दंत क्षय को रोकने के लिए पौधों के अर्क और अंशों से उपन्यास एंटीमाइक्रोबियल और एंटीबायोफिल्म अणुओं की पहचान करने के लिए व्यवस्थित दृष्टिकोण
Summary
प्राकृतिक उत्पाद नई दवाओं और चिकित्सीय एजेंटों के विकास के लिए आशाजनक शुरुआती बिंदुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, उच्च रासायनिक विविधता के कारण, पौधों से नए चिकित्सीय यौगिकों को ढूंढना एक चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाला काम है। हम पौधे के अर्क और अंशों से एंटीमाइक्रोबियल और एंटीबायफिल्म अणुओं की पहचान करने के लिए एक सरलीकृत दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं।
Abstract
प्राकृतिक उत्पाद संरचनात्मक रूप से विभिन्न पदार्थ प्रदान करते हैं, जिसमें असंख्य जैविक गतिविधियां होती हैं। हालांकि, जटिल पौधों के मैट्रिक्स और समय लेने वाले अलगाव और पहचान प्रक्रियाओं के कारण पौधों से सक्रिय यौगिकों की पहचान और अलगाव चुनौतीपूर्ण है। इसलिए, पौधों से प्राकृतिक यौगिकों की स्क्रीनिंग के लिए एक सौतेला दृष्टिकोण, जिसमें संभावित सक्रिय अणुओं के अलगाव और पहचान शामिल हैं, प्रस्तुत किया गया है । इसमें पौधे की सामग्री का संग्रह शामिल है; कच्चे तेल के अर्क की तैयारी और अंश; विश्लेषण और यौगिकों की पहचान के लिए क्रोमेटोग्राफी और स्पेक्ट्रोमेट्री (यूएचपीएलसी-डैड-एचआरएमएस और एनएमआर) दृष्टिकोण; बायोअसे कहते हैं (एंटीमाइक्रोबियल और एंटीबायोफिल्म गतिविधियां; लार के लिए बैक्टीरियल “आसंजन शक्ति” और चयनित उपचारों के साथ इलाज किए गए प्रारंभिक ग्लूकन मैट्रिक्स); और डेटा विश्लेषण। मॉडल सरल, प्रजनन योग्य है, और कई यौगिकों, सांद्रता और उपचार चरणों की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग को लगातार नियंत्रित किया जा सकता है। प्राप्त किए गए आंकड़े भविष्य के अध्ययनों के लिए नींव प्रदान करते हैं, जिनमें सबसे सक्रिय अर्क और/या अंशों के साथ योग, अणुओं का अलगाव, माइक्रोबियल कोशिकाओं और बायोफिल्म्स में विशिष्ट लक्ष्यों के लिए अणुओं को मॉडलिंग करना शामिल है । उदाहरण के लिए, कैरियोजेनिक बायोफिल्म को नियंत्रित करने का एक लक्ष्य स्ट्रेप्टोकोकस म्यूटन ग्लूकोसिलट्रांसफेरेस की गतिविधि को रोकना है जो एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स के ग्लूकन को संश्लेषित करता है। उन एंजाइमों का अवरोध बायोफिल्म बिल्ड-अप को रोकता है, इसकी उग्रता को कम करता है।
Introduction
सोसायटियों में इस्तेमाल होने वाली दवा के शुरुआती मॉडल प्राकृतिक उत्पादों (एनपीएस) पर आधारित थे। तब से इंसान प्रकृति में नए रसायनों की तलाश कर रहा है जिसे ड्रग्स में तब्दील किया जा सकता है1. इस खोज के कारण नृवंशविज्ञानी स्क्रीनिंग के लिए प्रौद्योगिकियों और तरीकों में निरंतर सुधारहुआ1 ,2,3. एनपीएस संरचनात्मक रूप से विविध पदार्थों का एक समृद्ध स्रोत प्रदान करते हैं, जिसमें वैकल्पिक या एडजुवेंट चिकित्सा विकसित करने के लिए उपयोगी जैविक गतिविधियों की एक विस्तृत श्रृंखला है। हालांकि, अंतर्निहित जटिल पौधे मैट्रिक्स सक्रिय यौगिकों के अलगाव और पहचान को एक चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाला कार्य बनाता है4।
दंत क्षय4सहित मौखिक को प्रभावित करने वाली कई स्थितियों को रोकने और/या इलाज करने के लिए एनपीएस आधारित दवाओं या योगों का उपयोग किया जा सकता है । दंत क्षय, विश्व स्तर पर सबसे प्रचलित पुरानी बीमारियों में से एक, चीनी से भरपूर आहार और माइक्रोबियल बायोफिल्म्स (दंत पट्टिका) की बातचीत से निकला है जो दांतों की सतह पर बनता है जो माइक्रोबियल मेटाबोलिज्म से प्राप्त कार्बनिक एसिड के कारण होने वाले डिमिनेरलाइजेशन की ओर जाता है, और यदि इलाज नहीं किया जाता है, तो दांतों की हानि5,6हो जाती है। यद्यपि अन्य सूक्ष्मजीव7से जुड़े हो सकते हैं, स्ट्रेप्टोकोकस म्यूटन एक महत्वपूर्ण कैंसरजनक जीवाणु है क्योंकि यह एसिडोजेनिक, एसिडुरिक और एक बाह्य मैट्रिक्स बिल्डर है। यह प्रजाति कई एक्सोएंजाइम्स (जैसे, ग्लाइकोसाइलट्रांसफेरैसेस या जीटीएफएस) को एन्कोड करती है जो एक्सोपॉलिसाकाराइड्स में समृद्ध एक्सोसेलुलर मैट्रिक्स बनाने के लिए एक सब्सट्रेट8 के रूप में सुक्रोज का उपयोग करती है, जो एक उग्रता निर्धारक9है। इसके अलावा, कवक कैंडिडा एल्बिकान उस एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स7के उत्पादन को बढ़ा सकते हैं। हालांकि फ्लोराइड, विभिन्न तौर-तरीकों में प्रशासित, दंत क्षय10को रोकने के लिए आधार बना हुआ है, इसकी प्रभावशीलता बढ़ाने के लिए एडजुवेंट के रूप में नए दृष्टिकोणों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, उपलब्ध एंटी-प्लेक तौर-तरीके व्यापक स्पेक्ट्रम माइक्रोबिकिडल एजेंटों (जैसे, क्लोरहेक्सिडीन)11के उपयोग पर आधारित हैं। एक विकल्प के रूप में, एनपीए बायोफिल्म्स को नियंत्रित करने और दंत क्षय12, 13को रोकने के लिए संभावित उपचार हैं।
पौधों से नए बायोएक्टिव यौगिकों की खोज में आगे की अग्रिम में आवश्यक कदम या दृष्टिकोण शामिल हैं जैसे: (i) नमूने के लिए विश्वसनीय और प्रजनन योग्य प्रोटोकॉल का उपयोग, यह देखते हुए कि पौधे अक्सर अंतरविशिष्ट परिवर्तनशीलता दिखाते हैं; (ii) व्यापक अर्क और उनके संबंधित अंशों को छोटे पैमाने पर तैयार करना; (iii) उनके रासायनिक प्रोफाइल के लक्षण वर्णन और/या उपहास ने सोचा कि जीसी-एमएस, एलसी-डैड-एमएस या एनएमआर जैसे बहुआयामी डेटा का अधिग्रहण, उदाहरण के लिए; (iv) जैव सक्रियता का आकलन करने के लिए व्यवहार्य और उच्च उपज वाले मॉडलों का उपयोग; (v) बहुविभिरण डेटा विश्लेषण या अन्य सांख्यिकीय उपकरणों के आधार पर संभावित नई हिट का चयन; (vi) लक्षित यौगिकों या होनहार उम्मीदवारों के अलगाव और शुद्धि को करने के लिए; और (vii) अलग यौगिकों का उपयोग कर पत्राचार जैविक गतिविधियों का सत्यापन2,14.
Dereplication कच्चे तेल के अर्क में ज्ञात यौगिकों की तेजी से पहचान करने की प्रक्रिया है और उन है कि पहले से ही अध्ययन किया गया है से उपंयास यौगिकों अंतर की अनुमति देता है । इसके अलावा, यह प्रक्रिया अलगाव को रोकती है जब बायोएक्टिविटी पहले से ही कुछ यौगिकों के लिए वर्णित की गई है, और यह “लगातार हिटर्स” का पता लगाने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। इसका उपयोग प्रमुख यौगिक पहचान या अर्क के संग्रह के रासायनिक प्रोफाइलिंग तक गतिविधि-निर्देशित अंश के त्वरण से लेकर विभिन्न अलक्षित कार्यप्रवाहों में किया गया है। इसे सीई की अलक्षित रासायनिक प्रोफाइलिंग या मेटाबोलाइट्स की लक्षित पहचान के लिए मेटाबोलॉमिक अध्ययनों के साथ पूरी तरह से एकीकृत किया जा सकता है। यह सब अंततः अलगाव प्रक्रियाओं 1 ,15,16,17से पहले निकालने को प्राथमिकतादेताहै ।
इसलिए, वर्तमान पांडुलिपि में, हम पौधे के अर्क और अंशों से एंटीमाइक्रोबियल और एंटीबायफिल्म अणुओं की पहचान करने के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। इसमें चार बहुविषयक चरण शामिल हैं: (1) पौधे की सामग्री का संग्रह; (2) कच्चे तेल के अर्क (सीई) और अंशों (सीईएफ) की तैयारी, इसके बाद उनका रासायनिक प्रोफ़ाइल विश्लेषण; (3) बायोस कहते हैं; और (4) जैविक और रासायनिक डेटा विश्लेषण(चित्रा 1)। इस प्रकार, हम केकारिया सिल्वेस्ट्रिज अर्क और स्ट्रेप्टोकोकस म्यूटन और कैंडिडा एल्बिकान13के खिलाफ अंशों की एंटीमाइक्रोबियल और एंटीबायोफिल्म गतिविधियों का विश्लेषण करने के लिए विकसित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, साथ ही फाइटोकेमिकल लक्षण वर्णन और डेटा विश्लेषण के लिए प्रक्रियाएं भी प्रस्तुत करते हैं। सादगी के लिए, यहां ध्यान जीवाणु का उपयोग कर प्राकृतिक यौगिकों स्क्रीनिंग के लिए दृष्टिकोण प्रदर्शित करने के लिए है ।
चित्रा 1: पौधों के अर्क और अंशों से सक्रिय अणुओं की पहचान करने के लिए व्यवस्थित दृष्टिकोण का प्रवाह-चार्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्राकृतिक कच्चे तेल के अर्क के साथ काम से संबंधित मुख्य चुनौतियों में उनकी जटिल संरचना और क्लासिक जैव-निर्देशित अलगाव अध्ययन की अपर्याप्तता शामिल है। हालांकि यह प्रक्रिया धीमी है, यह प्रभावी है और एन?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम संयंत्र सामग्री तैयार करने के लिए प्रयोगशालाओं को उपलब्ध कराने के लिए UNESP, Araraquara/SP के रसायन विज्ञान संस्थान के Núcleo de Bioensaios, Biossíntese ई Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) के लिए आभार व्यक्त करते हैं । हम दंत सामग्री और प्रोस्थोडोंटिक्स, यूएनईएसपी, अराक्वारा/एसपी विभाग की एप्लाइड माइक्रोबायोलॉजी प्रयोगशाला को भी धन्यवाद देते हैं । इस शोध को साओ पाउलो रिसर्च फाउंडेशन (एफएपीईएसपी #2013/07600-3 से एजेसी) और स्कॉलरशिप प्लस ओवरहेड फंड (एफएपीपी #2017/07408-6 और एफएपीईपी #2019/23175-7 से एसएमआर को एक रिसर्च ग्रांट द्वारा समर्थित किया गया था; #2011/21440-3 और #2012/21921-4 पीसीपीबी) । राष्ट्रीय वैज्ञानिक और तकनीकी विकास परिषद ने एफएपीएसपी के सहयोग से अतिरिक्त सहायता (INCT CNPq #465637/2014-0 और एफएपीएसपी #2014/50926-0 एजेसी को) प्रदान की ।
Materials
| 96-well microplates | Kasvi | Flat bottom | |
| Activated carbon | LABSYNTH | Clean up and/or fractionation step | |
| Analytical mill | Ika LabortechniK | Model A11 Basic | |
| Blood agar plates | Laborclin | ||
| Chromatographic column C18 | Phenomenex Kinetex | 150 × 2.1 mm, 2.6 µm, 100Â | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | Vehicle solution | |
| ELISA plate reader | Biochrom Ez | ||
| Ethanol | J. T. Baker | For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | Vehicle solution | |
| Ethyl acetate | J. T. Baker | Fractionation step | |
| GraphPad Software | La Jolla | GraphPad Prism7 | |
| Hexane | J. T. Baker | Fractionation step | |
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| Isopropanol | J. T. Baker | For extraction step | |
| Lyophilizer (a freeze dryer) | Savant | Modulyo | |
| Nylon Millipore | LAC | 0.22 µm x 13 mm | |
| Orbital shaker | Quimis | Model G816 M20 | |
| Polyamide solid phase extraction cartridge | Macherey-Nagel | Clean up and/or fractionation step | |
| Silica gel | Merck | 40–63 μm, 60 Â | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Synth | 0,89% in water | |
| Solid phase extraction cartridges (SPE) | Macherey-Nagel | Clean up and/or fractionation step | |
| Tryptone | Difco | ||
| UHPLC-DAD | Dionex | Ultimate 3000 RS | |
| Ultrasonic bath | UNIQUE | Model USC 2800 | |
| Yeast extract | Difco |
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