Dit protocol beschrijft transillumination-ondersteunde microdissectie van segmenten van volwassen muis seminifereuze tubuli die specifieke stadia van seminifereuze epitheelcyclus vertegenwoordigen, en celtypen daarin, en daaropvolgende immunostaining van squashpreparaten en intacte tubulussegmenten.
Spermatogenese is een uniek differentiatieproces dat uiteindelijk aanleiding geeft tot een van de meest verschillende celtypen van het lichaam, het sperma. Differentiatie van kiemcellen vindt plaats in de cytoplasmatische zakken van somatische Sertoli-cellen die 4 tot 5 generaties kiemcellen tegelijkertijd hosten en hun ontwikkeling coördineren en synchroniseren. Daarom is de samenstelling van kiemceltypen binnen een doorsnede constant, en deze celassociaties staan ook bekend als stadia (I-XII) van de seminifereuze epitheelcyclus. Belangrijk is dat stadia ook kunnen worden geïdentificeerd aan de hand van intacte seminifereuze tubuli op basis van hun differentiële lichtabsorptie/ verstrooiingskenmerken die door transilluminatie worden onthuld, en het feit dat de stadia elkaar in een numerieke volgorde langs de tubulus volgen. Dit artikel beschrijft een transillumination-ondersteunde microdissectiemethode voor de isolatie van seminifereuze tubulussegmenten die specifieke stadia van de seminifereuze epitheelcyclus van muizen vertegenwoordigen. Het lichtabsorptiepatroon van seminifereuze tubuli wordt eerst geïnspecteerd onder een dissectiemicroscoop en vervolgens worden tubulisegmenten die specifieke stadia vertegenwoordigen gesneden en gebruikt voor downstreamtoepassingen. Hier beschrijven we immunostainingprotocollen voor podiumspecifieke squashpreparaten en voor intacte tubulussegmenten. Deze methode stelt een onderzoeker in staat om zich te concentreren op biologische gebeurtenissen die plaatsvinden in specifieke fasen van spermatogenese, waardoor een uniek hulpmiddel wordt geboden voor ontwikkelings-, toxicologische en cytologische studies van spermatogenese en onderliggende moleculaire mechanismen.
Differentiatie van mannelijke kiemcellen van diploïde spermatogonia tot volwassen haploïde spermatozoa, d.w.z.spermatogenese, is een complex proces dat plaatsvindt in het epitheel van seminifereuze tubuli in de teelballen van een geslachtsrijp individu1. Mitotische afstammelingen van A1 spermatogonia delen zich eerst vijf keer om de differentiatie-geëngageerde populatie uit te breiden en voeren vervolgens meiose in als spermatocyten die uiteindelijk aanleiding geven tot haploïde spermatiden. Differentiatie van ronde spermatiden in spermatozoa, d.w.z.spermiogenese, omvat complexe veranderingen in cellulaire morfologie, waaronder nucleaire verdichting en constructie van spermaspecifieke structuren zoals het acrosome en het flagellum. Bij muizen duurt het hele proces van spermatogenese 35 dagen om2,3te voltooien.
Op een bepaalde plaats herbergt het seminifereuze epitheel maximaal vijf cohorten differentiërende kiemcellen plus de kiembaanstam/voorlopercellen en de somatische Sertoli-cellen1. Differentiërende kiemcellen vormen concentrische lagen waarvan de samenstelling voorspelbaar is, en haploïde cellen bij een bepaalde ontwikkelingsstap associëren zich altijd met bepaalde soorten spermatocyten en spermatogonia4,5. Daarom herbergt elke doorsnede van een tubulus cohorten van kiemcellen met een constante samenstelling. Deze specifieke celassociaties worden gedefinieerd als de stadia van het seminifereuze epitheel. Stadia op zich vertonen geen stagnerende controlepuntachtige toestanden , maar ontwikkelen zich voortdurend naarmate de differentiatie van kiemcelcohorten vordert in synchronie1,2,6. Bij muizen zijn er 12 stadia (I-XII)2 die op een segmentale manier langs de lengteas van de seminifereuze tubulus zijn gerangschikt, en ze volgen elkaar in een logische volgorde en vormen zo de golf van seminiferous epitheel, of spermatogene golf7,8,9 ( Figuur1). Voltooiing van spermatogenese duurt vier cycli, en hiërarchische lagen of cohorten van differentiërende kiemcellen binnen elke seminifereuze tubulidoorsnede zijn tijdelijk één seminifereuze cyclus apart van elkaar. De lengte van de cyclus is soortafhankelijk en in de muis duurt elke cyclus 8,6 dagen10.
De stadia kunnen worden geïdentificeerd op basis van de cellulaire samenstelling en organisatie van het seminifereuze epitheel op histologische testissecties 5 (figuur 1 en figuur 2). Histologische analyse is echter bewerkelijk, tijdrovend en vereist bevestiging en kleuring, en kan daarom niet worden toegepast op levend weefsel. Belangrijk is dat enscenering ook kan worden uitgevoerd op levend weefsel onder een dissectiemicroscoop door gebruik te maken van verschillende lichtabsorptie/ verstrooiingspatronen die door verschillende stadia van de cyclus worden tentoongesteld (figuur 2). Het vermogen van elke fase om licht te absorberen en te verspreiden is relatief ten opzichte van het niveau van chromatinecondensatie van late post-meiotische spermatiden die een bepaald stadium host en de verpakking van deze cellen in bundels7,11. Spermatid differentiatie, d.w.z.spermiogenese, is verder onderverdeeld in 16 ontwikkelingsstappen, waaronder 8 stappen van ronde spermatid (stap 1-8) en 8 stappen van het verlengen van spermatid (stappen 9-16) differentiatie (Figuur 1). Stap 9-11 langwerpige spermatiden (stadium IX-XI) geven alleen een laag niveau van chromatinecondensatie weer, waardoor een lage hoeveelheid licht wordt geabsorbeerd. Chromatinecondensatie begint in stap 11 spermatiden (stadium XI), en stap 15-16 langwerpige spermatiden (stadium IV-VIII) bevatten volledig gecondenseerd chromatine en vertonen daarom maximale lichtabsorptie (figuur 3). Chromatine moet worden gecondenseerd om stevig in het spermahoofd te worden verpakt. Bijkomende factoren die bijdragen aan het lichtabsorptiepatroon zijn de locatie van langwerpige spermatiden in het epitheel (basaal versus apicaal) en bundeling van langwerpige spermatiden (uitgesproken in stadia II-V)11 (figuur 3). Bundels worden gezien als vlekken in het midden van de tubuli en als strepen aan de randen onder een dissectiemicroscoop en hoe meer gecondenseerd de chromatine, hoe donkerder de vlek / streep11.
Dit artikel beschrijft het gebruik van transillumination-ondersteunde microdissectiemethode voor de isolatie van seminifereuze tubulisegmenten die specifieke stadia van de seminifereuze epitheelcyclus vertegenwoordigen. Eenmaal geïsoleerd kunnen gefaseerde tubulussegmenten worden onderworpen aan verschillende downstreamanalyses, waaronder biochemische RNA – en eiwitanalyses12,13,14,15, flowcytometrie16, ex vivo tubuluscultuur17 en immunostaining18. Hier bieden we ook gedetailleerde downstreamprotocollen om geplette monolagen van gefaseerde tubulussegmenten voor te bereiden op live celmorfologische analyse en daaropvolgende immunostaining, evenals hele-mount immunostainings van tubulussegmenten. De werkstroom in een notendop in beschreven in figuur 4.
De transillumination-ondersteunde microdissectiemethode maakt nauwkeurige identificatie en isolatie van kiemcellen mogelijk in specifieke stappen van differentiatie dankzij de gesynchroniseerde cellulaire samenstelling van de stadia. Belangrijk is dat het ook de studie van stadiumafhankelijke gebeurtenissen tijdens spermatogenese op levend weefsel mogelijk maakt. Gezien het ontbreken van schaalbare in vitro modellen voor spermatogenese, heeft deze methode ook een uniek voordeel dat gerichte ontwikkelings – en toxicologische studies op korte termijn mogelijk zijn voor stadiumspecifieke tubulisegmenten ex vivo12,17. Hoewel we hier de methode voor de muis beschrijven, kan dezelfde procedure worden toegepast op elke zoogdiersoort met longitudinale en segmentale rangschikking van seminifereuze epitheelstadia, zoals de rat4,7,15,19,20.
De transilluminatie-ondersteunde microdissectiemethode die we hierboven hebben beschreven, maakt een fasegerichte aanpak mogelijk voor de studie van spermatogenese. Spermatogenese is een sterk gesynchroniseerd proces en alle belangrijke stappen tijdens de spermatogene differentiatie worden gereguleerd en uitgevoerd op een faseafhankelijke manier, zoals differentiatietoezegging (in stadia VII-VIII), het begin van meiose (VII-VIII), meiotische deling (XII), het begin van spermatoïde verlenging (VIII) en spermiatie (VIII)1,26,27. De fasegerichte analyse biedt een krachtig hulpmiddel om deze specifieke gebeurtenissen te bestuderen die beperkt zijn tot specifieke stappen van spermatogenese en daarom alleen worden gevonden in gedefinieerde stadia van de seminifereuze epitheelcyclus. Het beheersen van de methode vereist enige oefening en het gebruik van een dissectiemicroscoop van goede kwaliteit en de juiste verhelderende omstandigheden zijn de sleutel tot succes. Het implementeren van deze methode als onderdeel van de dagelijkse toolkit heeft het vermogen om de impact en biologische relevantie van onderzoek naar mannelijke voortplantingsfuncties aanzienlijk te verbeteren door nauwkeurigere dissectie van moleculaire gebeurtenissen tijdens spermatogenese mogelijk te maken.
Alle WT-muisstammen die we hebben bestudeerd, vertonen een vergelijkbaar transilluminatiepatroon en vertonen geconserveerde celassociaties in stadia van de seminifereuze epitheelcyclus. Op voorwaarde dat spermiogene differentiatie van kiemcellen niet enorm verschilt van WT-muizen, geldt hetzelfde ook voor alle knock-out muismodellen die we hebben bestudeerd. Bovendien kan het worden toegepast op andere soorten die longitudinale segmentale rangschikking vertonen van stadia van de seminiferische epitheelcyclus7. Soorten met niet-segmentale stadia (zoals de mens) kunnen echter niet worden gebruikt. Gezien de essentiële rol van chromatinecondensatie bij het verlengen van spermatiden bij het definiëren van het transilluminatiepatroon, is het duidelijk dat elke verkeerde regulering van dit proces onvermijdelijk afbreuk zal doen aan de implementatie van deze methode. Bij juveniele muizen en jongvolwassenen (5-6 weken) is het transilluminatiepatroon nog niet volledig vastgesteld en daarom mogen alleen muizen ouder dan 8 weken worden gebruikt. Het is ook belangrijk om in gedachten te houden dat het knijpen en trekken van de tubuli onvermijdelijk het transilluminatiepatroon zal aantasten omdat het de cellulaire architectuur binnen het seminifereuze epitheel vervormt.
De geïsoleerde seminifereuze tubulisegmenten kunnen ook worden gekweekt, waardoor ex vivo observatie en manipulatie van spermatogenese-gekoppelde processen, waaronder meiose, mogelijk is. Om de levensvatbaarheid van het weefsel te waarborgen en RNA- en eiwitafbraak te voorkomen, mogen de monsters niet meer dan 2 uur na het opofferen van de muis worden verzameld en verwerkt. Voor ex vivo cultuur van seminifereuze tubuli mag de tijd van offer tot begin van cultuur niet langer zijn dan 1 uur. De integriteit van tubulusfragmenten kan meestal tot 72 uur in vitro worden gehandhaafd als ze goed worden geoogst.
De fase van de seminifereuze epitheelcyclus kan worden geverifieerd en nog nauwkeuriger worden gedefinieerd met behulp van fasecontrastmicroscopie van squashpreparaten16. Microscopie wordt uitgevoerd op levende cellen, wat een extra dimensie in de analyse biedt en observatie van organellen of celbewegingen in specifieke stadia van spermatogenese mogelijk maakt28,29,30. Fasecontrastmicroscopie biedt exacte fasering voor latere immunostainring, die een zeer gedetailleerde analyse van eiwitexpressie en lokalisatiedynamiek tijdens spermatogenese mogelijk maakt, inclusief fasespecifieke veranderingen.
Terwijl cellen worden vrijgegeven uit de epitheelcontext in squashpreparaten, maken hele-mount immunostainings van tubulisegmenten de studie van spermatogene cellen in hun fysiologische omgeving mogelijk. Daarom kunnen preparaten voor hele montage een betere visualisatie van seminifereuze tubulearchitectuur en zijn intercellulaire contacten bieden dan immunostaining op dwarsdoorsneden. Belangrijk is dat transillumination-assisted staging van de tubulesegmenten voorafgaand aan immunostaining de aanpak nog krachtiger maakt door informatie over het specifieke stadium van een bepaald segment op te nemen. Whole-mount vlekken zijn een bijzonder nuttig hulpmiddel voor de studie van cellen aan de periferie van seminifereuze tubuli, zoals peritubulaire myoïde cellen, peritubulaire macrofagen en spermatogonia, maar kunnen ook nieuwe inzichten openen in onderzoek naar meiotische en postmeiotische kiemcellen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Academie van Finland [315948, 314387 aan N.K.]; Sigrid Jusélius Stichting [aan N.K., J.T.]; Stichting Emil Aaltonen [aan J.-A.M., T.L.]; Turks doctoraatsprogramma moleculaire geneeskunde [S.C.-M., O.O.].
bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647 | |
cover glass 20×20 mm | Menzel Gläser | 11961988 | |
Falcon conical tube 15-ml | Sarstedt | 62.554.502 | |
fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
grease pen (ImmEdge) | Vector Laboratories | H-4000 | |
microscope slide Superfrost Plus | Thermo Scientific | 22-037-246 | |
Parafolmaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
Petri dish (100-mm) | Greiner | 664160 | |
phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 11503387 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36962 | |
rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) | Vector Laboratories | RL-1072 | |
Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
Tween-20 | Sigma | P2287 |