Bewertung der angiogenetischen Eigenschaften von Stammzellen von Eierstockkrebs mit dem dreidimensionalen Kokultursystem NICO-1
Summary
Eierstockkrebs-Stammzellen (OCSC) sind verantwortlich für Krebsentstehung, Rezidiv, therapeutische Resistenz und Metastasen. Es wird angenommen, dass die OCSC-Gefäßnische die Selbsterneuerung von OCSCs fördert, was zu Chemoresistenz führt. Dieses Protokoll bildet die Grundlage für die Etablierung eines reproduzierbaren OCSC-Gefäßnischenmodells in vitro.
Abstract
Krebsstammzellen (CSCs) befinden sich in einer unterstützenden Nische und bilden eine Mikroumgebung, die aus benachbarten Stromazellen, Gefäßen und extrazellulärer Matrix besteht. Die Fähigkeit von CSCs, an der Entwicklung von Endothel teilzunehmen, stellt ein wichtiges Merkmal dar, das direkt zum allgemeinen Verständnis der Mechanismen der Tumorgenese und Tumormetastasierung beiträgt. Ziel dieser Arbeit ist es, eine reproduzierbare Methodik zu etablieren, um die Tumorinitiationsfähigkeit von Eierstockkrebsstammzellen (OCSCs) zu untersuchen. Hier untersuchten wir den Neovaskularisationsmechanismus zwischen Endothelzellen und OCSCs sowie die morphologischen Veränderungen von Endothelzellen mit dem in vitro Kokulturmodell NICO-1. Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung des Neovaskularisationsschritts, der die OCSCs umgibt. Die Technik kann Aufschluss über die angiogenetischen Eigenschaften von OCSCs bei Tumormetastasen geben.
Introduction
Eierstockkrebs ist die achthäufigste bösartige Erkrankung bei Frauen weltweit, mit etwa 300.000 neuen Diagnosen und geschätzten 180.000 Todesfällen proJahr1. Bei der Erstdiagnose zeigt sich Eierstockkrebs oft mit schweren Symptomen, wobei sich etwa 75% der Patientinnen bereits im Stadium III-IV befinden. Dementsprechend beträgt die 5-Jahres-Überlebensrate <30% und die Sterblichkeitsrate ist die höchste bei gynäkologischen Krebserkrankungen2, wobei die Effizienz der Behandlung von Eierstockkrebs stark von klinischen Faktoren wie der erfolgreichen Durchführung einer Debulking-Operation, der Resistenz gegen Chemotherapie und dem Wiederauftreten nach der Ersttherapie abhängt.
Eierstockkrebsgewebe sind hierarchisch organisiert, wobei nicht alle Tumorkomponenten gleichermaßen in der Lage sind, Nachkommen zu erzeugen. Die einzigen Zellen, die in der Lage sind, sich selbst zu erneuern und eine heterogene Tumorzellpopulation zu produzieren, gelten als Krebsstammzellen (CSCs)3. Die Selbsterneuerung des CSC und die Tumorinitiierung werden von der Förderung der Angiogenese begleitet, um ihre Tumormikroumgebung umzugestalten, um eine unterstützende Nische zu erhalten. Bisherige Modelle konnten jedoch nicht für In-vitro-Analysen verwendet werden, da die Kultivierung von CSCs aus klinischen Proben aufgrund der Störung von Sphäroiden nach mehrfachem Durchgang nur begrenzt reproduzierbar ist. In jüngerer Zeit wurden experimentelle Methoden zur Kultivierung von CSCs von Patienten für mehrere Anwendungen entwickelt 4,5,6,7. Insbesondere durch die Ausnutzung der Eigenschaft von CSCs, durch Bildung von Sphäroiden in ultraniedrigen Bindungsplatten mit serumfreiem Medium zu wachsen, werden die kultivierten CSCs dazu gebracht, einen Stammzelloberflächenmarker zu exprimieren, der in normalen Tumorzellen mit Multilineage-Differenzierungspotential nicht exprimiert wird 8,9.
Neuere Daten haben gezeigt, dass die Persistenz ruhender ovarieller (O)CSCs, visualisiert als Verbreitung am Peritoneum, mit ihrer Regeneration als rezidivierende Tumoren assoziiert ist10. Das Verständnis der molekularen und biologischen Merkmale von OCSCs kann daher eine effektive Ausrichtung und Eradikation dieser Zellen ermöglichen, was zu einer möglichen Tumorremission führt. Insbesondere ist wenig über die zellulären und molekular-mechanistischen Merkmale der CSC-Rollen in der Angiogenesebekannt 11. Daher haben wir im vorliegenden Protokoll patientenabgeleitete OCSCs in einer In-vitro-Umgebung verwendet, um die angiogene Eigenschaft von Endothelzellen unter Verwendung des Kokulturmodells zu untersuchen, das die Tumormikroumgebung von CSCs und Endothelzellen an der metastatischen Stelle im klinischen Umfeld nachahmen kann. Da die Neovaskularisation einen kritischen Prozess darstellt, der zur Unterstützung des Tumorwachstums und der Metastasierung notwendig ist, wird ein besseres Verständnis ihres Mechanismus die Entwicklung einer neuartigen zielgerichteten Therapie für OCSCs an der metastatischen Stelle ermöglichen.
Hier stellen wir ein Protokoll vor, um den Neovaskularisationsschritt um die CSCs zeitlich zu visualisieren. Der Vorteil des Protokolls besteht darin, vollständig reproduzierbare Untersuchungen mit dem 3D-Kokultursystem NICO-1 zu ermöglichen, wodurch die Auswirkungen der OCSC-abgeleiteten Tumorinitiierungsfähigkeit während der Endothelzellangiogenese auf Patienten beobachtet werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorgestellte Protokoll beschreibt, wie die Tumormikroumgebung von OCSCs in einer In-vitro-Umgebung nachgeahmt werden kann. Die Hauptkomponente der Methode bildet das hochreproduzierbare Kokulturmodell, das mit dem NICO-1-System, einem indirekten Transwell-Kokultursystem, erhalten wurde. Viele der derzeit verfügbaren Kokulturmodelle untersuchen die Auswirkungen eines direkten Zell-Zell-Kontakts auf kokultivierte Zellpopulationen 12,13,14,15,16,17,18.</su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Grant-in-Aid for Scientific Research C (Grant no. 19K09834 to K.N.) des japanischen Ministeriums für Bildung, Wissenschaft und Kultur unterstützt.
Materials
| 0.025% Trypsin | Thermo | R001100 | |
| 10 mL Pipet | Thermo | 170356N | |
| 1250 µL Pipet tip | QSP | T112XLRS-Q | |
| 15 mL tube | Nunc | 339650 | |
| 200 µL Pipet tip | QSP | T110RS-NEW | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
| 5 mL Pipet | Thermo | 170366N | |
| 50 mL tube | Corning | 430290 | |
| AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| BioCoatTM Collagen I 60mm Dish | Corning | 356401 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | |
| Ethanol | WAKO | 057-00456 | |
| FGF-Basic | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
| Histodenz | SIGMA | D2158 | |
| HUEhT-1 cell | JCRB Cell Bank | JCRB1458 | |
| ICCP Filter 0.6 µm | Ginrei Lab. | 2525-06 | |
| Insulin, human | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
| Luminometer | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356234 | |
| Microscope | Yokogawa | CQ-1 | |
| NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005290 | |
| P1000 Pipet | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipet | Gilson | F123601 | |
| PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
| StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
| Transfer Pipet | FALCON | 357575 | |
| Y-27632 | WAKO | 253-00513 |
Riferimenti
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