktivere anoikier og overleve på en ankeruavhengig måte. Denne kapasiteten kan evalueres in vitro med den forankringsuavhengige analysen ved hjelp av myk agar. Videre er et iboende trekk ved tumorvev deres vedvarende proliferative signalkapasitet, som lett kan overvåkes under in vitro-forhold ved å måle økningen av cellenummer langs tiden, ikke bare i suspensjonsanalyser, men også ved å overvåke veksten av monolayer-tilhengerkulturer.
Til tross for den beste modellen for å teste tumorogent potensial er inokulasjon av tumorceller i murine modeller og evaluering av tumorutvikling in situ, er det viktig å minimere antall dyr som brukes i eksperimentelle prosedyrer så mye som mulig. Derfor, å ha egnede tester for å vurdere transformasjon in vitro er en topp prioritet. Her gir vi et sett med verktøy for å evaluere det tumorogene potensialet til delvis og fullstendig forvandlede brystepitelceller som enkelt kan implementeres i de fleste laboratoriene som fungerer med cellulære transformasjonsmodeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
De eksperimentelle protokollene som er beskrevet i dette papiret gir nyttige verktøy for å vurdere den onkogene transformasjonen av in vitro kultiverte celler. Hver teknikk evaluerer spesifikke aspekter ved transformasjonsprosessen, og dermed må spesiell oppmerksomhet rettes når man trekker konklusjoner fra en enkelt analyse. Vekstkurver oppbygging er en tilnærming som krever informasjon som allerede er tilgjengelig når du culturing celler til andre formål. Det gjør denne teknikken billigere og enklere å bruke i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AG-laboratoriet er finansiert av det spanske atomsikkerhetsrådet. T.A. og A.G. er medlemmer av en forskningsgruppe anerkjent av Generalitat de Catalunya (2017-SGR-503). MT har en kontrakt finansiert av Scientific Foundation Asociación Española Contra el Cáncer [AECC-INVES19022TERR]. G.F. kontrakt er finansiert av et tilskudd fra Cellex Foundation.
Materials
| 1 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91001 | |
| 1.5 ml Eppendorfs | Thermo Fisher Scientific | 3451 | Dark eppendorfs are preferred for MTT long-term storage |
| 10 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-0010 | |
| 100 ml glass bottle | With cap, autoclavable | ||
| 1000 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | LAB1000ULFNL | |
| 1000 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-1000 | |
| 15 ml Conical tubes | VWR | 525-0400 | |
| 2 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91002 | |
| 200 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | FTR200-96 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91005 | |
| 50 ml Conical Tubes | VWR | 525-0304 | |
| Acetone | PanReac AppliChem | 211007 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Used for anchorage assay |
| Anti-Claudin 4 antibody | Abcam | 15104, RRID:AB_301650 | Working dilution 1:100, host: rabbit |
| Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antibody | Abcam | 9220, RRID:AB_307087 | Working dilution 1:100, host: mouse |
| Anti-mouse Cyanine Cy3 antibody | Jackson ImmunoResearch Inc. | 115-165-146, RRID:AB_2338690 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034, RRID:AB_2576217 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Autoclave | |||
| BioVoxxel Toolbox | RRID:SCR_015825 | ||
| Cell culture 24-well Plate | Labclinics | PLC30024 | Used for 3D cultures in Matrigel. Flat Bottom |
| Cell culture 6-well Plate | Labclinics | PLC30006 | Used for anchorage assay |
| Cell incubator (37 ºC and 5 % CO2) | |||
| Cell Strainers | Fisherbrand | 11587522 | Mesh size: 40 μm |
| CellSense software | Olympus | Used to image acquisition | |
| Centrifuge | |||
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Used to supplement cell culture medium |
| Class II Biological Safety Cabinet | Herasafe | HAEREUS HS12 | |
| Confocal inverted Microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Cover glasses | Witeg Labortechnik GmbH | 4600122 | 22 X 22 mm, thickness 0.13 – 0.17 mm |
| DAPI | 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine | ||
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1810 | Used to inactivate trypsine action |
| Fiji software (ImageJ) | National Institutes of Health | RRID:SCR_002285 | Free download, no license needed |
| Glass Pasteur Pipettes | |||
| Glass slides | Fisherbrand | 11844782 | |
| Goat Serum | Biowest | S2000 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Heat-Resistant Gloves | Used for agar manipulation after autoclave | ||
| Heater bath (37 ºC) | Used to temper solutions prior to cell subculture | ||
| Heater bath (42 ºC) | Used to keep agar warm | ||
| Heating plate | Used for Matrigel dehydration | ||
| Humid chamber | Used for the incubation of antibodies during immunofluorescence | ||
| Ice | Used during Matrigel manipulation | ||
| Ice-box | |||
| Inverted Optic Microscope | Olympus | IX71 | |
| Matrigel Matrix | Becton Dickinson | 354234 | Store at -20 ºC and keep cold when in use. Referred to as basement membrane matrix |
| Methanol | PanReac AppliChem | 131091 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Micropipette | p1000, p200 and p10 | ||
| Microsoft Office Excel | Microsoft | RRID:SCR_016137 | Used to calculate population doubling and to obtain growth rate equation |
| MilliQ water | Referred to as ultrapure water | ||
| Nail Polish | Used to seal samples after mounting | ||
| Parafilm M | Bemis | PM-999 | Used to cover antibody solution during incubation |
| PBS pH 7.4 (w/o calcium & magnesium) | Gibco | 10010-056 | Sterile. Used for cell subculture |
| PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | Dilute in milliQ water. No sterility required. Used for immunofluorescence |
| Pipette Aid | |||
| Primaria T25 flasks | Corning | 353808 | Used for BPEC culture |
| Scepter Automated Cell Counter | Millipore | PHCC20060 | Alternatively, use an haemocytometer |
| Scissors | Used to cut pipette tips and parafilm | ||
| Sterile filters 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | Used to filter MTT solution |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | Store at -20 ºC |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Trypsin-EDTA 10X | Biowest | X0930 | Dilute in PBS to obtain 3X solution |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| WIT-P-NC Culture Medium | Stemgent | 00-0051 | Used for primary BPEC culture |
| WIT-T Culture Medium | Stemgent | 00-0047 | Used for transformed BPEC culture |
Riferimenti
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Stampfer, M. R., Yaswen, P. Culture models of human mammary epithelial cell transformation. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 (2000).
- Schinzel, A. C., Hahn, W. C. Oncogenic transformation and experimental models of human cancer. Frontiers in Bioscience : A Journal and Virtual Library. 13 (13), 71 (2008).
- Balani, S., Nguyen, L. V., Eaves, C. J. Modeling the process of human tumorigenesis. Nature Communications. 8 (1), 15422 (2017).
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Ince, T. A., et al. Transformation of different human breast epithelial cell types leads to distinct tumor phenotypes. Cancer Cell. 12 (2), 160-170 (2007).
- Repullés, J., et al. Radiation-induced malignant transformation of preneoplastic and normal breast primary epithelial cells. Molecular Cancer Research. , 1-13 (2019).
- Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Seminars in Cancer Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Borowicz, S., et al. The soft agar colony formation assay. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Brocher, J. The BioVoxxel Image Processing and Analysis Toolbox. European BioImage Analysis Symposium. 8 (2), 67112 (2015).
- Torquato, S., Truskett, T. M., Debenedetti, P. G. Is random close packing of spheres well defined. Physical Review Letters. 84 (10), 2064-2067 (2000).
- LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Zubeldia-Plazaola, A., et al. Glucocorticoids promote transition of ductal carcinoma in situ to invasive ductal carcinoma by inducing myoepithelial cell apoptosis. Breast Cancer Research. 20 (1), 65 (2018).
