In Vitro Utvärdering av Oncogenic Transformation i mänskliga mammary Epitelial celler
Summary
Detta protokoll ger experimentella in vitro-verktyg för att utvärdera omvandlingen av mänskliga bröstceller. Detaljerade steg för att följa upp cell spridningshastighet, anchorage-oberoende tillväxt kapacitet och fördelning av cellen härstamningar i 3D kulturer med källare membran matris beskrivs.
Abstract
Tumorigenesis är en flerstegsprocess där celler förvärva kapacitet som tillåter deras tillväxt, överlevnad, och spridning under fientliga förhållanden. Olika tester försöker identifiera och kvantifiera dessa kännetecken för cancerceller; emellertid, de fokuserar ofta på en enda aspekt av cellulära omvandling och, i själva verket, flera tester krävs för deras korrekt karakterisering. Syftet med detta arbete är att ge forskarna en uppsättning verktyg för att bedöma cellulär transformation in vitro ur ett brett perspektiv och därigenom göra det möjligt att dra sunda slutsatser.
En ihållande proliferative signalering aktivering är den viktigaste funktionen för tumoral vävnader och kan lätt övervakas under in vitro-förhållanden genom att beräkna antalet befolkningen fördubblingar uppnås över tiden. Förutom, tillväxten av celler i 3D-kulturer tillåter deras interaktion med omgivande celler, som liknar vad som sker in vivo. Detta möjliggör utvärdering av cellulära aggregering och, tillsammans med immunofluorescent märkning av särskiljande cellulära markörer, att få information om en annan relevant egenskap av tumoral omvandling: förlusten av korrekt organisation. En annan anmärkningsvärd egenskap hos transformerade celler är deras förmåga att växa utan fastsättning till andra celler och till den extracellulära matrisen, som kan utvärderas med förankringsanalysen.
Detaljerade experimentella förfaranden för att utvärdera celltillväxthastighet, att utföra immunofluorescent märkning av cell härstamning markörer i 3D kulturer, och att testa förankringsoberoende celltillväxt i mjuk agar tillhandahålls. Dessa metoder är optimerade för Breast Primary Epitelial Cells (BPEC) på grund av dess relevans vid bröstcancer; kan dock procedurer tillämpas på andra celltyper efter vissa justeringar.
Introduction
Flera på varandra följande händelser krävs för neoplasm utveckling. År 2011 beskrev Hanahan och Weinberg 10 kapaciteter som möjliggör transformerade cellers tillväxt, överlevnad och spridning: den så kallade “Kontrollstämplar av cancer”1. Den metodik som beskrivs här sammanställer tre olika verktyg för att utvärdera in vitro cellulära omvandling genom att fokusera på några av de tumoral cellernas särskiljande egenskaper. Dessa tekniker bedömer cellproliferationshastigheten, cellernas beteende när de odlas i 3D och deras förmåga att bilda kolonier med förankringsavhängighet.
Cellmodeller är avgörande för att testa hypotes in vitro. Olika tillvägagångssätt har utvecklats för att generera experimentella modeller av cellulär omvandling för studiet av cancer2,3,4. Eftersom bröstcancer är den vanligaste cancerformen bland kvinnor världen över och ansvarar för cirka 15% av dödsfall i cancer bland kvinnor5, att tillhandahålla lämpliga cellulära modeller av bröst epitelceller är av yttersta vikt för vidare utredning. I den här artikeln har vi illustrerat potentialen i tre tekniker för att utvärdera cellulär omvandling med hjälp av en experimentell modell av Breast Primary Epitelial Cells (BPECs) omvandling som ursprungligen beskrevs av Ince och kollegor i 20076 och senare genomförs i vårt laboratorium7. Denna experimentella modell bygger på sekventiell förändring av tre riktade gener (SV40 Large T och små t antigener häri benämns Ttag, hTERT, och HRAS) till arvsmassan hos icke-transformerade BPECs. Dessutom gynnar den metod som används för BPECs härledning underhåll av bröst epitelceller med luminal eller myoepithelial markörer, vilket resulterar i en heterogen cellkultur som behåller några av bröstkörteln fysiologiska drag.
I bröstkörteln ligger luminal bröstepitelceller, som ansvarar för mjölkproduktionen, nära lumen, medan myoepithelialceller avyttras runt luminala celler och tar hand om sammandragningsrörelser som leder mjölken till bröstvårtan. Förlusten av korrekt organisation mellan dessa cell härstamningar är en funktion av tumoral omvandling8 som kan bedömas in vitro efter immunofluorescent upptäckt av särskiljande härstamning markörer i 3D cellkulturer. En annan stor egenskap hos tumörceller är deras förmåga att växa utan fastsättning till andra celler och till den extracelluläramatrisen 1. När friska celler tvingas växa i suspension, mekanismer såsom anoikis \u2012 en typ av celldöd inducerad som svar på lossnar från extracellulära matris \u2012 aktiveras9. Undandragandet av celldöd är ett av de utmärkande kännetecknen för cancer och därmed är transformerade celler kapabla att inaktivera anoikis och överleva på ett ankare-oberoende sätt. Denna kapacitet kan utvärderas in vitro med den förankringsoberoende analysen med hjälp av mjuk agar. Vidare är en inneboende egenskap hos tumoral vävnader deras ihållande proliferative signalering kapacitet, som lätt kan övervakas under in vitro-förhållanden genom att mäta ökningen av cell antal längs tid, inte bara i suspension analyser utan också genom att övervaka tillväxttakten för monolayer anhängare kulturer.
Trots den bästa modellen för att testa tumorigenic potential är inokulering av tumoral celler i murine modeller och utvärdering av tumörutveckling in situ, är det viktigt att minimera antalet djur som används i experimentella förfaranden så mycket som möjligt. Därför är det högsta prioritet att ha lämpliga tester för att bedöma omvandling in vitro. Här tillhandahåller vi en uppsättning verktyg för att utvärdera den tumorigenic potentialen av delvis och helt omvandlade bröst epitelceller som lätt kan genomföras i de flesta av de laboratorier som arbetar med cellulära omvandling modeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
De experimentella protokoll som beskrivs i detta dokument tillhandahåller användbara verktyg för att bedöma den onkogena omvandlingen av in vitro-odlade celler. Varje teknik utvärderar specifika aspekter av omvandlingsprocessen, och därmed måste särskild uppmärksamhet ägnas när man drar slutsatser från en enda analys. Tillväxtkurvor uppbyggnad är ett tillvägagångssätt som kräver information som redan finns tillgänglig när odlingsceller för andra ändamål. Det gör denna teknik billigare och lättare…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AG-laboratoriet finansieras av det spanska kärnsäkerhetsrådet. T.A. och A.G. är medlemmar i en forskargrupp som är erkänd av Generalitat de Catalunya (2017-SGR-503). MT innehar ett kontrakt finansierat av vetenskapliga stiftelsen Asociación Española Contra el Cáncer [AECC-INVES19022TERR]. G.F. kontrakt finansieras genom ett bidrag från Cellex Foundation.
Materials
| 1 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91001 | |
| 1.5 ml Eppendorfs | Thermo Fisher Scientific | 3451 | Dark eppendorfs are preferred for MTT long-term storage |
| 10 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-0010 | |
| 100 ml glass bottle | With cap, autoclavable | ||
| 1000 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | LAB1000ULFNL | |
| 1000 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-1000 | |
| 15 ml Conical tubes | VWR | 525-0400 | |
| 2 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91002 | |
| 200 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | FTR200-96 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91005 | |
| 50 ml Conical Tubes | VWR | 525-0304 | |
| Acetone | PanReac AppliChem | 211007 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Used for anchorage assay |
| Anti-Claudin 4 antibody | Abcam | 15104, RRID:AB_301650 | Working dilution 1:100, host: rabbit |
| Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antibody | Abcam | 9220, RRID:AB_307087 | Working dilution 1:100, host: mouse |
| Anti-mouse Cyanine Cy3 antibody | Jackson ImmunoResearch Inc. | 115-165-146, RRID:AB_2338690 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034, RRID:AB_2576217 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Autoclave | |||
| BioVoxxel Toolbox | RRID:SCR_015825 | ||
| Cell culture 24-well Plate | Labclinics | PLC30024 | Used for 3D cultures in Matrigel. Flat Bottom |
| Cell culture 6-well Plate | Labclinics | PLC30006 | Used for anchorage assay |
| Cell incubator (37 ºC and 5 % CO2) | |||
| Cell Strainers | Fisherbrand | 11587522 | Mesh size: 40 μm |
| CellSense software | Olympus | Used to image acquisition | |
| Centrifuge | |||
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Used to supplement cell culture medium |
| Class II Biological Safety Cabinet | Herasafe | HAEREUS HS12 | |
| Confocal inverted Microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Cover glasses | Witeg Labortechnik GmbH | 4600122 | 22 X 22 mm, thickness 0.13 – 0.17 mm |
| DAPI | 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine | ||
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1810 | Used to inactivate trypsine action |
| Fiji software (ImageJ) | National Institutes of Health | RRID:SCR_002285 | Free download, no license needed |
| Glass Pasteur Pipettes | |||
| Glass slides | Fisherbrand | 11844782 | |
| Goat Serum | Biowest | S2000 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Heat-Resistant Gloves | Used for agar manipulation after autoclave | ||
| Heater bath (37 ºC) | Used to temper solutions prior to cell subculture | ||
| Heater bath (42 ºC) | Used to keep agar warm | ||
| Heating plate | Used for Matrigel dehydration | ||
| Humid chamber | Used for the incubation of antibodies during immunofluorescence | ||
| Ice | Used during Matrigel manipulation | ||
| Ice-box | |||
| Inverted Optic Microscope | Olympus | IX71 | |
| Matrigel Matrix | Becton Dickinson | 354234 | Store at -20 ºC and keep cold when in use. Referred to as basement membrane matrix |
| Methanol | PanReac AppliChem | 131091 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Micropipette | p1000, p200 and p10 | ||
| Microsoft Office Excel | Microsoft | RRID:SCR_016137 | Used to calculate population doubling and to obtain growth rate equation |
| MilliQ water | Referred to as ultrapure water | ||
| Nail Polish | Used to seal samples after mounting | ||
| Parafilm M | Bemis | PM-999 | Used to cover antibody solution during incubation |
| PBS pH 7.4 (w/o calcium & magnesium) | Gibco | 10010-056 | Sterile. Used for cell subculture |
| PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | Dilute in milliQ water. No sterility required. Used for immunofluorescence |
| Pipette Aid | |||
| Primaria T25 flasks | Corning | 353808 | Used for BPEC culture |
| Scepter Automated Cell Counter | Millipore | PHCC20060 | Alternatively, use an haemocytometer |
| Scissors | Used to cut pipette tips and parafilm | ||
| Sterile filters 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | Used to filter MTT solution |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | Store at -20 ºC |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Trypsin-EDTA 10X | Biowest | X0930 | Dilute in PBS to obtain 3X solution |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| WIT-P-NC Culture Medium | Stemgent | 00-0051 | Used for primary BPEC culture |
| WIT-T Culture Medium | Stemgent | 00-0047 | Used for transformed BPEC culture |
Riferimenti
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Stampfer, M. R., Yaswen, P. Culture models of human mammary epithelial cell transformation. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 (2000).
- Schinzel, A. C., Hahn, W. C. Oncogenic transformation and experimental models of human cancer. Frontiers in Bioscience : A Journal and Virtual Library. 13 (13), 71 (2008).
- Balani, S., Nguyen, L. V., Eaves, C. J. Modeling the process of human tumorigenesis. Nature Communications. 8 (1), 15422 (2017).
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Ince, T. A., et al. Transformation of different human breast epithelial cell types leads to distinct tumor phenotypes. Cancer Cell. 12 (2), 160-170 (2007).
- Repullés, J., et al. Radiation-induced malignant transformation of preneoplastic and normal breast primary epithelial cells. Molecular Cancer Research. , 1-13 (2019).
- Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Seminars in Cancer Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Borowicz, S., et al. The soft agar colony formation assay. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Brocher, J. The BioVoxxel Image Processing and Analysis Toolbox. European BioImage Analysis Symposium. 8 (2), 67112 (2015).
- Torquato, S., Truskett, T. M., Debenedetti, P. G. Is random close packing of spheres well defined. Physical Review Letters. 84 (10), 2064-2067 (2000).
- LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Zubeldia-Plazaola, A., et al. Glucocorticoids promote transition of ductal carcinoma in situ to invasive ductal carcinoma by inducing myoepithelial cell apoptosis. Breast Cancer Research. 20 (1), 65 (2018).
