L'obiettivo di questo protocollo è quello di eseguire una co-coltura dinamica di macrofagi e miofibroblasti umani in scaffold elettrofilari tubolari per studiare la rigenerazione tissutale guidata dal materiale, utilizzando un bioreattore che consente il disaccoppiamento dello stress da taglio e dell'allungamento ciclico.
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Articolo metodologico
Un bioreattore multi-cue per valutare la capacità infiammatoria e rigenerativa dei biomateriali sotto flusso e allungamento
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'uso di biomateriali riassorbibili per indurre la rigenerazione direttamente nel corpo è una strategia interessante dal punto di vista traslazionale. Tali materiali inducono una risposta infiammatoria all'impianto, che è il motore del successivo riassorbimento del materiale e della rigenerazione di nuovo tessuto. Questa strategia, nota anche come ingegneria tissutale in situ, viene perseguita per ottenere sostituzioni cardiovascolari come innesti vascolari ingegnerizzati nei tessuti. Sia il processo infiammatorio che quello rigenerativo sono determinati dai segnali biomeccanici locali sull'impalcatura (cioè stretch e shear stress). Qui, descriviamo in dettaglio l'uso di un bioreattore sviluppato su misura che consente in modo univoco il disaccoppiamento dello stress di allungamento e taglio su un'impalcatura tubolare. Ciò consente la valutazione sistematica e standardizzata della capacità infiammatoria e rigenerativa di scaffold tubolari sotto l'influenza di carichi meccanici ben controllati, che dimostriamo sulla base di un esperimento di co-coltura dinamica utilizzando macrofagi e miofibroblasti umani. I passaggi pratici chiave in questo approccio - la costruzione e l'creazione del bioreattore, la preparazione degli scaffold e la semina cellulare, l'applicazione e la manutenzione del flusso di allungamento e taglio e la raccolta dei campioni per l'analisi - sono discussi in dettaglio.
Introduzione
L'ingegneria tissutale cardiovascolare (TE) viene perseguita come opzione di trattamento alternativa alle protesi cardiovascolari permanenti attualmente utilizzate (ad esempio, innesti vascolari, sostituzioni delle valvole cardiache), che non sono ottimali per grandi coorti dipazienti 1,2,3,4. Applicazioni molto ricercate includono innesti vascolari ingegnerizzati tissutale (TEVG)5,6 e valvole cardiache (TEHV)7,8. Molto spess....
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Protocollo
Negli studi descritti in questo protocollo, sono stati utilizzati macrofagi umani primari isolati da buffy coats di sangue periferico e miofibroblasti umani isolati dalla vena safena dopo chirurgia coronarica by-pass44. I cappotti buffy sono stati ottenuti da volontari sani e anonimizzati che hanno fornito il consenso informato scritto, che è stato approvato dal Sanquin Research Institutional Medical Ethical Committee. L'uso di cellule della vena safena umana (HVSC) era conforme al "Code Proper Secondary Use of Human Tissue" sviluppato dalla Federazione delle società mediche (FMWV) nei Paesi Bassi.
1. Preparazioni gene....
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Risultati
Questo bioreattore è stato sviluppato per studiare gli effetti individuali e combinati dello stress da taglio e dell'allungamento ciclico sulla crescita e il rimodellamento del tessuto vascolare negli scaffold di biomateriale 3D. La progettazione del bioreattore consente di coltivare fino a otto costrutti vascolari in varie condizioni di carico (Figura 1A). I costrutti vascolari sono posizionati in una camera di coltura a flusso (Figura 1B) in cui sia l'allungam.......
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Discussione
Il bioreattore qui descritto consente la valutazione sistematica dei contributi degli effetti individuali e combinati dello sforzo di taglio e dell'allungamento ciclico sull'infiammazione e sulla rigenerazione dei tessuti negli scaffold tubulari riassorbibili. Questo approccio consente anche di eseguire una grande varietà di analisi su costrutti vascolari, come esemplificato nella sezione dei risultati rappresentativi. Questi risultati mostrano l'impatto distintivo dei diversi regimi di carico emodinamico (cioè diverse c.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è sostenuto finanziariamente da ZonMw come parte del programma LSH 2Treat (436001003) e dalla Dutch Kidney Foundation (14a2d507). N.A.K. riconosce il sostegno del Consiglio europeo della ricerca (851960). Riconosciamo con gratitudine il programma di gravitazione "Materials Driven Regeneration", finanziato dall'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (024.003.013).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| avanzato Dulbecco' s modificato EagleMedium (aDMEM) | Gibco | 12491-015 | per fibroblasti Aqua |
| Stabil | Julabo | 8940012 | prevenire la crescita di microrganismi nel serbatoio idraulico del bioreattore |
| Fibrinogeno bovino | Sigma | F8630 | per preparare il gel di fibrinogeno per seminare le cellule sull'impalcatura elettrofilata |
| Trombina bovina | Sigma | T4648 | per preparare il gel di fibrinogeno per seminare le cellule sull'impalcatura elettrofilata |
| Centrifuga | Eppendorf | 5804 | per centrifugare le cellule e il mezzo condizionato |
| Forbice a pinza - "pinza kelly" | Almedic | P-422 | blocca il tubo di silicone e applica il prestiro all'impalcatura in modo che l'impalcatura possa essere suturata nella scanalatura incisa (autoclave al passaggio 1, passaggio 7) |
| Incubatori per colture cellulari CO2 | Sanyo | MCO-170AIC-PE | per la coltura cellulare |
| Serbatoio di aria compressa | Festo | CRVZS-5 | attenua le fluttuazioni della pressione dell'aria e crea ritardi temporali per l'accumulo di pressione |
| Script Matlab personalizzato per calcolare gli allungamenti massimi | Matlab | R2017. The Mathworks, Natick, MA | calcolano il diametro esterno minimo e massimo dell'impalcatura elettrofilata Scheda di |
| acquisizione dati | National Instruments | BNC-2090 | elaborazione dei dati tra il sistema di amplificazione e il computer |
| Etanolo | VWR | VWRK4096-9005 | per mantenere sterili le condizioni di lavoro |
| Siero fetale di vitello bovino (FBS) | Greiner | 758087 | integratore di terreno per colture cellulari; |
| scomparti della camera di coltura del flusso, costituiti da un condotto di pressione con scanalature incise e piccoli fori per applicare pressione sul tubo in silicone, una filettatura a vite, cono del naso, scomparto superiore con ingresso del flusso e uscita del flusso del compartimento inferiore, boccola dell'adattatore Su | misura, Dipartimento di Ingegneria Biomedica, Eindhoven University of Technology | n.a.compartimenti | della camera di coltura del flusso (autoclave al passaggio 1, passaggio 7) |
| Assistente pipetta Pasteur in vetro | HE40567002 | applicare il vuoto su impalcatura elettrofilata (autoclave al passaggio 1) | |
| Tubi di vetro della camera di coltura a flusso | Custon realizzato, Attrezzature & Prototype Center, Eindhoven University of Technology | n.a.parte | della camera di coltura a flusso (pulire e conservare in etanolo al 70%, al passaggio 1 e 7) |
| GlutaMax | Gibco | 35050061 | integratore di aminoacidi per colture cellulari medie, riduce al minimo l'accumulo di ammoniaca |
| Telecamera ad alta velocità | MotionScope | M-5 | monitorare l'allungamento durante la coltura; le fotografie time-lapse degli scaffold vengono catturate a una frequenza di 30 Hz per 6 secondi (cioè 3 cicli di allungamento) |
| Obiettivo della fotocamera ad alta velocità - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - obiettivo | Nikon | JAA616AB | per monitorare l'allungamento durante la coltura; le fotografie time-lapse degli scaffold vengono catturate a una frequenza di 30 Hz per 6 secondi (cioè 3 cicli di allungamento) |
| Clip per tubo | ibidi GmbH | 10821 | blocco flusso medio (autoclave al passaggio 1, passaggio 7) |
| Serbatoio idraulico con 8 filettature per 8 camere di coltura a flusso | Realizzato su misura, Dipartimento di Ingegneria Biomedica, Università di Tecnologia di Eindhoven | n.a. | per applicare pressione ai costrutti montati in silicone (pulire l'esterno con un fazzoletto di carta con etanolo al 70%, risciacquare il serbatoio con etanolo al 70% seguito da acqua demi, al passaggio 1 e 7) |
| Sistema di pompaggio Ibidi (8x) con pompa ibidi, software PumpControl, unità fluidica, set di perfusione (tubo medio), tubo di pressione dell'aria, bottiglie di essiccazione con perle di silice arancioni | ibidi GmbH | 10902 | impostato per controllare il flusso nelle camere di coltura a flusso. Nota 1: le pompe ibidi sono state modificate dal produttore per consentire una capacità di 200 mbar. Nota 2: può essere sostituito da un sistema di pompaggio di altro produttore, purché possano essere applicati gli stessi regimi di flusso. |
| Coltelli (n.10 lame sterili, confezione singola in alluminio) e manico per bisturi (acciaio inossidabile, confezionato singolarmente) | Swann Morton | 0301; 0933 | per tagliare il tubo in silicone nella misura corretta per lo scaffold e per tagliare il materiale di sutura |
| LabVIEW Software National | Instruments | versione 2018 | per controllare l'allungamento applicato agli scaffold Cabina |
| biosicurezza a flusso laminare con luce UV | Labconco | 302310001 | per garantire condizioni di lavoro sterili. L'UV viene utilizzato per decontaminare tutto ciò che non può essere sterilizzato in autoclave o toccato dopo la sterilizzazione in autoclave |
| Piastre di Petri grandi e piccole | Greiner | 664-160 | per condizioni di lavoro sterili |
| Acido L-ascorbico 2-fosfato (vitamina C)Integratore | Sigma | A8960 | , importante per la produzione di collagene |
| Sorgente di freddo a luce LED KL2500 | Zeiss | Schott AG | per facilitare la visualizzazione del lasso di tempo degli scaffold durante il monitoraggio del tratto |
| Luer (femmina e maschio) serrature e connettori, tappi luer bianchi | ibidi GmbH | vari, vedere (https://ibidi.com/26-flow-accessories) | per chiudere o collegare parti del bioreattore e della pompa ibidi (autoclave al passaggio 1, passaggio 7) |
| Amplificatore di misura (PICAS) | PEEKEL instruments B.V. | n.a.per | amplificare il segnale dal sensore di pressione e il feedback al serbatoio LabView |
| Medium (siringhe grandi 60 mL) e ai supporti del serbatoio | ibidi GmbH | 10974 | Medium reservoir (autoclave al passaggio 1, passaggio 7) |
| Tubo medio con diametro esterno di 4,25 mm e diametro interno di 1 mm | Gomma BV | 1805 | Per consentire una portata maggiore, viene utilizzato il tubo medio IBIDI con diametro maggiore. Nota: la parte del tubo medio guidata attraverso le valvole dell'unità fluidica è la stessa del tubo medio ibidi predefinito |
| Software Motion Studio | Idtvision | 2.15.00 | per realizzare le immagini time lapse ad alta velocità per il monitoraggio dell'allungamento |
| Ago (19G) | BD Microlance | 301700 | insieme al sottile tubo flessibile utilizzato per riempire il serbatoio idraulico con acqua ultrapura senza aggiungere bolle d'aria Cacciavite |
| dell'agoAdson | 2429218 | di maneggiare l'ago della sutura di nylon attraverso il tubo di silicone (autoclave al passaggio 1, passaggio 7) | |
| Fazzoletti di carta | Kleenex | 38044001 | per la pulizia dell'apparecchiatura con Parafilm al 70% di etanolo |
| Sigma | P7793-1EA | soluzione rapida in caso di perdita | |
| Penicillina/streptomicina (P/S) | Lonza | DE17-602E | integratore di terreno di coltura cellulare; prevenire i batteri contaminazione |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Sigma | P4417-100TAB | per le fasi di stoccaggio e lavaggio (autoclave al passaggio 1) |
| Contenitori in plastica (60 mL) con tappi a vite rossi Greiner | 206202 | per preparare la soluzione di fibrinogeno | |
| Cilindro pneumatico | Festo | AEVC-20-10-I-P | per azionare il soffietto in teflon (pulire con un fazzoletto di carta con etanolo al 70% ai passaggi 1 e 7) |
| Scaffold tubolari in policaprolattone bisurea (PCL-BU) (diametro interno 3 mm, 200 & micro; m spessore della parete, lunghezza 20 mm) | SyMO-Chem, Eindhoven, Paesi Bassi | n.a. | prodotto mediante elettrofilatura da soluzioni polimeriche di cloroformio (Sigma; 372978) al 15% (p/p). Per maggiori dettagli, vedere Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) Condotto |
| pressione senza fori (per il controllo statico) | Su misura, Dipartimento di Ingegneria Biomedica, Eindhoven University of Technology | n.a.per | montare tubi elettrofilati su tubi in silicone (autoclave al passaggio 1, passaggio 7) |
| Sensore di pressione e trasduttore | BD | TC-XX e P 10 EZ | la pressione dell'aria che va alla pompa ad azionamento pneumatico viene aumentata fino a raggiungere la pressione impostata |
| Valvola proporzionale di controllo della pressione dell'aria e sensore di pressione | Festo | MPPES-3-1/8-2-010, 159596 | fornisce aria compressa alla pompa ad azionamento pneumatico |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) | Gibco | A1049101 | per monociti/macrofagi |
| Blocco sicuro Provette Eppendorf (1,5 mL) | Eppendorf | 30120086 | molteplici applicazioni (autoclave al passaggio 1) |
| Soluzione di sodio dodecil solfato 20% | Sigma | 5030 | Utilizzato per pulire i materiali, a una concentrazione dello 0,1%. |
| O-ring in silicone | Technirub | 1250S | per evitare perdite (autoclave al passaggio 1, passaggio 7) |
| Tubo in silicone (diametro esterno 2,8 mm, spessore della parete 400 um) | Gomma BV | 1805 | per montare i tubi elettrofilati sui condotti a pressione (autoclave al passaggio 1) |
| Tubo sterile (15 mL) | Falcon | 352095 | molteplici applicazioni |
| Sutura, 5-0 prolene con ago | a punta conica premontatoEthicon, Johnson& Johnson | EH7404H | Filo di sutura in prolene 5-0 (lunghezza 75 cm, ago con punta conica TF, 1/2 cerchio, lunghezza ago 13 mm) |
| Siringa (24 mL) | B. Braun Melsungen AG | 2057932 | aggiungere l'acqua ultrapura o il terreno al serbatoio idraulico o alla camera di coltura a flusso |
| Filtro per siringa (0,2 & micro; m) | Satorius | 17597-K | per filtrare la soluzione di fibrinogeno |
| T150 pallone per colture cellulari con tappo filtrante | Nunc | 178983 | per degassare il terreno di coltura |
| T75 Pallone per colture cellulari con tappo filtrante | Nunc | 156499 | per la coltura di campioni di controllo statico |
| in teflon | misura, Dipartimento di Ingegneria Biomedica, Eindhoven University of Technology | n.a. | per caricare il serbatoio idraulico (pulire l'esterno con un fazzoletto di carta con etanolo al 70% nelle fasi 1 e 7) |
| Vassoio (acciaio inossidabile)PolarWare | 15-248 | per un facile trasporto delle camere di coltura fluidica e del bioreattore dall'incubatore alla camera a flusso laminare e viceversa (pulire con un fazzoletto di carta con etanolo al 70% prima e dopo l'uso) | |
| Pinzette | Wironit | 4910 | manipolazione sterile di singole parti (autoclave alle fasi 1 e 7) |
| Acqua ultrapura | Stakpure | Omniapure UV 18200002 | per correggere l'evaporazione media, miscelata con aqua stabil miscelata e utilizzata come fluido idraulico. (autoclave acqua ultrapura al passaggio 1) |
| Luce UV | Philips | TUV 30W/G30 T8 | per la decontaminazione di innesti e parti del bioreattore prima della semina |
Riferimenti
- Chlupác, J., Filová, E., Bacáková, L. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiological Research. 58, Suppl 2 119-139 (2009).
- Huygens, S. A., et al.
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Ristampe e permessi
