Análisis del repertorio inmune del receptor de células T y B mediante secuenciación de próxima generación
Summary
El protocolo actual describe un método para el aislamiento del ADN de muestras de sangre y biopsias intestinales, la generación de bibliotecas de TCRβ y IGH PCR para la secuenciación de próxima generación, la realización de una ejecución de NGS y el análisis de datos básicos.
Abstract
La memoria inmunológica, el sello distintivo de la inmunidad adaptativa, es orquestada por linfocitos T y B. En la circulación y diferentes órganos, hay miles de millones de clones únicos de células T y B, y cada uno puede unirse a un antígeno específico, lo que lleva a la proliferación, diferenciación y / o secreción de citoquinas. La gran heterogeneidad en las células T y B es generada por la recombinación aleatoria de diferentes segmentos genéticos. Las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS), desarrolladas en la última década, permiten una visión en profundidad sin precedentes del repertorio inmunológico de los receptores de células T y B. Los estudios en varias condiciones inflamatorias, inmunodeficiencias, infecciones y malignidades demostraron cambios marcados en clonality, uso del gen, y propiedades biofísicas del repertorio inmune, proporcionando penetraciones importantes sobre el papel de inmunorespuestas adaptante en diversos desordenes.
Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para NGS del repertorio inmune de las células de T y de B de la sangre y del tejido. Presentamos una tubería a partir del aislamiento de ADN a través de la preparación de la biblioteca, la secuenciación en el secuenciador NGS y terminando con análisis básicos. Este método permite la exploración de células T y B específicas a nivel de nucleótidos o aminoácidos, y por lo tanto puede identificar cambios dinámicos en las poblaciones de linfocitos y parámetros de diversidad en diferentes enfermedades. Esta técnica está entrando lentamente en la práctica clínica y tiene el potencial para la identificación de nuevos biomarcadores, estratificación de riesgos y medicina de precisión.
Introduction
El sistema inmune adaptante, comprendido de linfocitos de T y de B, utiliza memoria inmunológica para reconocer un antígeno previamente encontrado e iniciar una respuesta rápida. Los linfocitos se generan en la médula ósea y maduran en el timo (células T) o la médula ósea (células B). Tanto el receptor de células T (TCR) como el receptor de células B (BCR) muestran configuraciones únicas que permiten el reconocimiento de antígenos específicos. En la homeostasis, las células T y B circulan y examinan constantemente los billones de péptidos diferentes presentados en las células presentadoras de antígenos. La ligadura TCR o BCR de un antígeno específico con alta afinidad, junto con la coestimulación adecuada, conduce a la activación celular, lo que resulta en la secreción de citoquinas, la expansión clonal y la generación de anticuerpos, en el caso de las células B.
La enorme variedad de las diferentes células T o B se denomina colectivamente repertorio inmune, lo que permite el reconocimiento de innumerables epítopos diferentes. Para generar un repertorio tan vasto, se lleva a cabo un complejo proceso de ensamblaje aleatorio de diferentes segmentos de genes, creando combinaciones casi infinitas de receptores que pueden unirse a antígenos únicos1. Este proceso, denominado recombinación V(D)J, incluye reordenamientos de diferentes genes variables (V), diversidad (D) y unión (J), acompañados de deleciones aleatorias e inserciones de nucleótidos en las uniones2.
La arquitectura del sistema inmune adaptativo ha interesado a científicos en diferentes campos durante muchas décadas. En el pasado, la secuenciación de Sanger, la determinación complementaria de espectros de la región 3 (CDR3) y la citometría de flujo se utilizaron para caracterizar el repertorio inmunológico, pero proporcionaron baja resolución. En la última década, los avances en los métodos de secuenciación de próxima generación (NGS) permitieron una visión profunda de las características y la composición de los repertorios de TCR y BCR de un individuo3,4. Estos sistemas de alto rendimiento (HTS) secuencian y procesan millones de productos TCR o BCR reorganizados simultáneamente y permiten un análisis de alta resolución de células T y B específicas a nivel de nucleótidos o aminoácidos. Ngs proporciona una nueva estrategia para estudiar el repertorio inmune en salud y enfermedad. Los estudios que utilizaron HTS demostraron repertorios alterados de TCR y BCR en enfermedades autoinmunes5,inmunodeficiencias primarias6,7,y malignidades, tales como en leucemia mieloide aguda8. Usando NGS, nosotros y otros hemos mostrado la extensión oligoclonal de las copias específicas de la célula de T y de B, en pacientes con la enfermedad de intestino inflamatoria (IBD), incluyendo colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn9,10,11,12,13,14. En general, los estudios de diferentes campos sugieren que los cambios en el repertorio tienen un papel crucial en la patogénesis de los trastornos inmuno-mediados.
El protocolo actual describe un método para el aislamiento del ADN de las biopsias intestinales y la sangre, la generación de bibliotecas de TCRβ y IGH PCR para NGS, y la realización de la secuenciación de ejecución. También proporcionamos pasos básicos en el análisis de datos del repertorio inmunológico. Este protocolo también se puede aplicar para la generación de bibliotecas TCRα, TCRγ e IGL. El método también es compatible con otros órganos (por ejemplo, ganglios linfáticos, tumores, líquido sinovial, tejido graso, etc.) siempre y cuando se utilicen protocolos de digestión específicos de tejidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los cambios en la abundancia y la función de los linfocitos B y T se encuentran a menudo en diferentes neoplasias malignas18,trastornos inflamatorios crónicos (por ejemplo, colitis ulcerosa y artritis reumatoide)10,19,y en diversas inmunodeficiencias17,20. El método actual utiliza NGS para facilitar una visión en profundidad de los repertorios de TCR y BCR, lo que permite la de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ninguno.
Materials
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
Riferimenti
- Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, 45-55 (2002).
- Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities. Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).
- Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses. Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).
- Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases. Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).
- Lee, Y. N., et al. Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency. Science Immunology. 1 (6), (2016).
- Werner, L., et al. Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD. Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).
- Zhang, J., et al. Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia. Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).
- Chapman, C. G., et al. Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn’s Disease Through Deep Sequencing. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).
- Werner, L., et al. Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis. Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).
- Bashford-Rogers, R. J. M., et al. Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases. Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).
- Wu, J., et al. Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn’s disease and ulcerative colitis patients. Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).
- Rosati, E., et al. Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases. Journam of Crohn’s and Colitis. , (2019).
- Allez, M., et al. T cell clonal expansions in ileal Crohn’s disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence. Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).
- Li, S., et al. IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling. Nature Communications. 4, 2333 (2013).
- H, I. J., et al. Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency. Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).
- Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review. Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).
- Zhuang, Y., et al. Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy. International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).
- Liu, X., et al. T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).
- Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing. Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).
- Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. A roadmap towards personalized immunology. NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).
- Laubli, H., et al. The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors. Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).
- Hogan, S. A., et al. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).
- Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).
- Hirsch, P., et al. Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).
- De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).
- Zemmour, D., et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).
- Zheng, C., et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).
